SRC—1對異位內(nèi)膜雌激素調(diào)控的CXCL12表達(dá)的影響

施秀

[摘要] 目的 研究子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜中類固醇激素受體輔活化子-1（SRC-1）和趨化因子配體12（CXCL12）的表達(dá)水平，從而了解SRC-1對異位子宮內(nèi)膜雌激素（E2）調(diào)控的CXCL12表達(dá)的影響。方法 2014年9月—2016年9月，方便選擇在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科因內(nèi)異癥接受手術(shù)治療，術(shù)后標(biāo)本證實為內(nèi)異癥的15例患者的異位內(nèi)膜及同期放置宮內(nèi)節(jié)育器的無內(nèi)異癥且月經(jīng)周期正常的健康婦女10名的正常內(nèi)膜，應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR方法比較正常子宮內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜在月經(jīng)的增生期和分泌期SRC-1和CXCL12mRNA表達(dá)水平。ELISA檢測沉默異位內(nèi)膜SRC-1的表達(dá)對雌激素誘導(dǎo)異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CXCL12的影響。結(jié)果 正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中SRC-1和CXCL12的表達(dá)呈現(xiàn)周期性變化，而異位內(nèi)膜這兩種因子的表達(dá)并沒有周期性的改變。異位內(nèi)膜SRC-1和CXCL12mRNA的表達(dá)與正常內(nèi)膜相比明顯升高。沉默異位內(nèi)膜SRC-1表達(dá)后，E2誘導(dǎo)的CXCL12表達(dá)下降50.04%（P<0.05）。 結(jié)論 類固醇激素受體輔活化子調(diào)控異位內(nèi)膜表達(dá)CXCL12的作用中，SRC-1是雌激素的主要輔激活化子。

[關(guān)鍵詞] 甾體激素受體輔活化子-1；趨化因子配體12；子宮內(nèi)膜異位癥

[中圖分類號] R737.9 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）12（c）-0034-03

[Abstract] Objective To observe the expression of steroid coactivator-1（SRC-1） and steroid-induced CXCL12 in endometriosis （EMS） and to explore the roles of SRC-1in the steroid-induced CXCL12 expression in EMS. Methods Convenient selection from September 2014 to September 2016，15 endometriosis cases undergoing surgery in The First Affiliated Hospital of Soochow University were enrolled in this study.Their ectopic endometriosis were from ovarian endometriomata which were identified pathologically. The 10 normal endometrium were acquired from the healthy women with normal cycle. Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to quantify the mRNA levels of SRC-1 and CXCL12 during the menstrual cycle. ELISA was adopted to analyze the steroids-induced CXCL12 expression before and after the SRC-1 was silenced by siRNA. Results The SRC-1 and CXCL12 showed marked cyclic differences in normal endometrium. There were no periodic variation in the expression of SRC-1and CXCL12 in ectopic endometrium throughout the menstrual cycle. The SRC-1 and CXCL12 of ectopic endometrium were significantly higher than that of normal endometrium. Silencing of SRC-1 significantly reduced the E2-induced CXCL12 expression to 50.04%（P<0.05）. Conclusion SRC-1 is the major coactivator of E2-induced CXCL12 expression in EMS.

[Key words] Steroid receptor coactivator -1； Chemokine ligand 12； Endometriosis of uterus

趨化因子配體12（CXCL12）是趨化因子家族成員之一，它通過和受體CXCR4結(jié)合，激活MAPK信號通路，可以促進胚胎發(fā)育，血管形成以及腫瘤的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。CXCL12是雌激素調(diào)節(jié)基因，雌激素（E2）可以使子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中CXCL12的表達(dá)升高[2]。Ruiz等[3]實驗研究表明內(nèi)異癥患者CXCL12和CXCR4呈現(xiàn)高表達(dá)。類固醇激素受體輔活化子-1（SRC-1）是SRCs家族成員之一[4]，它可以增強許多核受體的轉(zhuǎn)錄活性，包括雌激素受體和孕激素受體。該實驗自2014年9月—2016年9月，方便選擇在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科因內(nèi)異癥接受手術(shù)治療，術(shù)后標(biāo)本證實為內(nèi)異癥的15例患者的異位內(nèi)膜及同期放置宮內(nèi)節(jié)育器的無內(nèi)異癥且月經(jīng)周期正常的健康婦女10名的正常內(nèi)膜，采用RT-PCR方法，比較正常子宮內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜中SRC-1和CXCL12的mRNA表達(dá)；通過siRNA沉默異位內(nèi)膜SRC-1的表達(dá)，研究SRC-1對異位內(nèi)膜雌激素調(diào)控的CXCL12表達(dá)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本來源 異位子宮內(nèi)膜取自于蘇大附一院婦產(chǎn)科15例EMS病人，均因卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫行手術(shù)治療，標(biāo)本經(jīng)病理檢查證實為子宮內(nèi)膜異位癥。正常子宮內(nèi)膜取自無EMS病史行取環(huán)或上環(huán)的月經(jīng)周期正常的健康婦女，病理檢查證實為正常的子宮內(nèi)膜。其中增生（P）期內(nèi)膜取自月經(jīng)第5～14天，分泌（S）期內(nèi)膜取自月經(jīng)第15～28天。15例患者中增生期8例，分泌期7例。7例分泌期內(nèi)膜標(biāo)本全部用于分離異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，其中成功用于實驗者為5例。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，17β-雌二醇（17β-E2，CXCL12ELISA試劑盒，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒，抗SRC-1抗體，SRC-1的siRNA。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR技術(shù)檢測SRC-1和CXCL12的表達(dá) SRC-1和CXCL12的引物根據(jù)GenBank中的mRNA序列采用Oligo 5.0軟件進行設(shè)計，上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄參照試劑盒說明書進行。定量PCR反應(yīng)采用Power SYBR Green PCR試劑盒，7700型實時熒光定量PCR儀進行擴增和檢測。根據(jù)公式2-ΔΔCT計算目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的相對表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 原代細(xì)胞傳代到6孔板，傳代后的細(xì)胞達(dá)到80%匯片時，換用含有10～8 mol/L 17β-E2培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h后收集上清，采用ELISA法檢測上清中CXCL12的表達(dá)量。研究沉默SRC-1表達(dá)對雌激素誘導(dǎo)的CXCL12表達(dá)的影響，將異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞以1×105/孔的密度傳至6孔板。Opti-MEM培養(yǎng)過夜，脂質(zhì)體2 000介導(dǎo)SRC-1的siRNA（簡稱siSRC-1）轉(zhuǎn)染異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，終濃度為每孔100 nmol/L。轉(zhuǎn)染4 h后換用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，2 d后換用含有10-8 mol/L 17β-E2的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.2.3 CXCL12酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測各組SDF-1α的表達(dá)水平：在E2作用后的24、48 h和72 h，分別收集上清用ELISA試劑盒檢測上清液中CXCL12的表達(dá)水平。

