南極磷蝦中產(chǎn)抗菌活性物質菌株的篩選及系統(tǒng)發(fā)育分析

袁蘭云,王亞璐,寧喜斌,*,劉志東

(1.上海海洋大學食品學院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090)

南極磷蝦中產(chǎn)抗菌活性物質菌株的篩選及系統(tǒng)發(fā)育分析

袁蘭云1,王亞璐1,寧喜斌1,*,劉志東2

(1.上海海洋大學食品學院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090)

分別以金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 27661(Sa 27661)和大腸桿菌EscherichiacoliATCC 35218(Ec 35218)為指示菌,以南極磷蝦中分離出的59株菌為測試菌,利用牛津杯法進行抗菌活性菌株的初篩及復篩,同時用比濁測定法和牛津杯法對活性菌株的部分特性包括生長曲線、抗菌曲線、最佳溫度、最佳pH、最佳鹽度進行了測定,以Mega 5鄰接法對其16S r RNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育地位進行探究。結果發(fā)現(xiàn),初篩獲得13株菌對Sa 27661具有抗菌活性,6株菌對Ec 35218具有抗菌活性。復篩得到對Sa 27661和Ec 35218均具有明顯抗菌活性的菌株3株,陽性率為5.08%,其編號分別為1A3、A4、1A5。且3株菌分別培養(yǎng)16、20、28 h進入生長對數(shù)期,培養(yǎng)36、48、60 h達到穩(wěn)定期。分別培養(yǎng)56、64、72 h時抗菌活性達到最高,之后基本達到穩(wěn)定。最佳溫度分別為15、20、20 ℃,最佳pH分別為7、6、6,最佳鹽度分別為1%、3%、2%。系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明,菌株A4、1A5,均屬于嗜冷桿菌屬Psychrobacter,菌株1A5與已注冊的菌株(Psychrobactersp. OK1)基因序列相似性可達100%。而菌株1A3與不可培養(yǎng)嗜冷桿菌屬(UnculturedPsychrobacter)同源性為97%。三株菌均具有較好的耐酸性、耐堿性和耐鹽性的能力,同時具有較好的抗菌活性。

南極磷蝦,嗜冷桿菌屬,抗菌活性,系統(tǒng)發(fā)育分析

極地微生物主要存在于極端的低溫、高鹽度及干燥的環(huán)境中,正是由于這樣特殊的環(huán)境使其具有特殊的生物學特征及競爭優(yōu)勢[1-3]。為了適應特殊的環(huán)境條件,也必然具有其特殊的生理特點和適應機制,如嗜冷、耐冷特性、耐堿性、耐鹽性及產(chǎn)活性物質等[2-6]。這些特性也使其有望成為開發(fā)新型活性物質的重要潛在來源之一[5]。與極地微生物相關的活性代謝產(chǎn)物方面的研發(fā),在國際上已成為微生物學領域研究的熱點之一[3-10]。從相關文獻及報道可以發(fā)現(xiàn),各國科學家們已從不同的樣品(如南極海水、海冰、海洋沉積物等)中分離到了具有抗菌能力的細菌[3,5-6,12,22]。Giudice等從南極海水、海冰、海洋沉積物等樣品分離的580株細菌中,以大腸桿菌(Escherichiacoli)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)等為指示菌,共篩選出22株抗菌活性菌株,陽性率為3.8%[3,12]。李賀等從實驗室保存的分離自南極的580株細菌中篩出4株抗菌活性菌株,陽性率為0.7%[3,5]。

