王春幸,王鴻飛,熊 茜,宋佳敏,胡 月,董栓泉,孫 朦,王凱凱,許 鳳
(寧波大學食品科學與工程系,浙江寧波 315211)
果糖處理對費菜總黃酮及其相關酶的影響
王春幸,王鴻飛*,熊 茜,宋佳敏,胡 月,董栓泉,孫 朦,王凱凱,許 鳳
(寧波大學食品科學與工程系,浙江寧波 315211)
本文以費菜為研究對象,研究了不同水培溫度(20,25,28 ℃)、光周期(8 h/16 h,12 h/12 h,16 h/8 h)和果糖濃度(0、10、20、30、40 mmol/L)對費菜中總黃酮含量及其合成代謝相關酶活性的影響。結(jié)果表明:費菜最佳水培溫度為25 ℃,光周期為16 h/8 h;30 mmol/L果糖處理可以有效提高費菜中的總黃酮含量,比對照組高1.37 mg/g(鮮重);在培養(yǎng)期間,與對照組相比,果糖處理可以有效減緩苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL),多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO),查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)活性的下降,同時抑制過氧化物酶(peroxidase,POD)的活性,表明果糖處理通過調(diào)控總黃酮合成過程中相關酶的活性從而促進費菜總黃酮的富集。這些結(jié)果為提高費菜活性成分和營養(yǎng)品質(zhì)提供了理論依據(jù)。
費菜,水培條件,果糖處理,黃酮合成代謝相關酶
費菜(SedumaizoonL.),屬景天科多年生草本植物,學名景天三七,又名養(yǎng)心草,救心草。費菜中主要含有黃酮類、酚酸、萜類、甾醇等活性成分,具有擴張心腦血管、促進血液循環(huán)、抗腫瘤等多種功能特性[1-2],從而受到人們的青睞。黃酮是一類低分子量的多酚類次生代謝產(chǎn)物的統(tǒng)稱,在自然界中種類繁多,其中相當一部分具有顯著的生物活性,例如抗炎、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)血管滲透性、改善記憶和雌激素作用等[3]。外界環(huán)境可能作為一種外界信號會引起細胞膜上及細胞膜內(nèi)的一系列反應,使與植物代謝產(chǎn)物有關的酶合成或活性發(fā)生變化,從而影響植物次生代謝產(chǎn)物如黃酮等物質(zhì)的積累。如碳源可通過調(diào)控黃酮合成相關酶的活性而影響黃酮的合成,從而對植物次生代謝產(chǎn)物的種類和含量有重要影響,有研究表明,外源糖處理能顯著提高豆芽菜的總酚含量[4]。黃酮類化合物合成途徑關鍵酶有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、查爾酮合酶(CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)。研究證明,外源蔗糖處理可刺激羽扇豆中的苯丙烷類代謝,提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性和異黃酮含量[5],從而提高豆芽中總酚含量及其代謝酶活性[6]。
近年來費菜的研究主要集中在活性成分的提取、種類以及其抗氧化能力的評價。如劉飛等人研究了費菜總黃酮的提取工藝和抑菌活性[7];費菜總黃酮經(jīng)研究表明具有明顯的抗氧化[8],降血脂抑制肝癌細胞增殖的功能[2]。但是對于費菜中黃酮的合成機理以及外源糖處理對費菜中總黃酮及其相關酶活性影響的研究較少。因此,本實驗采用不同溫度和光周期對費菜嫩枝進行水培,研究其總黃酮含量的變化,篩選出最佳溫度和光照條件;在此基礎之上,使用果糖溶液對費菜嫩枝進行水培,研究果糖對費菜中總黃酮含量和黃酮合成代謝相關酶活性的影響,為改善費菜的營養(yǎng)品質(zhì)提供理論依據(jù)。
1.1 材料與儀器
費菜品種為狹葉費菜(Sedumaizoonvar. latifolium),采收其嫩苗于江蘇省宿遷,栽種于寧波大學食品科學與工程實驗基地;所用試劑:無水乙醇、雙氧水、次氯酸鈉、硼酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、結(jié)晶三氯化鋁,磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 以上試劑均為國產(chǎn)分析純;蘆丁純度大于95% 北京索萊寶科技有限公司;外源糖:果糖 北京索萊寶科技有限公司;愈創(chuàng)木酚 上海圻明生物科技有限公司;苯丙氨酸 美國SIGMA公司。
