香蕉枯萎病菌4號生理小種cat1基因敲除與表型分析

王小琳 李春強 楊景豪 李文彬 孫建波 彭明

摘 要 前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種（Foc4）中的過氧化氫酶1（cat1）基因受到巴西蕉誘導(dǎo)上調(diào)表達，為研究cat1基因在Foc4侵染香蕉過程中的作用，利用同源重組方法敲除Foc4的cat1基因，并對獲得的敲除突變體開展表型分析和致病性測定。結(jié)果表明：cat1基因缺失對Foc4的菌絲、孢子形態(tài)、菌落生長、抗?jié)B透壓脅迫和細胞壁選擇性壓力等沒有影響；但引起菌株抵抗外源氧脅迫、細胞壁穿透能力、纖維素利用能力減弱和對巴西蕉的致病性減弱。顯示cat1基因的產(chǎn)物通過清除香蕉分泌的活性氧在Foc4對香蕉的致病過程中起作用，并參與病原菌對寄主纖維素成分的代謝。此結(jié)果為進一步深入研究香蕉枯萎病菌的致病機理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西蕉；尖孢鐮刀菌古巴?；?；cat1基因；基因敲除；致病性

中圖分類號 S436.681 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract It was found that the cat1 gene in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4（Foc4）was up-regulated induced by Musa sp. AAA. cv. Baxi in our previous proteomics analysis. In order to investigate the function of cat1 during the host infection process of Foc4， the cat1 gene in Foc4 was deleted by the homologous recombination method. The phenotype and pathogenicity of the cat1 knockout mutants were then analyzed. The results indicated that there were no apparent difference between the mutants and the wild type strain on mycelium and spores morphology， colonial growth， osmotic stress resistance and cell wall selective pressure. However， the mutants showed significant decrease in the abilities of exogenous oxygen stress resistance， penetrability of cell wall， cellulose utilization， and the pathogenicity to Musa spp. AAA. cv. Baxi. These results suggested that the cat1 gene in Foc4 should be involved in pathogenesis by scavenging host-derived ROS， and participated in the process of host cellulose degradation.

Key words Musa spp. AAA. cv. Baxi； Fusarium oxysporum f. sp. cubense； cat1 gene； knockout； pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.023

香蕉屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa），是全球最大的草本開花植物。香蕉作為著名的熱帶和亞熱帶水果，其進出口貿(mào)易量和年交易量占各類水果之首，交易金額也達到了世界第二[1]。由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense， Foc）引起的香蕉枯萎病是制約香蕉生產(chǎn)的重要原因之一。尖孢鐮刀菌屬半知菌類（Fungiimperfecti）梗孢目（Moniliales）痤孢科（Tubercular）鐮刀菌屬（Fusarium）。尖孢鐮刀菌通過侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導(dǎo)組織，并能夠在生長發(fā)育代謝過程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成植物枯萎繼而死亡，影響產(chǎn)量。香蕉枯萎病是一種土傳病害，目前還沒有一種防治效果理想的化學(xué)藥劑，且化學(xué)防治存在田間藥劑流失嚴(yán)重、危害環(huán)境和人類的健康等問題，因此，培育抗病品種成為十分迫切的替代策略[2]。探討尖孢鐮刀菌的致病相關(guān)基因的功能，可深入了解尖孢鐮刀菌的致病機理，有利于抗病育種研究。

近年來，雖然關(guān)于香蕉枯萎病菌致病相關(guān)基因的研究已經(jīng)取得了一定的進展[3-5]，但離詳細闡明枯萎病菌的致病機理還有一定的距離。本研究室通過蛋白組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)Foc4中過氧化物酶系統(tǒng)中的過氧化氫酶1（catalase1，cat1）受到巴西蕉誘導(dǎo)后蛋白表達量上調(diào)了2.4倍，而Foc1中卻無明顯變化（未發(fā)表），提示cat1可能在Foc4的致病過程中起作用。眾所周知，病原真菌中存在的抗氧化系統(tǒng)對其成功感染宿主起重要作用。人體病原真菌能夠成功侵染寄主的前提是它們能夠抵抗在侵染過程中寄主效應(yīng)細胞產(chǎn)生的活性氧，而過氧化氫酶在植物和某些人類病原菌的致病機理中起著重要作用，包括空腸彎曲菌[6]、結(jié)核桿菌[7]、根癌土壤桿菌[8]等。但cat1基因在尖孢鐮刀菌古巴專化型中的功能尚未見報道。為了闡明Foc4中的cat1基因是否在病原菌的致病過程中發(fā)揮作用，筆者利用DNA同源重組的方法對Foc4的cat1基因進行敲除，并對敲除突變體的致病性和表型進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp. cubense）4號生理小種B2菌株，由黃俊生研究員惠贈，分離自海南島并進行了基因組測序。pCT74質(zhì)粒由本研究室保存（福建省農(nóng)科院惠贈）。巴西蕉（Musa spp. AAA. cv. Baxi）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組織培養(yǎng)中心提供。試驗用到的培養(yǎng)基或試劑有：PDA、PDB培養(yǎng)基和纖維素剛果紅培養(yǎng)基（購自海博生物）；再生培養(yǎng)基、STC溶液和PTC溶液按黃東杰等[9]的方法進行配制；Driselase崩潰酶（20 mg/mL，Sigma），Lysing Enzyme溶壁酶（20 mg/mL，購自廣東省微生物研究所）；V8培養(yǎng)基（V8果汁200 g/L，CaCO3 3.0 g/L，瓊脂20 g/L，pH值5.8）。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA的提取 將野生型B2菌株接種于PDB培養(yǎng)基中，200 r/min、28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)5 d，過濾收集菌絲體，之后用CTAB法[10]提取基因組DNA。

