不同小干松種源的SRAP分析

王騫春

摘要[目的]研究小干松種源遺傳多樣性，為小干松引種、育種工作提供基礎(chǔ)資料。[方法]利用SRAP熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)引種的15個(gè)小干松種源進(jìn)行SRAP分析。[結(jié)果]9對(duì)熒光標(biāo)記的SRAP引物共產(chǎn)生1 075個(gè)條帶，多態(tài)性位點(diǎn)953個(gè)，平均多態(tài)性為88.7%，每對(duì)引物擴(kuò)增條帶75～146條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶119條；通過(guò)UPGMA軟件對(duì)15個(gè)種源進(jìn)行遺傳聚類(lèi)分析，15個(gè)種源的相似系數(shù)在0.761 3～0.876 0，以遺傳相似系數(shù)0.850 0為閾值可將15個(gè)種源分為4個(gè)群體，同一地理來(lái)源的種源有一定的遺傳差異，但大體呈現(xiàn)按地理來(lái)源聚類(lèi)的趨勢(shì)。[結(jié)論]15個(gè)小干松種源具有較高的基因多態(tài)性，遺傳多樣性豐富，小干松變異類(lèi)型與地理分布有關(guān)。

關(guān)鍵詞小干松；種源；SRAP

中圖分類(lèi)號(hào)S188+.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）12-0139-02

Abstract[Objective] To study the gentic diversity of Pinus contorta provenance for laying the foundation for introduction of P. contorta breeding. [Method] Using SRAP fluorescence technique to analyze 15 provenances of P. contorta. [Result]9 SRAP primers for fluorescent labeling produced a total of 1 075 bands， 953 polymorphic loci， the average polymorphism was 88.7%. Each primer amplified bands were from 75 to 146， an average of 119 bands. The similarity coefficients of 15 provenances were 0.761 3-0.876 0 by UPGMA software.Taking the genetic similarity coefficient of 0.850 0 as threshold， 15 provenances were divided into 4 clusters， the provenances with the same geographic origin had some genetic differences， but generally showed a trend of clustering according to geographic origin. [Conclusion]15 provenances of P. contorta had high genetic diversity， abundant genetic diversity， the variation types were related to geographic distribution.

Key wordsPinus contorta；Provenances；SRAP

小干松（Pinus contorta）為松科松屬植物，原產(chǎn)地為北美，具有良好的抗性和適應(yīng)性 [1]。SRAP標(biāo)記（SequenceRelated Amplified Polymorphism）是由Li 等[2]在2001年提出的一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)。該方法具有高共顯、中產(chǎn)率、多態(tài)性高和重復(fù)性好的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位、基因分離、品種鑒定等研究中。該研究采用SRAP技術(shù)對(duì)引進(jìn)的不同種源小干松進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為小干松的引種、育種工作提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為從加拿大引進(jìn)的15個(gè)種源小干松種子（表1）。將其播種于遼寧省清原滿(mǎn)族自治縣國(guó)營(yíng)大孤家林場(chǎng)，繁育家系，每個(gè)種源采10 株不同健康單株上當(dāng)年生新發(fā)針葉，液氮凍存后放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1DNA的提取。采用CTAB法（稍加改進(jìn)）提取小干松基因組DNA [3]。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA 的質(zhì)量及完整性，UV1102 紫外分光光度計(jì)測(cè)定 DNA 濃度，在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2

PCR反應(yīng)。將每個(gè)種源的10個(gè)家系基因組DNA按相同濃度混合作為模板。熒光標(biāo)記引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。從64對(duì)引物組合（表2）中，選擇多態(tài)性好的9對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為20 μL，包括：Taq酶0.5 U，Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs濃度0.15 mmol/L，模板DNA含量60 ng，引物0.2 μmol/L。Mg2+、10×PCR Buffer 和 Taq 酶均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。擴(kuò)增反應(yīng)在 PTC-200 型 PCR（BIO-RAD）上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，ABI377測(cè)序儀檢測(cè)片段大小，生成膠圖。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)GeneScan軟件對(duì)膠圖進(jìn)行分析，有帶的地方替換為1，無(wú)帶的地方替換為0，這樣構(gòu)成了0/1數(shù)據(jù)，利用 NTsys 2.10軟件進(jìn)行 UPGMA聚類(lèi)分析并繪制樹(shù)狀聚類(lèi)圖。

2結(jié)果與分析

2.1小干松種源遺傳多樣性的SRAP分析

從64對(duì)SRAP引物中選取9對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好、譜帶清晰的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，對(duì)15個(gè)小干松種源進(jìn)行SRAP分析，電泳圖譜見(jiàn)〖CM（25〗圖1。這9對(duì)引物共擴(kuò)增出 1〖KG*2〗075個(gè)條帶，平均每對(duì)引物可以擴(kuò)增出 119條帶，檢測(cè)出多態(tài)性條帶為953 條，平均多態(tài)性為88.7%（表3）。

2.2小干松種源相似性和聚類(lèi)分析

采用軟件NTSYS 2.10，根據(jù)9對(duì)引物產(chǎn)生的全部位點(diǎn)進(jìn)行遺傳相似系數(shù)的計(jì)算，15個(gè)種源相似系數(shù)在0.761 3～0.876 0（表4）。利用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析得到15個(gè)小干松種源的聚類(lèi)樹(shù)形（圖2），以相似系數(shù)0.850 0為閾值，將15個(gè)種源分為4個(gè)群體：種源C1、C2、C3、C5、C13和C15為第一群體；種源C14為第二群體；種源C4、C6、C7和C10為第三群體；種源C8、C9、C11和C12為第四群體。

3討論與結(jié)論

小干松具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快的特點(diǎn)，并且抗旱、抗蟲(chóng)性較強(qiáng)，我國(guó)的黑龍江、吉林、湖北等地均進(jìn)行了引種，并進(jìn)行了一系列的種源試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小干松樹(shù)高、胸徑等指標(biāo)在種源間差異顯著[4-6]，說(shuō)明不同種源的小干松遺傳變異較高。

該研究用熒光標(biāo)記SRAP方法分析了從加拿大引進(jìn)的15個(gè)小干松種源的遺傳差異，共得到1 075個(gè)條帶，檢測(cè)出多態(tài)性條帶為953 條，平均多態(tài)性為88.7%，多態(tài)性較高，說(shuō)明熒光標(biāo)記的SRAP適合分析小干松種源的遺傳多樣性。15個(gè)種源遺傳距離在0.238 7～0.124 0，相似系數(shù)比較高，可能是由于引種地理位置較近所致。

參考文獻(xiàn)

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