GZP-450N型光照培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司;Cary 50 Scan紫外分光光度計 美國瓦里安技術(shù)中國有限公司;BPZ11D分析天平 德國賽多利斯公司;SB3200D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;H2050R湘儀臺式高速冷凍離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 費菜水培工藝條件的確定 采取從母株分蘗出的枝芽,選取長勢一致的費菜嫩枝,去掉基部枝葉,剪取12~15 cm,浸入75%乙醇溶液中消毒30 s,再用無菌蒸餾水洗滌5次,每次5 min,待用。
1.2.1.1 費菜水培溫度條件的確定 采用浸莖法將處理好的費菜枝條分別放入不同溫度(20、25、28 ℃)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,2000 lx光照12 h,黑暗12 h,每隔48 h換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分:0.02%NaClO溶液,30 mmol/L果糖溶液。
1.2.1.2 費菜水培光照時間條件的確定 將處理好的費菜枝條采用浸莖法放入(25±2) ℃光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),以2000 lx光照白/晝(8 h/16 h,12 h/12 h,16 h/8 h)培養(yǎng)10 d,每隔48 h換一次培養(yǎng)液。
1.2.2 費菜水培果糖濃度條件的確定 設置一系列濃度(0、10、20、30、40 mmol,含有0.02% NaClO)的果糖溶液加入培養(yǎng)液中,在(25±2) ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d(0 d為空白),2000 lx光照16 h,黑暗8 h,每隔48 h換一次培養(yǎng)液。
取培養(yǎng)0、2、4、6、8、10 d的處理組和對照組嫩枝,每組隨機取樣6株,液氮冷凍15 min,于-40 ℃冰箱保存用于總黃酮含量的測定,取其平均值。
1.2.3 費菜總黃酮的提取 采用乙醇超聲波輔助提取法提取費菜黃酮,稱取1 g費菜樣品于研缽中,用50 mL 90%乙醇冰浴研磨提取,勻漿,超聲波輔助,超聲時間50 min,超聲溫度為60 ℃,然后浸提2 h,浸提溫度60 ℃,進行離心抽濾,制得費菜總黃酮提取液冷藏備用。
1.2.4 費菜總黃酮含量及其相關酶的測定 費菜總黃酮含量的測定:蘆丁標準液的配制,精密稱取0.0244 g蘆丁(120 ℃干燥至恒重),置于100 mL容量瓶中,加入適量的30%乙醇,置水浴上微熱使之溶解,冷卻后用30%乙醇定容至刻度,搖勻。此時蘆丁的濃度為:0.244 mg/mL。
標準曲線的制備,精密量取蘆丁標準溶液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL于比色皿中,各加入AlCl3溶液,并加乙醇至刻度,在275 nm下測定黃酮的吸光度A,得到的回歸方程為:A=34.834x+0.0121,R2=0.9999。樣品測定按標準曲線項的方法測定吸光度,代入回歸方程計算含量[9]。
苯丙氨酸解氨酶PAL的測定:參照張大勇的方法[10],在290 nm下測定OD值,以每分鐘吸光值變化0.01為1個PAL活性單位,用U/g FW表示。
CHS測定:參照NAM的方法[11]進行樣品的提取,采用查爾酮合酶試劑盒進行測試,在290 nm下測定OD值,以每分鐘吸光值變化0.01為1個CHS活性單位,用U/g FW表示。
CHI測定:CHI的提取在Lister等報道方法的基礎上有所改進[4]。精確稱取1 g樣品,冰浴研磨提取,加入1. 8 mL提取液,離心。取1 mL反應液水浴反應,加200 μL 350 g/L三氯乙酸終止反應,在370 nm測定OD值,以每分鐘吸光值變化0.01為1個CHI活性單位,用U/g FW表示。
PPO測定:參照Yang的方法[12],于398 nm處測定OD 值,以每分鐘吸光值變化0.01為1個PPO活性單位,用U/g FW表示。