南極磷蝦,具有較高的科學價值及廣泛的效用[13-18],也越來越受到人們的重視,對其研究也逐年增多,多集中于南極磷蝦的脫氟工藝、南極磷蝦粉及油的開發(fā)利用、蝦青素的研究,但對其體內產(chǎn)抗菌活性物質菌株的研究未有太多報道,大多研究的產(chǎn)抗菌活性物質的極地微生物也多是從海泥、海冰中分離,而本實驗室取部分南極磷蝦蝦磚,對其進行自然解凍,從南極磷蝦蝦肉中分離出了59株細菌,并以之為研究對象,對其進行了抗菌活性菌株的篩選,同時對活性菌株的部分特性,包括生長曲線、抗菌曲線、生長的最佳溫度、耐堿性、耐鹽性等進行研究,并對這些菌株構建了基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。以期從南極磷蝦樣品中分離到具有抗菌能力的菌株,并對菌株進行初步研究以了解其特性,使其有望成為新型活性物質的重要潛在來源之一,并有望應用到新型的食品生物防腐保鮮劑的開發(fā)中,從而為更好地研究南極磷蝦及其體內的活性菌株打下良好的基礎,對于深度利用開發(fā)南極磷蝦資源具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 在南極打撈出迅速以原位海水冷凍,由雪龍?zhí)栠\回,實驗中所用南極磷蝦蝦磚取自東海水產(chǎn)研究所;59株測試菌 由本實驗室分離自南極磷蝦蝦肉并純化保存;金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 27661,Sa 27661)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 35218,Ec 35218)為指示菌 由本實驗室保藏;2216E固體培養(yǎng)基、2216E液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司并按要求進行配制;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

振蕩培養(yǎng)箱ZQWY-200、水浴振蕩培養(yǎng)箱ZHSY-50FT 上海知楚儀器有限公司;PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTMXR+System) 美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌活性物質產(chǎn)生菌的初篩 用無菌接種環(huán)分別取少量保存于斜面的59株分離自南極磷蝦的測試菌,并接種于裝有5 mL 2216E液體培養(yǎng)基的試管(15 mm×150 mm)中,于振蕩培養(yǎng)箱ZQWY-200(15 ℃,120 r/min)中培養(yǎng)2 d,取1.5 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中,在10000 r/min下離心10 min,留上清液測抗菌活性用。

以牛津杯法篩選抗菌活性菌株,將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂冷至約55 ℃,搖勻倒入已滅菌的培養(yǎng)皿(D=90 mm)中,每皿大約30 mL培養(yǎng)基,凝固后倒置于無菌操作臺過夜。將過夜培養(yǎng)的指示菌Sa 27661和Ec 35218各取100 μL滴加在營養(yǎng)瓊脂平板上,涂布使菌液均勻分布于培養(yǎng)基表面,正置約30 min使指示菌吸收徹底。用鑷子將無菌牛津杯均勻放于培養(yǎng)基上,使牛津杯與培養(yǎng)基間無縫隙,每皿放置6～8個牛津杯。取上述發(fā)酵上清液加入牛津杯內,液面約與牛津杯平齊,靜置1 h,然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,觀察牛津杯周圍是否形成抑制圈[3,9,23]。

1.2.2 牛津杯加液量的測試 以初篩抗菌效果較好的菌株為測試對象(指示菌操作如1.2.1),分別取其50、100、150、200 μL的發(fā)酵上清液加入牛津杯中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,觀察不同加液量牛津杯周圍抑制圈大小,并確定最佳加液量。

1.2.3 抗菌活性物質產(chǎn)生菌的復篩 活性菌株的培養(yǎng)及上清液的制備同1.2.1中初篩操作,以1.2.2中確定的最佳加液量將上清液加入牛津杯,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,測量各抑制圈直徑,3次重復,計算平均值。同時比較抗菌活性菌株分別對指示菌Sa 27661和Ec 35218的抑菌效果,確定抗菌活性菌株抑制效果最好的指示菌。

1.2.4 抗菌活性菌株的部分特性研究

1.2.4.1 種子液的制備 分別挑取少量抗菌活性菌株接種于5 mL 2216E液體培養(yǎng)基中,于低溫搖床15 ℃,140 r/min培養(yǎng)30 h,即種子液。