1.2.4 Western-Blot檢測轉(zhuǎn)染前后SRC-1蛋白表達(dá)水平 異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染siSRC-1后48 h抽提胞核蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白，封閉液室溫孵育1 h，單克隆一抗4℃過夜，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。采用ECL+PLUS試劑（Amersham Pharmacia Biotech）檢測特異蛋白條帶的顯色。實驗中的一抗分別為抗SRC-1抗體和內(nèi)參蛋白PARP一抗抗體。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理與分析，文中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±s）表示，實驗至少重復(fù)3遍。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)異癥患者的異位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中SRC-1和CXCL12的表達(dá)水平

實時定量PCR結(jié)果顯示，正常內(nèi)膜中SRC-1和CXCL12的表達(dá)具有周期性變化。S期表達(dá)水平分別為（2.64±1.02）和（1.62±0.50），均顯著低于P期。而異位內(nèi)膜中SRC-1和CXCL12的表達(dá)沒有這種周期性改變（P>0.05）。異位內(nèi)膜S期SRC-1表達(dá)水平為（5.44±1.27），正常內(nèi)膜S期SRC-1表達(dá)水平為（2.64±1.0），二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.2 雌激素對于異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞SDF-1表達(dá)的影響

在表2中觀察到S期異位內(nèi)膜SRC-1和CXCL12表達(dá)均高于正常內(nèi)膜，因此在以后的實驗中選取了S期的異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞來觀察類固醇激素對SDF-1表達(dá)的影響。結(jié)果如圖1所示，與對照組比較，10-8 mol/L E2顯著增加CXCL12的表達(dá)。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮體以外的部位。異位內(nèi)膜可以侵犯全身任何部位，但絕大多數(shù)位于盆腔臟器和壁腹膜，以卵巢和宮骶韌帶最常見，其次為子宮及其他臟腹膜，陰道直腸膈等部位。由于內(nèi)異癥是雌激素依賴性疾病[5]，在自然絕經(jīng)和人工絕經(jīng)后，異位內(nèi)膜病灶可逐漸萎縮吸收，使用性激素抑制卵巢功能，可暫時阻止疾病發(fā)展[6]。可見雌激素在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

CXCL12通過和受體CXCR4結(jié)合，可以促進胚胎發(fā)育，血管形成以及腫瘤的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Hall JM等[7]試驗研究表明，在卵巢組織中，尤其是內(nèi)異癥組織中，CXCL12/CXCR4表達(dá)明顯增多，與該研究結(jié)果相一致。此外，CXCL12是雌激素調(diào)節(jié)基因，雌激素（E2）可以使子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中CXCL12的表達(dá)升高，所以內(nèi)異癥患者中高雌激素水平導(dǎo)致CXCL12呈現(xiàn)高表達(dá)。

類固醇激素受體輔激活子家族（SRCs）是一類相對分子質(zhì)量約為160×103的輔激活因子，包括3個同系成員SRC-1，SRC-2，SRC-3。SRC蛋白家族主要對類固醇受體如雌激素受體、孕激素受體、甲狀腺素受體以及糖皮質(zhì)激素受體等發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用， 對機體的生長、發(fā)育以及生殖產(chǎn)生重要的影響[8]。

研究結(jié)果顯示，雌激素誘導(dǎo)的CXCL12表達(dá)水平為（2313±357）ng/L，顯著高于雌激素培養(yǎng)前的（614±130）ng/L，說明雌激素可使異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中CXCL12表達(dá)增加，這與Tsutsumi等[2]對正常子宮內(nèi)膜的研究結(jié)果一致。沉默異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中SRC-1表達(dá)后，雌激素誘導(dǎo)異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CXCL12的水平為（1155±244）ng/L，較SRC-1沉默前的表達(dá)水平下降50.04%（P<0.05）。說明沉默異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中SRC-1可明顯減少E2誘導(dǎo)的SDF-1表達(dá)。因此，該研究推論SRC-1是雌激素的主要輔激活子。

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（收稿日期：2016-10-26）