POD測定:按照愈創(chuàng)木酚法[13],略有改動。稱取1 g樣品,用0.2 mol/L PBS(pH7.8)冰浴研磨提取,離心得上清即粗酶液,5 mL反應液(0.2 mol/L PBS pH7.8,內(nèi)含0.3%(v/v)愈創(chuàng)木酚,2% H2O2)加入100 μL酶提取液后迅速在470 nm下測定2min,以每分鐘吸光值變化0.01為1個POD活性單位,以U/g FW表示。
1.3 數(shù)據(jù)分析
采用SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,用單因素方差分析(one-way ANOVA)中Dunken Text,比較不同處理組數(shù)據(jù)的差異,采用origin 8.0進行數(shù)據(jù)處理分析。如果未經(jīng)說明,實驗重復三次,取平均值。
2.1 費菜不同部位總黃酮含量的分析
本實驗所用費菜不同部位的總黃酮含量如圖1所示。
圖1 費菜不同部位的總黃酮含量Fig.1 Total flavonoids content in different organs of the Sedum aizoon L.注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)。
由圖1可知,費菜中不同部位的黃酮含量不同,由高到低的順序為:嫩葉>莖>老葉>花。嫩葉中黃酮含量最高,是花的2.39倍,莖的1.37倍,老葉的1.39倍。且嫩枝代謝較為旺盛,綜合含量高,有利于實際生產(chǎn)。因此,本實驗采用黃酮含量較高的費菜嫩枝進行水培培養(yǎng)。
2.2 費菜水培條件的確定
費菜的水培條件主要有溫度、光照條件等,本實驗對溫度和光照條件進行單因素實驗,其總黃酮含量隨培養(yǎng)時間的變化如圖2和圖3所示。
圖2 不同溫度下費菜黃酮含量的變化Fig.2 Change of flavonoids under different temperatures in Sedum aizoon L.注:“**”表示黃酮含量與20 ℃比,差異極顯著, (p<0.01);“*”表示差異顯著(p<0.05)。
由圖2可知,溫度對費菜富集總黃酮含量的影響非常顯著。在光照時間為12 h/12 h培養(yǎng)條件下,不同溫度(20、25、28 ℃)費菜嫩枝的黃酮含量總體上隨著時間的延長而增加,但25 ℃培養(yǎng)組顯著高于其它兩組(p<0.05)。三種培養(yǎng)溫度下,費菜總黃酮含量在第4、第8 d均達到峰值,25 ℃培養(yǎng)組最高,分別是20、28 ℃培養(yǎng)組的3.54,2.89倍和3.16,1.80倍。綜上,可確定費菜最佳水培溫度為25 ℃。
圖3 不同光周期下費菜黃酮含量的變化趨勢Fig.3 Change trend of flavonoids in different photoperiod in the Sedum aizoon L.注:“**”表示黃酮含量與8 h/16 h比,差異極顯著 (p<0.05);“*”表示差異顯著(p<0.05)。
由如圖3可知,在溫度為25 ℃培養(yǎng)條件下,不同光周期(8 h/16 h,12 h/12 h,16 h/8 h)費菜嫩枝總黃酮富集量不同,其中長光照周期(16 h/8 h)培養(yǎng)組顯著高于短光照周期(8 h/16 h)培養(yǎng)組(p<0.05),高于12 h/12 h培養(yǎng)組(p<0.05);培養(yǎng)期間,長光照周期培養(yǎng)組前期總黃酮含量急速上升,在第4 d到達峰值后下降;12 h/12 h培養(yǎng)組黃酮含量在培養(yǎng)期間呈“M”型;短光照周期培養(yǎng)組總黃酮含量在以上兩組之間持續(xù)增加;三種光周期條件下,長光照周期培養(yǎng)組總黃酮平均含量在培養(yǎng)期間高于其他兩組,即隨著光照時間的增加,費菜黃酮含量上升。綜上,本實驗選擇在白/晝?yōu)?6 h/8 h的條件下培養(yǎng)。
綜上,費菜最佳水培條件為溫度25 ℃,光周期為16 h/8 h。在該實驗條件下,對費菜嫩枝進行外源果糖處理,確定其適宜濃度,并研究其黃酮相關酶活性。
2.3 果糖處理對費菜總黃酮含量的影響
在25 ℃,光照16 h/8 h條件下,使用不同濃度果糖溶液水培對費菜總黃酮含量的影響如圖4所示。
圖4 不同濃度果糖處理費菜黃酮的含量變化Fig.4 Change of flavonoids content in different concentrations of fructose treatment in Sedum aizoon L.