1.2.4.2 抗菌活性菌株的生長曲線及抗菌曲線 將活性菌株種子液以3%的比例,接種于100 mL 2216E液體培養(yǎng)基中(250 mL的三角瓶),于振蕩培養(yǎng)箱ZQWY-200(15 ℃,120 r/min)中培養(yǎng),從第12 h開始,每4 h于無菌操作臺定時取樣。測定其在600 nm下的OD值,繪出生長曲線[3-6]。同時每4 h于無菌操作臺定時取1.5 mL發(fā)酵液,在10000 r/min下離心10 min,留上清液,以1.2.3中確定的抗菌活性菌株抑制效果最好的菌為指示菌。按照1.2.3中牛津杯法操作,測定抗菌活性菌株的抑菌圈直徑,繪出抗菌曲線[3,5-6]。

1.2.4.3 溫度對抗菌活性菌株生長的影響 分別取100 μL種子液,接種于5 mL2216E液體培養(yǎng)基中,分別于4、10、15、20、25、28、30、37 ℃搖床培養(yǎng)48 h。測定其在600 nm下的OD值,繪出溫度對抗菌活性菌株生長的影響[3-6]。

1.2.4.4 pH對抗菌活性菌株生長的影響 配制2216E液體培養(yǎng)基,并調節(jié)其pH,分別為4、5、6、7、8、9、10,分裝試管。分別取100 μL種子液,接種于不同pH的5 mL 2216E液體培養(yǎng)基中,于15 ℃,120 r/min培養(yǎng)48 h。測定其在600 nm下的OD值,繪出pH對抗菌活性菌株生長的影響[3-6]。

1.2.4.5 鹽度對抗菌活性菌株生長的影響 配制改良2216E液體培養(yǎng)基,調節(jié)其鹽度值,分別為0、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,分別取100 μL種子液,接種于不同鹽度的5 mL改良2216E液體培養(yǎng)基中,于15 ℃,120 r/min培養(yǎng)48 h。測定其在600 nm下的OD值,繪出鹽度對抗菌活性菌株生長的影響[3-6]。

1.2.5 抗菌活性菌株的菌體形態(tài)觀察及部分生理生化指標鑒定 將保存于斜面的抗菌活性菌株重新在2216E平板上劃線,15 ℃培養(yǎng)7 d觀察菌落形態(tài)并挑取少量菌進行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。同時參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對其進行部分生理生化鑒定,包括運動性、需氧性、檸檬酸鹽利用、接觸酶、V-P實驗、甲基紅實驗、淀粉水解、明膠水解、氧化酶實驗[29]。

1.2.6 抗菌活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析 將1.2.3中篩出的抗菌活性菌株,接種到2216E液體培養(yǎng)基中,并于15 ℃,120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)40 h。按照細菌DNA提取試劑盒中方法,提取活性菌株DNA[3,6,9]。

16S r RNA基因的PCR擴增引物采用通用引物:

27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

1492R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′

用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、引物1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)PCR擴增供試菌株16S rDNA近5′端的區(qū)域。25 μL反應體系:12.5 μL PCR Master Mix,1.0 μL模板DNA,上下游引物各1.0 μL,加ddH2O補充至25 μL。

PCR擴增條件:95 ℃,預變性5 min;94 ℃,變性1 min;55 ℃,退火1 min;72 ℃,延伸1.5 min;72 ℃,延伸10 min。按上述反應條件進行30個循環(huán),4 ℃,保存[3,6,21]。取5 μL擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,電泳液為1×TAE,選取dl 2000 DNA Marker,凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶,并將其余所得的PCR產(chǎn)物送上海生工進行測序[3,6]。

2 結果與分析

2.1 抗菌活性菌株的篩選

2.1.1 抗Sa 27661、Ec 35218的活性菌株的篩選 對本實驗室保存的59株測試菌,進行抗菌活性菌株的初篩,獲得對Sa 27661具有抗菌活性的菌株13株,陽性率為22.03%,對Ec 35218具有抗菌活性的菌株6株,陽性率為10.17%。