1.2.2 cat1基因敲除載體的構(gòu)建 根據(jù)野生型基因組DNA測序序列，分別在cat1基因的上下游截取800～1 500 bp左右的DNA序列，記為同源臂A和同源臂B，并設(shè)計引物，記為cat1-AF和cat1-AR、cat1-BF和cat1-BR（表1）。用這2對特異引物以野生型基因組DNA為模版進行PCR擴增，獲得cat1基因開放閱讀框上游5′端的同源臂A和下游3′端的同源臂B的DNA。PCR擴增采用2×Taq PCR master Mix試劑（TIANGEN），PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，31個循環(huán)；最后72 ℃延伸補齊7 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收PCR產(chǎn)物。

將回收DNA用pLB零背景快速克隆試劑盒連接至pLB載體，構(gòu)建pLB-A和pLB-B克隆載體；用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和ApaⅠ將pLB-A克隆載體進行酶切，之后連接于經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶線性化的pCT74載體（包含潮霉素抗性基因hph和GFP基因表達盒）中，構(gòu)建pCT74-A克隆載體；用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SpeⅠ將pLB-B克隆載體進行酶切，之后連接于經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶線性化的pCT74-A克隆載體中，構(gòu)建cat1基因敲除載體，即A-pCT74-B敲除載體；以A-pCT74-B敲除載體為模版，用同源臂A的前引物cat1-AF和同源臂B的后引物cat1-BR進行PCR擴增，獲得用于轉(zhuǎn)化的線性DNA片段，即A+hph+gfp+B。PCR擴增采用PrimeSTAR Max Premix（2×）試劑（TaKaRa），PCR反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s；55 ℃退火5 s；72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)。最后回收純化備用。

1.2.3 尖孢鐮刀菌原生質(zhì)體制備和DNA轉(zhuǎn)化 參照黃東杰等[9]和李春強等[11]的方法進行，連續(xù)培養(yǎng)4代獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 cat1基因敲除突變體的鑒定 用CTAB[10]法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以轉(zhuǎn)化子和野生型菌株的基因組DNA為模板，根據(jù)基因組序列設(shè)計特異引物，對轉(zhuǎn)化子進行PCR擴增檢測。引物H1和H2檢測hph+GFP片段是否整合到基因組中；引物F1和F2檢測轉(zhuǎn)化子是否在目的基因上游5′端發(fā)生同源重組；引物F3和F4檢測轉(zhuǎn)化子是否在目的基因下游3′端發(fā)生同源重組；引物cat1-F和cat1-R檢測轉(zhuǎn)化子是否敲除掉目的基因。預(yù)計的擴增片段分別約490、2 000、2 100、600 bp。如果引物H1和H2、F1和F2、F3和F4的PCR擴增結(jié)果均為陽性，且引物cat1-F和cat1-R的PCR擴增結(jié)果為陰性，就可確定該轉(zhuǎn)化子為cat1基因敲除突變體。PCR擴增采用2×Taq PCR master Mix試劑（TIANGEN），PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，31個循環(huán)；最后72 ℃延伸補齊7 min。

1.2.5 突變體表型觀察

（1）菌落形態(tài)觀察：在敲除突變體和野生菌的培養(yǎng)皿上打取Φ=5 mm的菌餅，分別接種于PDA和V8培養(yǎng)基上，每個菌株接種3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)6 d后拍照記錄。