圖5 果糖處理對費菜總黃酮相關酶活性的影響Fig.5 The effect of fructose treatment on the activities of flavonoids metabolism related enzymes in Sedum aizoon L.注:“**”表示與對照差異極顯著(p<0.01)。
如圖4所示,采用不同濃度果糖處理費菜,其黃酮含量隨培養(yǎng)天數(shù)而變化。不同濃度果糖處理費菜嫩枝黃酮含量積累呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。不同果糖濃度處理組,黃酮累積程度不同:培養(yǎng)10 d后,30 mmol/L果糖處理組費菜黃酮平均含量最高,比對照組高1.37 mg/g(鮮重)。培養(yǎng)期間,20、30 mmol/L濃度果糖處理組和對照組黃酮含量在第4 d達到高峰,40 mmol/L果糖處理組在第2 d達到高峰,10 mmol/L果糖處理組在第6 d時達到高峰。培養(yǎng)前期40 mmol/L濃度果糖處理組效果比中低濃度處理組好,但后期此處理組末期效果比對照組差。而30 mmol/L果糖處理組黃酮含量普遍優(yōu)于10、20 mmol/L果糖處理組。所以本實驗選擇30 mmol/L果糖為最適宜果糖濃度處理組。
2.4 果糖處理對費菜總黃酮相關酶活性的影響
果糖處理對費菜中黃酮合成代謝相關酶隨時間變化影響如圖5所示。如圖5a所示,兩組PAL活性隨時間變化,呈現(xiàn)W型,在第4 d到達較小值,總體上均呈現(xiàn)下降趨勢。與對照組相比,果糖處理組PAL活性顯著(p<0.05)高于對照組,表明果糖處理可以有效減緩PAL活性的降低。果糖處理對費菜CHS活性影響如圖5b所示,兩組CHS活性隨培養(yǎng)天數(shù)的增加均呈下降趨勢,果糖處理可以延緩CHS活性下降,果糖處理組CHS活性顯著(p<0.05)高于對照組。如圖5c所示,CHI活性在培養(yǎng)過程中呈下降趨勢。與對照組相比,果糖處理可以延緩CHI活性下降,在培養(yǎng)期間處理組CHI活性高于對照組(p<0.05),在第2 d CHI活性急劇下降,至第4 d后趨勢緩和。
隨著培養(yǎng)時間的延長,黃酮類化合物會與PPO、POD等酶發(fā)生反應,從而減少費菜組織內(nèi)黃酮的含量。如圖5d所示,果糖處理組和對照組PPO活性均呈現(xiàn)先下降后升高趨勢,其中果糖處理組PPO活性顯著高于對照組(p<0.05)。由圖5e可知,POD活性隨培養(yǎng)時間呈先升高后降低的趨勢,培養(yǎng)至第4 d時POD活性急劇上升,對照組與處理組均在第8 d達到最大值;果糖處理抑制了POD活性的增加,使得處理組POD活性顯著低于對照組(p<0.05)。
3.1 費菜部位與黃酮含量關系
費菜作為一種蔬菜,其主要食用部位是莖和葉。由于地域、品種、水分、溫度、光照條件的不同,費菜中不同部位總黃酮的富集情況也有所不同。研究表明費菜中老葉黃酮含量最高[14]。本實驗系統(tǒng)研究了費菜中不同部位的總黃酮含量,發(fā)現(xiàn)嫩葉中黃酮含量最高,與前人研究結(jié)果不符,可能是受產(chǎn)地,季節(jié)等因素的影響。在本實驗結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時間的延長,費菜黃酮的含量出現(xiàn)波動,培養(yǎng)至第6 d時,黃酮含量出現(xiàn)下降情況(見圖2),結(jié)合我們在水培過程中發(fā)現(xiàn)費菜嫩枝在第6~8 d時出現(xiàn)長根現(xiàn)象,推測黃酮在這一時段參與了費菜組織中的合成代謝,導致了黃酮含量的下降。
3.2 費菜水培條件與黃酮含量關系