2.1.2 牛津杯加液量的測試 牛津杯加液量的測試如圖1(以初篩抗菌效果較好的菌株1A3為測試對象)所示。從圖1可以看出,加液量為50～150 μL時,隨著加液量的增加,抑菌圈直徑明顯增加,但加液量為200 μL時抑菌圈直徑比加液量為150 μL時更明顯些,所以確定最佳加液量為200 μL,復篩加液量均為200 μL。

圖1 牛津杯加液量的測試Fig.1 Liquid volume test of Oxford cup

2.1.3 抗Sa 27661和Ec 35218的活性菌株的篩選 以200 μL加液量對這些菌株進行復篩,發(fā)現(xiàn)有3株對Sa 27661和Ec 35218均具有抗菌活性,其編號分別為1A3、A4、1A5,抗菌活性菌株的陽性率為5.08%。而Giudice[12]等從南極海水、海冰、海洋沉積物以及海洋動物等樣品分離的580株細菌中篩選出22株抗菌活性菌株,陽性率為3.8%。相比于其他文獻報道[3-6,12],本研究篩選的抗菌活性菌株陽性率較高,說明南極磷蝦體內的活性菌株比較多,究其原因可能是由于南極磷蝦在生存過程中為抵抗惡劣環(huán)境以及其他不良因素,會在體內產(chǎn)生抗性菌株以抵抗外界不良因子從而維持自身的良好生長。菌株1A3、A4、1A5的抗菌圈直徑結果記錄如表1。

表1 抗菌活性菌株的抑菌圈直徑

從表1可以看出,從抗菌圈直徑來看,三株菌分別對Sa 27661和Ec 35218的抗菌效果沒有太大差別,可能因為活性菌株本身為革蘭氏陰性菌,所以總體對革蘭氏陽性菌Sa 27661的抗菌活性相較于革蘭氏陰性菌Ec 35218要好些。所以,后續(xù)實驗對活性菌株抗菌曲線的測定以Sa 27661為指示菌。

2.2 抗菌活性菌株的部分特性研究

2.2.1 抗菌活性菌株的生長曲線及抗菌曲線 以菌株1A3、A4、1A5的生長時間為橫坐標,以各時間點測定的OD600值為主縱坐標,以各時間點測定的抑菌圈直徑為次縱坐標,繪出菌株1A3、A4、1A5生長曲線及抗菌曲線的雙縱坐標圖。結果如圖2～圖4。

從圖2菌株1A3的生長曲線及抗菌曲線的雙縱坐標圖可以看出,菌株1A3在培養(yǎng)16 h進入生長對數(shù)期,36 h達到穩(wěn)定期,56 h菌體開始衰亡。而菌株培養(yǎng)20 h開始出現(xiàn)抗菌活性,抗菌活性隨著菌株進入對數(shù)期生長而增強,但菌株達到穩(wěn)定期后抗菌活性仍在增加,直到菌株56 h進入衰亡期,抗菌活性達到最高并基本保持穩(wěn)定,說明隨著菌株的快速生長,菌體開始產(chǎn)生抗菌活性物質,但隨著菌體衰亡自溶后,抗菌活性增加,隨后穩(wěn)定,即抗菌活性物質可能不僅存在于發(fā)酵上清液中,細胞內可能也含有抗菌活性物質。后期實驗會對細胞進行破壁處理并對照上清液的抗菌活性,以驗證細胞內是否也含有抗菌活性物質。

圖2 菌株1A3的生長曲線及抗菌曲線Fig.2 The growth curve and antibacterial curve of strain 1A3

從圖3菌株A4的生長曲線及抗菌曲線的雙縱坐標圖可以看出,菌株A4在培養(yǎng)20 h進入生長對數(shù)期,48 h達到穩(wěn)定期,64 h菌體開始衰亡。而菌株培養(yǎng)24 h開始出現(xiàn)抗菌活性,抗菌活性隨著菌株進入對數(shù)期生長而增強,但菌株達到穩(wěn)定期后抗菌活性也基本達到最強并保持穩(wěn)定,隨著菌株進入衰亡期,抗菌活性也依然保持穩(wěn)定趨勢,說明隨著菌株的快速生長,菌體開始產(chǎn)生抗菌活性物質,菌株生長達到穩(wěn)定期后,抗菌活性也基本穩(wěn)定,即抗菌活性物質可能只存在于發(fā)酵上清液中,隨著細胞自溶并未釋放出抗菌活性物質。后期實驗會對細胞進行破壁處理并對照上清液的抗菌活性,以驗證細胞內是否也含有抗菌活性物質。

