癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中Gal—1表達(dá)通過(guò)integrin β1促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制研究

倪海濱　孫元水　王峰勇　徐繼　何徐軍　陳劍　吳頎　吳勁風(fēng)

[摘要] 目的 研究癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中Gal-1表達(dá)通過(guò)integrin β1促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制。 方法 高表達(dá)Gal-1的胃癌CAFs采用原代培養(yǎng)法，通過(guò)CAFs與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)、siRNA轉(zhuǎn)染、抑制Gal-1/封閉integrin β1表達(dá)、細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)、侵襲能力影響實(shí)驗(yàn)和IHC實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，研究胃癌細(xì)胞侵襲遷移能力受胃癌CAFs中Gal-1表達(dá)的影響程度及作用機(jī)制。分析高表達(dá)Gal-1 的CAFs對(duì)癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響，比較Gal-1和integrin β1免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)果 CAFs共培養(yǎng)使得胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力得到明顯提升，Gal-1的表達(dá)遭到siRNA抑制后，CAFs對(duì)遷移能力和侵襲能力的促進(jìn)作用得到有效抑制。Gal-1主要在胃癌細(xì)胞的間質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)，integrin β1主要在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)。Gal-1和integrin β1在胃癌中的陽(yáng)性率分別為56.67%（51/90）、43.33%（39/90），并且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 CAFs表達(dá)Gal-1并通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞integrin β1表達(dá)的形式提高胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，指明今后胃癌的治療和相關(guān)預(yù)后的研究方向，表現(xiàn)出一定的理論研究?jī)r(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 癌相關(guān)成纖維細(xì)胞；Gal-1；integrin β1；胃癌；侵襲

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）34-0001-03

Study on the mechanism of expression of Gal-1 in cancer-related fibroblasts promoting the invasion of gastric cancer cells via integrin β1

NI Haibin1 SUN Yuanshui1 WANG Fengyong1 XU Ji2 HE Xujun2 CHEN Jian1 WU Qi1 WU Jinfeng1

1.Department of Gastrointestinal Surgery， Tongde Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310012， China； 2.Department of Gastrointestinal Surgery， Zhejiang People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of expression of Gal-1 in cancer-related fibroblasts promoting the invasion of gastric cancer cells via integrin β1. Methods Gastric cancer CAFs with highly expressed Gal-1 were primarily cultured， co-cultured with gastric cancer cells， transfected with siRNA， inhibited Gal-1 expression/blocked integrin β1 expression， given cell invasiveness test， given invasiveness test and IHC experiment technology. The effect and mechanism of gastric cancer cell invasion and migration on the expression of Gal-1 in gastric cancer CAFs were studied. The effect of CAFs with highly expressed Gal-1 on the migration and invasiveness of cancer cells was analyzed， and the results of Gal-1 and integrin β1 immunohistochemistry were compared. Results The co-culture of CAFs was able to enhance the invasion and migration of gastric cancer cells significantly. Gal-1 expression was inhibited by siRNA， and the promoting effects of CAFs on migration and invasion ability was effectively inhibited. Gal-1 was mainly expressed in interstitial fibroblasts of gastric cancer cells， and integrin β1 was mainly expressed in the cell membrane of gastric cancer cells. The positive rates of Gal-1 and integrin β1 in gastric carcinoma were 56.67%（51/90） and 43.33%（39/90） respectively， and the differences between its expression and lymph node metastasis， distant metastasis and TNM staging were statistically significant（P<0.05）. Conclusion CAFs express Gal-1 and enhance the invasion and migration of gastric cancer cells by promoting the expression of integrin β1 in gastric cancer cells. The study indicates the future direction of treatment and prognosis of gastric cancer， showing a certain theoretical research value.

[Key words] Cancer-related fibroblasts； Gal-1； Intergrin β1； Gastric cancer； Invasion