改變費菜水培過程中的溫度,光周期,以及不同濃度的果糖處理條件,總黃酮富集情況不同。本實驗結(jié)果表明,適宜的溫度有利于黃酮的生成,這與徐友等對銀杏的研究結(jié)果一致[15]。研究表明,長時間光照條件下費菜黃酮含量較高,可能由于光照條件下葉綠體分化,而葉綠體分化與黃酮積累有關[16];或黃酮合成途徑中關鍵酶PAL受光周期控制[17],在光照時間充足下,增強了PAL活性,從而影響總黃酮合成的效果,而使總黃酮富集量最大。這與孫君明等[18]對大豆幼苗組織和羅美佳等[19]對三七的研究結(jié)果一致。各種碳源對植物的次生代謝產(chǎn)物也有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),蔗糖有利于人參色素細胞生長及花苷的積累[20];外源糖處理對銀杏細胞中黃酮的合成和細胞生長有積極影響[21];蔗糖處理對費菜黃酮具有一定的富集作用[9]。本實驗中,在外源果糖處理下,費菜總黃酮含量普遍高于對照組,表明外源果糖有利于費菜組織中黃酮的合成。
3.3 果糖處理與費菜總黃酮相關酶活性關系
PAL、CHI、CHS、PPO及POD可能與黃酮共同形成一個復雜的合成/代謝網(wǎng)絡,維持細胞黃酮含量與抗氧化與氧化的平衡,在這個過程中,果糖可能起到了關鍵的作用。有研究表明,糖代謝通過莽草酸途徑連接次生代謝,糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑通過反應最終生成苯丙氨酸[22]。植物通過苯丙烷類合成途徑生物合成黃酮類化合物[23],PAL是植物次生代謝特別是苯丙烷途徑的關鍵酶和限速酶,可以為其他物質(zhì)的代謝反應提供代謝底物[24],所以PAL活性的高低與黃酮類物質(zhì)合成有密切關系。程水源研究發(fā)現(xiàn)生長調(diào)節(jié)劑能提高黃酮含量,其調(diào)控機理與費菜中的PAL活性相關,而PAL對黃酮合成的調(diào)控是通過對黃酮合成前提底物的調(diào)控來完成的[25]。本研究表明,果糖處理增強了PAL活性,且其變化與其黃酮含量變化同步??赡苁怯捎诠翘岣吡薖AL活性,加速了黃酮合成前提底物的合成,而間接提高了黃酮含量。這與湯月昌研究外源果糖處理青花菜芽的結(jié)果一致[26]。
CHS是一種聚酮合成酶,是將苯丙烷類代謝途徑引向黃酮類化合物合成的第一個關鍵酶,CHS催化香豆酰輔酶-A與丙二酰輔酶-A結(jié)合生成查爾酮,查爾酮是黃酮合成的前體,因此CHS是催化類黃酮生物合成的第一個限速步驟[27]。查爾酮異構(gòu)酶(CHI)是黃烷酮代謝過程中的關鍵酶,而黃烷酮是黃酮類化合物的代謝中間體,即CHS和CHI是將苯丙烷類代謝途徑引向黃酮類合成的兩個關鍵酶[28],有研究表明CHS基因在大豆子粒發(fā)育過程中的表達趨勢與異黃酮積累模式基本一致,表明其可能調(diào)控異黃酮的合成[29],且該酶基因的表達效應受糖含量的調(diào)控。同時也有研究表明對苦蕎麥進行脅迫處理,CHI基因表達量的增加與黃酮含量升高在一定時間段呈正相關[30],因此增加CHI活性能使黃酮類化合物含量增加。這與本實驗果糖處理組CHI活性和CHS活性均高于對照組結(jié)果相似。
有研究表明黃酮類化合物能與PPO、POD相互作用,總酚與黃酮是PPO和POD的底物,形成黃酮、PPO、POD反應體系,使植物對逆境或成熟衰老做出反應[31]。我們的研究發(fā)現(xiàn),果糖處理和對照組POD酶活性變化與黃酮含量變化趨勢相反,而PPO酶活性變化則與黃酮含量變化關系不顯著。POD具有催化黃酮聚合形成大分子褐色物質(zhì)的能力[32]。本實驗結(jié)果表明,果糖處理可以在貯藏時間內(nèi)有效的抑制POD活性,從而減少黃酮的代謝。湯月昌等人在研究葡萄糖處理對青花菜抗氧化性的影響中得出葡萄糖處理組的POD活性在貯藏期間一直低于對照組[33],與本結(jié)果相似。而POD酶活性的增強可能主要是為了提高費菜植物的抗逆性和衰老所引起的,這與向小林的觀點一致[34]。
綜上,果糖處理能延緩黃酮合成酶PAL、CHI、CHS活性的下降,抑制POD活性的上升,從而促進黃酮的累積,但培養(yǎng)4 d后,可能由于外界脅迫或衰老等影響,PPO活性與POD活性顯著上升,加速黃酮代謝,致使黃酮含量下降。由于果糖處理對PPO活性有顯著促進作用,在水培條件下,PPO對費菜嫩枝黃酮合成與代謝中起到了關鍵性作用。
費菜嫩枝的最佳水培條件為溫度25 ℃,光周期16 h/8 h。采用浸莖法對費菜進行不同濃度果糖處理,結(jié)果表明30 mmol/L處理組效果最好,PAL活性,PPO活性,CHI及CHS活性均比對照組高,POD活性比對照組低。以上結(jié)果表明,果糖處理可以對黃酮合成代謝途徑中POD、PAL、CHI以及CHS活性產(chǎn)生影響,從而增加費菜中總黃酮含量。