圖3 菌株A4的生長曲線及抗菌曲線Fig.3 The growth curve and antibacterial curve of strain A4

從圖4菌株1A5的生長曲線及抗菌曲線的雙縱坐標圖可以看出,菌株1A5在培養(yǎng)28 h進入生長對數(shù)期,60 h達到穩(wěn)定期,72 h菌體開始衰亡。而菌株培養(yǎng)32 h開始出現(xiàn)抗菌活性,抗菌活性隨著菌株進入對數(shù)期生長而增強,但菌株達到穩(wěn)定期后抗菌活性也基本達到最強并保持穩(wěn)定,抗菌活性物質的產(chǎn)生于菌株的生長曲線保持大體相同的趨勢。即抗菌活性物質可能只存在于發(fā)酵上清液中,隨著細胞自溶并未釋放出抗菌活性物質。后期實驗會對細胞進行破壁處理并對照上清液的抗菌活性,以驗證細胞內是否也含有抗菌活性物質。

圖4 菌株1A5的生長曲線及抗菌曲線Fig.4 The growth curve and antibacterial curve of strain 1A5

2.2.2 溫度對抗菌活性菌株生長的影響 在不同的溫度條件下,測定抗菌活性菌株1A3、A4、1A5的生長狀況,結果如圖5。

圖5 活性菌株的最佳生長溫度Fig.5 The optimum temperature of the antibacterial strains

從圖5可以看出,活性菌株1A3、A4、1A5的最佳生長溫度分別為15、20、20 ℃。對于菌株A4、1A5來說,低于10 ℃及高于25 ℃時,菌株生長受到抑制。而菌株1A3的最佳生長溫度雖為15 ℃,但可耐受范圍較大,為5～30 ℃。

2.2.3 pH對抗菌活性菌株生長的影響 不同的pH下,活性菌株1A3、A4、1A5的生長狀況,如圖6。

圖6 活性菌株生長的最佳pHFig.6 The optimum pH of the antibacterial strains

從圖6可以看出,菌株1A3生長的最佳pH為7,但在5～10的pH范圍內均可生長,具有較好的耐酸性和耐堿性。相比于1A3來說,菌株A4生長的最佳pH為6,但pH低于6時,菌株生長受到抑制,在6～10范圍內均生長良好,說明菌株A4耐堿性較好。菌株1A5生長的最佳pH為6,但pH為5時也生長良好,與pH為6時沒有太大差別,可耐受的pH范圍為5～9,但耐酸性比耐堿性好。三株活性菌株均具有耐酸性和耐堿性的能力。

表2 抗菌活性菌株的生理生化鑒定結果

注：±:需氧及兼性厭氧;+:陽性;-:陰性。2.2.4 鹽度對抗菌活性菌株生長的影響 在不同的鹽度條件下,測定抗菌活性菌株1A3、A4、1A5的生長狀況,結果如圖7。

圖7 活性菌株生長的最佳鹽度Fig.7 The optimum salinity of the antibacterial strains

從圖7可以看出,菌株1A3生長的最佳鹽度為1%,可耐受的鹽度范圍為0～8%,即可在無鹽條件下生長,又可耐受高鹽度至8%。而菌株A4生長的最佳鹽度為3%,且可耐受鹽度范圍較窄,約為0～3.5%,鹽度大于3.5%時,菌株幾乎不生長,從曲線可以看出,在無鹽時,菌株生長,但鹽度為0.5%時菌株反而生長緩慢,之后隨著鹽度增加,生長趨勢變好,可能說明,出現(xiàn)鹽后,菌株A4的生長可能受到了鹽的誘導。菌株1A5生長的最佳鹽度為2%,可耐受的鹽度范圍為0.5%～4%,鹽度高于4%時,菌株幾乎不生長,無鹽時,菌株有輕微生長。