據(jù)相關(guān)部門統(tǒng)計(jì)顯示[1-3]，胃癌在世界腫瘤中占據(jù)較大比例，特別是在中國(guó)，死亡率最高的腫瘤當(dāng)屬胃癌。近年來(lái)出現(xiàn)了各種各樣的胃癌治療手段，其中主要手段還是手術(shù)治療。臨床研究結(jié)果顯示[4-6]，外科手術(shù)切除胃癌的水平取得顯著進(jìn)展，并且對(duì)胃癌的治療療效顯著。但統(tǒng)計(jì)調(diào)查結(jié)果證實(shí)，通過(guò)手術(shù)切除、放療、化療等綜合手段治療的患者，5年生存率極低，甚至不到50%。究其原因主要在于患者就診時(shí)大多數(shù)已處于Ⅲ或Ⅳ期及腫瘤復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素。研究專家統(tǒng)一認(rèn)為，深入了解胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制迫在眉睫。本研究針對(duì)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma associated fibroblasts，CAFs）中Gal-1表達(dá)通過(guò)integrin β1促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制展開研究。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2009年1月～2012年3月我院胃腸外科接診的90例胃癌患者石蠟切片，術(shù)后隨訪2年。所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，術(shù)前未經(jīng)過(guò)任何放化療。本研究患者知情并同意，且經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 切取所選患者胃癌侵襲邊緣組織，儲(chǔ)存于標(biāo)本消毒液中，于低溫下保存。并在消毒液中對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行初步處理，去除黏液及周圍非癌組織黏膜。并將標(biāo)本分為兩份，一份制作成蠟塊標(biāo)本，另一份繼續(xù)進(jìn)行原代培養(yǎng)。采用酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)，從消毒液中取出的組織塊應(yīng)用PBS（pH=7.4）洗滌，去除殘留消毒液成分。將組織剪成1mm2碎塊置于標(biāo)本消化液中，后移至容量為50 mL的無(wú)菌管中，加入一定的消化液至15 mL，于恒溫?fù)u床中反應(yīng)2 h（37℃，120 r/min）。后用離心機(jī)離心，取上清液。

1.2.2 CAFs與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng) Trans-well模型，上室加入1×105個(gè)胃癌細(xì)胞（7901、AGS和823），下室加入2×105個(gè)CAFs和預(yù)先轉(zhuǎn)染Gal-1 siRNA的CAFs。37℃恒溫下培養(yǎng)48 h后收集共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染 使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Gal-1 siRNA-1、Gal-1 siRNA-2、integrin β1 siRNA-1、integrin β1 siRNA-2，后與轉(zhuǎn)染劑混合，室溫孵育20 min。

1.2.4 抑制Gal-1/封閉integrin β1表達(dá) 6孔板鋪2×105個(gè)CAFs細(xì)胞/胃癌細(xì)胞，培養(yǎng)條件溫度37℃，時(shí)間24 h，待上清液棄去后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基（2 mL），每孔中滴入混合物（Gal-1 siRNA/integrin β1 siRNA與轉(zhuǎn)染劑），待繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.2.5 高表達(dá)Gal-1的CAFs對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力和侵襲能力實(shí)驗(yàn) （1）細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)：所用Trans-well模型。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAFs，預(yù)先轉(zhuǎn)染Gal-1 siRNA的CAFs及7901、AGS和823胃癌細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至合適值，其中上室鋪含1×105個(gè)胃癌細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，下室鋪含2×105的CAFs和CAFs FBS培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后將上下室取下，用乙醇預(yù)冷固定后，擦拭上室未穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞，后進(jìn)行HE染色。置于顯微鏡下觀察，分析胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力改變情況。（2）細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)：其他步驟同上述遷移能力實(shí)驗(yàn)。不同之處為培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

1.2.6 Gal-1誘導(dǎo)的侵襲和遷移能力受胃癌細(xì)胞封閉integrin β1的作用影響實(shí)驗(yàn) （1）侵襲能力影響實(shí)驗(yàn)：用無(wú)血清培養(yǎng)基提前調(diào)整好預(yù)先轉(zhuǎn)染Gal-1 siRNA的胃癌細(xì)胞（7901、AGS和823）濃度后，加入到Trans-well模型上室，30% FBS（含有CAFs）培養(yǎng)基加入下室。（2）遷移能力影響實(shí)驗(yàn)：同上。

1.2.7 IHC實(shí)驗(yàn) 90例胃癌患者的石蠟切片65℃烘烤2 h，用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫二甲苯。后用0.01 mol/L的枸緣酸鹽修復(fù)液高壓修改3 min。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的雙氧水室溫下孵育20 min使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活。用常規(guī)羊血清室溫封閉20 min后，滴加anti-integrin β1和anti-Gal-1，并置于4℃恒溫箱中過(guò)夜。用PBS洗滌三次后滴加二抗，并置于室溫下靜置20 min，再用PBS洗滌三次，最后進(jìn)行顯色、復(fù)染、脫水、封片等操作。后進(jìn)行掃描儀掃描，留存。