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Effect of fructose treatment on flavonoids content and the related enzymes inSedumaizoonL.
WANG Chun-xing,WANG Hong-fei*,XIONG Qian,SONG Jia-min,HU Yue,DONG Shuan-quan,SUN Meng,WANG Kai-kai,XU Feng
(College of Food Science and Engineering,Ningbo University,Ningbo 315211,China)
In this paper,the effects of water culture temperature(20,25,28 ℃),photoperiod(8 h/16 h,12 h/12 h,16 h/8 h)and fructose treatment(0,10,20,30,40 mmol/L)on flavonoid content and anabolism related enzyme activity inSedumAizoonL. were investigated. The results indicated that optimal water culture conditions was 25 ℃,16 h/8 h. 30 mmol/L fructose treatment could effectively improve the content of flavonoids inSedumaizoonL.,which the treatment group was 1.37 mg/g higher than the control group(fresh weight). Compared with control group,fructose treatment could delay the decrease of the activities of phenylalanine ammonia lyase(PAL),polyphenol oxidase(PPO),chalcone synthase(CHS)and chalcone isomerase(CHI),and inhibit the peroxidase(POD)activity. It suggested that fructose treatment regulated the enzymes activities of flavonoids metabolism and promoted the accumulation of flavonoids during culturing. These results laid a theoretical basis for enhancement of the bioactive compounds contents and nutritional values ofSedumaizoonL.
SedumaizoonL.;water culture;fructose treatment;flavonoids metabolism related enzymes
2016-09-13
王春幸(1992-),女,碩士研究生,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工,E-mail:18815283583@163.com。
*通訊作者:王鴻飛(1964-),男,碩士,教授,從事農(nóng)產(chǎn)品加工,食品科學方面的研究,E-mail:wanghongfei@nbu.edu.cn。
浙江省自然科學基金(LY16C200003);寧波市自然科學基金(2015A610273);浙江省重點研發(fā)項目(2016C02G4010891)。
TS255.1
A
1002-0306(2017)05-0124-06
10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.015