相比于菌株1A3來說,菌株A4、1A5生物量較低可能是因為培養(yǎng)溫度為15 ℃,為1A3生長的最佳溫度,而菌株A4、1A5生長的最佳溫度為20 ℃。

2.3 抗菌活性菌株的菌體形態(tài)觀察及部分生理生化指標鑒定

菌株1A3在2216E平板上單菌落為圓形,白色,光滑,不透明,邊緣整齊,微凸,革蘭氏染色陰性,短桿狀。菌株A4在2216E平板上單菌落為圓形,米白色,光滑,不透明,邊緣整齊,微凸,質地較軟,革蘭氏染色陰性,球桿狀。菌株1A5在2216E平板上單菌落為圓形,米白色,光滑,不透明,邊緣整齊,微凸,革蘭氏染色陰性,球桿狀。菌株1A3、A4、1A5的檸檬酸鹽利用、接觸酶均為陽性,V-P實驗、甲基紅實驗、淀粉水解、明膠水解、氧化酶、精氨酸雙水解酶、甘露醇利用均為陰性?；钚跃甑牟糠稚砩b定結果如表2。

2.4 抗菌活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

活性菌株1A3、A4、1A5的16S rRNA基因的PCR擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,電泳條帶如圖8所示,1.5 kb處條帶清晰。

圖8 活性菌株PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.8 PCR products electrophoretogram of active strains注：M為Marker(dl2000),1為菌株1A3, 2為菌株A4,3為菌株1A5,4為陽性對照。

將活性菌株的序列進行拼接,對于拼接后獲得的16S rRNA基因序列,進行BLAST比對分析。與活性菌株1A3、A4、1A5的16S rRNA基因序列同源性最高的菌株及其同源性如表3所示。

表3 活性菌株的16S r RNA基因序列同源性

從表3可見,本研究中分離的活性菌株,與Gen Bank庫中已有菌株相比,其16S rRNA基因序列相似性較高,均在97%及以上,并且菌株1A5與已注冊的菌株Psychrobactersp. OK1基因序列相似性可達100%。

圖9 三株抗菌活性菌株的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of the three antimicrobial bacteria based on partial 16S rRNA gene sequences注：在樹節(jié)上的數(shù)字代表1000取樣的百分比,僅顯示大于等于50%的情況。

對抗菌活性菌株1A3、A4、1A5及與其同源性較高的菌株的16S rRNA基因序列采用MEGA5進行序列比對并用鄰接法構建了3株活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,結果如圖9所示。

參考圖9并結合抗菌活性菌株的菌體形態(tài)觀察及部分生理生化指標鑒定結果,可以得出,篩選出的三株抗菌活性菌株,其中A4和1A5屬于嗜冷桿菌屬(Psychrobacter),并且菌株Psychrobacter1A5即為已注冊的菌株Psychrobactersp. OK1,而1A3與UnculturedPsychrobactersp. clone C5B01(與其同源性最高的菌株,不可培養(yǎng)嗜冷桿菌屬)只有97%的相似性,可能為新種,但需進一步研究。

李賀[3,5]從580株極地細菌中篩選到的四株抗性菌株有兩株為嗜冷桿菌屬,抗菌活性較好,抗菌譜較廣。而本研究從南極磷蝦中篩選出的兩株嗜冷桿菌屬及一株不可培養(yǎng)嗜冷桿菌屬,抗菌活性不如其他文獻中報道,究其原因可能為:培養(yǎng)條件的限制,極地微生物的生長條件特殊,簡單的實驗室條件無法完全滿足其生長,對其發(fā)酵產(chǎn)抗菌活性物質影響較大;對篩選出的菌株產(chǎn)抗菌活性物質抑菌圈的測定只是取發(fā)酵上清液,而在菌體細胞內可能也含有抗菌活性物質。后期實驗會對抗菌活性菌株產(chǎn)抗菌活性物質發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以尋找最佳的發(fā)酵條件,并對抗菌活性菌株進行破壁處理,探究其胞內是否含有抗菌活性物質。