1.3觀察指標(biāo)

Gal-1和integrin β1免疫組化實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[7-10]：陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分，其中0分無(wú)表達(dá)，1～3分可以表達(dá)，4～6分弱表達(dá)，7～12分強(qiáng)表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分：按照所占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)評(píng)分，0分≤5%，6%<1分≤25%，26%<2分≤50%，51%<3分≤75%，76%<4分≤100%。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分無(wú)色，1分淡黃色，2分棕黃色，3分棕褐色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選擇SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon兩樣本比較法），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高表達(dá)Gal-1 的CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響

胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力在CAFs共培養(yǎng)后顯著增強(qiáng)，Gal-1的表達(dá)受到siRNA抑制后，CAFs對(duì)遷移能力和侵襲能力的促進(jìn)作用得到有效抑制，見封三圖1。

2.2 Gal-1和integrin β1免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如封三圖2所示Gal-1和integrin β1染色結(jié)果，Gal-1主要在胃癌細(xì)胞的間質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)，integrin β1主要在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)。90例患者臨床資料、Gal-1和integrin β1與病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系見表1。Gal-1和integrin β1在胃癌中的陽(yáng)性率分別為56.67%（51/90）和43.33%（39/90），并且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

臨床研究表明，Gal-1作為一種特殊的分泌性蛋白，在CAFs中存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，該現(xiàn)象關(guān)系到多種癌癥的進(jìn)展和預(yù)后。研究表明，該分泌性蛋白在胃癌中的過(guò)表達(dá)機(jī)制目前仍不明確。腫瘤中integrin β1顯示出強(qiáng)大的生物學(xué)功能，對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲具有一定的促進(jìn)作用等，在其表達(dá)水平降低時(shí)，細(xì)胞侵襲遷移能力受到抑制。另有實(shí)體瘤研究報(bào)道[11-14]，integrin β1高表達(dá)會(huì)使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。一系列的腫瘤研究結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境在一定程度上影響其進(jìn)展。成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的間質(zhì)細(xì)胞類型，組織完整性得以構(gòu)建。細(xì)胞正常狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞在特殊情況下能發(fā)揮組織修復(fù)功能，而在腫瘤細(xì)胞中，成纖維細(xì)胞發(fā)生分化為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞在微環(huán)境各種成分的相互作用下，轉(zhuǎn)移和進(jìn)展速度增大，甚至腫瘤細(xì)胞的耐藥性和抵抗治療能力均會(huì)受到腫瘤細(xì)胞微環(huán)境各種組分的影響，嚴(yán)重情況下顯著影響患者腫瘤治療預(yù)防工作的順利進(jìn)行。曾有文獻(xiàn)報(bào)道[15-17]，這些細(xì)胞分泌多種通過(guò)不同機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的蛋白。深入研究該種促進(jìn)機(jī)制，能為腫瘤的治療提供研究方向，改善患者預(yù)后工作，具有重要的臨床研究?jī)r(jià)值。另外CAFs促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制多種多樣，因此研究分子機(jī)制對(duì)于提高患者預(yù)后及對(duì)腫瘤工作的進(jìn)展意義重大。

本研究結(jié)果顯示，Gal-1促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制與其能促進(jìn)胃癌表面integrin β1表達(dá)有關(guān)。利用integrin β1siRNA提前封閉胃癌細(xì)胞中integrin β1的表達(dá)，當(dāng)其表達(dá)受到阻斷后，明顯限制Gal-1的促胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用。免疫組化結(jié)果也表明，患者Gal-1和integrin β1的表達(dá)相關(guān)。經(jīng)CAFs共培養(yǎng)后胃癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力顯著增強(qiáng)，利用siRNA抑制Gal-1的表達(dá)后，CAFs促進(jìn)遷移和侵襲能力的效果得到抑制，與相關(guān)報(bào)道相一致[18-22]。Gal-1主要在胃癌細(xì)胞的間質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)，integrin β1主要在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)。Gal-1和integrin β1在胃癌中的陽(yáng)性率分別為56.67%（51/90）和43.33%（39/90），并且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期有較大關(guān)系。

綜上所述，CAFs表達(dá)Gal-1并通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞integrin β1表達(dá)的形式提高胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，指明今后胃癌的治療和相關(guān)預(yù)后的研究方向，表現(xiàn)出一定的理論研究?jī)r(jià)值。

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（收稿日期：2016-09-15）