（2）玻璃紙穿透實驗：分別從敲除突變體和野生型的菌落上打取菌餅倒貼至PDA平板中央，將半徑為4 cm的半圓形玻璃紙滅菌后貼在培養(yǎng)基上，并使其覆蓋住3/4的菌塊，3個重復(fù)，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d后拍照記錄。

（3）纖維素利用實驗：打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅分別接種于纖維素剛果紅培養(yǎng)基中，3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)，并拍照記錄。

（4）過氧化氫耐受性實驗：打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅，分別接種于含有不用濃度H2O2的PDA（0.1%、0.25%、0.5%）平板上，每個梯度做3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察菌圈大小，并拍照記錄。

（5）滲透壓脅迫實驗：打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅分別接種于不同濃度NaCl（1、2 mol/L）的PDA平板上，每個梯度做3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)，并拍照記錄。

（6）細胞壁選擇性壓力實驗：打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅分別接種于不同濃度山梨醇（1、2 mol/L）的PDA平板上，每個梯度做3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)，并拍照記錄。

1.2.6 致病性測定

（1）離體葉片實驗：將巴西蕉葉片用75%酒精消毒，并用無菌水沖洗晾干后，再用滅菌針在葉片正面葉脈上刺出傷口，分別打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅，接種在傷口處，使用蘸有無菌水的滅菌棉片覆蓋在接種的傷口上保濕，3個重復(fù)，確保每個重復(fù)使用同一片葉片。28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)，并拍照記錄。

（2）香蕉苗致病性實驗：選取長勢良好苗期相同的巴西蕉（株高約10 cm，有5～6片葉子），用滅菌針頭對香蕉苗的健康白色的根進行刮傷處理，分別打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅，接種在傷口處，同時接種PDA作為對照，并用保鮮膜固定。每株苗刮傷2～4個傷口，每個菌種接種10株巴西蕉。實驗重復(fù)3次。根據(jù)天氣和土壤條件適當(dāng)澆水。45 d后將球莖切開觀察拍照，并記錄每株幼苗發(fā)病級數(shù)[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

香蕉幼苗發(fā)病情況用病情指數(shù)表示：病情指數(shù)=[∑（發(fā)病級數(shù)×該級株樹）]/（最高級數(shù)×總株樹）×100。同時計算香蕉苗的發(fā)病率，公式如下：發(fā)病率=（發(fā)病株樹/實驗測試總株數(shù)）×100%[12]。所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.02進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cat1基因敲除載體的構(gòu)建

從圖1-A可看出，用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和ApaⅠ對pCT74-A克隆載體進行酶切，可切下約900 bp的DNA條帶，即同源臂A；用EcoRⅠ和SpeⅠ對A-pCT74-B敲除載體進行酶切，可切下1 500 bp的DNA條帶，即同源臂B。以A-pCT74-B敲除載體為模版，用引物cat1-AF和cat1-BR進行PCR擴增，擴增出一條5 000 bp左右的DNA條帶（圖1-B），與預(yù)計的條帶大小相符，且測序結(jié)果表明克隆的DNA序列正確。上述結(jié)果表明cat1基因敲除載體構(gòu)建成功。

2.2 cat1敲除突變體的PCR鑒定

轉(zhuǎn)化共獲得10個轉(zhuǎn)化子，并在含有潮霉素抗性的PDA平板上再生培養(yǎng)后，隨機選取其中6個轉(zhuǎn)化子進行PCR擴增鑒定。以其基因組DNA為模板，分別用4對引物（H1和H2、F1和F2、F3和F4、cat1-F和cat1-R）進行PCR擴增鑒定（圖2-A）。用H1和H2引物對進行PCR擴增，結(jié)果顯示6個轉(zhuǎn)化子和pCT74對照均能擴增出一條約490 bp的目的條帶，野生型基因組DNA和清水對照均無條帶（圖2-B）。用cat1-F和cat1-R引物對進行PCR擴增，2號和4號轉(zhuǎn)化子及清水對照均未擴增出條帶，其他的轉(zhuǎn)化子和野生型基因組DNA均能擴出一條600 bp左右的DNA條帶（圖2-C）。用F1和F2引物對進行PCR擴增，2～6號轉(zhuǎn)化子均能擴增出一條2 000 bp左右的DNA條帶，1號轉(zhuǎn)化子、野生型基因組DNA和清水對照均無條帶；用F3和F4引物對進行PCR擴增，1～6號轉(zhuǎn)化子均能擴增出一條2 100 bp左右的DNA條帶，野生型和清水對照均無條帶（圖2-D）。綜上所述，可確定2號和4號轉(zhuǎn)化子均為cat1基因敲除突變體。