3 結論

本研究以本實驗室從南極磷蝦蝦肉中分離出的59株細菌為研究對象,從中篩出三株對Sa 27661和Ec 35218均具有抗菌作用的菌株,其中A4、1A5均屬于嗜冷桿菌屬,而1A3與不可培養(yǎng)嗜冷桿菌屬較接近,可能為新種。由于活性菌株本身為革蘭氏陰性菌,所以對革蘭氏陽性菌的抗菌效果較革蘭氏陰性菌的效果更明顯。且三株活性菌株均具有較好的耐酸性、耐堿性和耐鹽性的能力,所以有望應用于飲料等食品工業(yè)以及洗手液等消毒產(chǎn)品中,后續(xù)可對其抗性機理進一步深入研究。

總之,南極磷蝦體內抗性菌株較多,其有望成為新型活性物質的重要潛在來源之一,并有望開發(fā)為新型的食品生物防腐劑,從而為更好地開發(fā)利用南極磷蝦及其體內的抗菌活性菌株打下了良好的基礎,對于深度利用開發(fā)南極磷蝦資源具有一定的意義。

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Screening and phylogenetic analysis of antibacterial strains isolated fromAntarcticKrill

YUAN Lan-yun1,WANG Ya-lu1,NING Xi-bin1,*,LIU Zhi-dong2

(1.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation,College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.East China Sea Fisheries Research Institute,Shanghai 200090,China)

StaphylococcusaureusATCC 27661 andEscherichiacoli35218 were used as indicator strains respectively. Screening of the antibacterial activity strains from the 59 strains isolated fromAntarcticKrillwas by the method of Oxford cup diffusion. The partial characteristics including growth curve,antibacterial curve,optimum temperature,optimum pH and optimum salinity of the antibacterial strains were also studied by the method of nephelometry and Oxford cup diffusion. And with the method of Mega 5 adjacency,the 16S rRNA gene sequence of the antibacteria strains were blasted and then the phylogenetic tree were constructed. The results showed that thirteen strains of Sa 27661 antibacteria activity and six strains of Ec 35218 antibacteria activity were screened in the preliminary screening. Also three antibacterial strains named as 1A3,A4,1A5 both of Sa 27661 and Ec 35218 antibacteria activities were screened in the dual-frequency screening. The positive rate was 5.08%. And they reach the logarithmic phase when they were cultured 16,20,28 hours and reach the stationary phase when they were cultured 36,48,60 hours respectively. They have the highest antibacterial activities when they were cultured 56,64,72 hours respectively. The optimum temperature of the antibacterial activity strains were 15 ℃,20 ℃,20 ℃,optimum pH values were 7,6,6 and optimum salinity were 1%,3%,2%respectively. Phylogenetic analysis indicated that strains of A4,1A5 belong to genera ofPsychrobacter. And the gene sequence similarity of strain 1A5 was up to 100% of the registeredPsychrobactersp. OK1(AB302184.1). But the homology of strain 1A3 was only 97% toUnculturedPsychrobacterwhich need further study. Three strains all have the ability of acid resistance,alkali resistance,salt tolerance,also the antibacteria activity which need further study.

Antarctickrill;Psychrobacter;antibacterial activity;phylogenetic analysis

2016-09-09

袁蘭云(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：15001956315@163.com。

*通訊作者:寧喜斌(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全，微生物學，E-mail：xbning@shou.edu.cn。

上海市科委工程中心建設(11DZ2280300)；上海海洋大學駱肇堯大學生科技創(chuàng)新基金(A1-0204-00-1015)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0179-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.025