2.3 cat1敲除突變體的表型觀察

選取2號轉(zhuǎn)化子作為cat1基因敲除突變體（即敲除子Δcat1）進行表型觀察。

2.3.1 菌落形態(tài)觀察 在激光共聚焦顯微鏡480 nm激發(fā)光下，Δcat1的孢子和菌絲均能夠發(fā)出強而穩(wěn)定的綠色熒光（圖3-A），說明GFP蛋白在細胞中呈現(xiàn)組成型表達。對Δcat1在PDA平板上的生長觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Δcat1的長勢稍慢一些，但并無明顯差異；在V8培養(yǎng)基上，Δcat1和野生型長勢相同；兩者在PDA培養(yǎng)基上的菌落均以平鋪為主，而在V8培養(yǎng)基上菌絲則呈現(xiàn)簇立狀（圖3-B）。

2.3.2 玻璃紙穿透實驗 用玻璃紙可替代植物細胞壁來評測病原菌的穿透能力。野生型菌株可透過玻璃紙正常生長，而Δcat1則幾乎不能透過玻璃紙生長（圖3-C）。說明cat1基因的敲除能夠大大減弱野生型菌株的穿透能力。

2.3.3 纖維素利用實驗 在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，Δcat1的菌絲相對于野生型明顯薄很多（圖3-D）。Δcat1利用纖維素的能力明顯降低，顯示cat1基因可能在Foc4纖維素利用的相關(guān)途徑中起作用。

2.3.4 過氧化氫耐受性實驗 在0.1% H2O2的PDA平板上，Δcat1和野生型菌株的形態(tài)和大小均無明顯差異；在0.25% H2O2的濃度下，Δcat1開始表現(xiàn)出與野生型菌株的差異，菌落大小明顯小于野生型菌株；而在0.5% H2O2濃度下，Δcat1幾乎不能生長，而野生型菌株卻還能生長（圖3-E）。Δcat1對H2O2敏感性的增加，說明cat1基因?qū)oc4野生型菌株對抗外源氧化脅迫非常重要。

2.3.5 滲透壓脅迫實驗 在1 mol/L和2 mol/L NaCl的PDA平板上，Δcat1和野生型均表現(xiàn)出一致的長勢。兩者均在2 mol/L NaCl的濃度下生長受到明顯的抑制（圖3-F）。

2.3.6 細胞壁選擇性壓力實驗 在含有不同濃度山梨醇的PDA平板上生長5 d后，Δcat1和野生型的菌落均沒有明顯的差別（圖3-G）。

2.4 cat1敲除突變體的致病性測定

2.4.1 離體葉片實驗 在香蕉的離體葉片正面葉脈接種5 d后，野生型在離體葉片上能形成較大面積的褐色病斑，且葉片背面有較多菌絲定殖；而Δcat1形成的病斑明顯小許多，且背面只有少數(shù)菌絲定殖（圖4-A）。這說明Δcat1的定殖能力大大減弱。

2.4.2 香蕉苗致病性實驗 利用巴西蕉盆栽苗對Δcat1進行致病性測定。接種培養(yǎng)45 d后觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種野生型菌株的巴西蕉苗葉片表現(xiàn)出嚴(yán)重黃化枯萎現(xiàn)象，植株的葉片大面積黃化，且切開球莖觀察到球莖部位褐化程度嚴(yán)重，發(fā)病癥狀達到了4～5級；而接種Δcat1菌株的巴西蕉苗葉片則表現(xiàn)出輕微的黃化現(xiàn)象，葉片頂部及邊緣出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，切開球莖觀察，發(fā)現(xiàn)球莖有黃線，發(fā)病癥狀約在2～3級；接種PDA的對照巴西蕉苗均沒有出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象，且球莖發(fā)病癥狀為0級，無癥狀（圖4-B、圖4-C）。根據(jù)病情指數(shù)和發(fā)病率數(shù)據(jù)統(tǒng)計，接種Δcat1菌株的巴西蕉植株平均病情指數(shù)（37.4）和發(fā)病率（53.3%）低于野生型菌株的平均病情指數(shù)（62.9）和發(fā)病率（80%）（圖5）。這表明cat1缺失突變體對巴西蕉的致病性減弱。

3 討論

活性氧迸發(fā)是植物對病原菌的入侵產(chǎn)生的最明顯的早期防御反應(yīng)之一[13]。 當(dāng)病原真菌入侵植物寄主時，植物會通過有氧呼吸和代謝等產(chǎn)生大量的活性氧，對病原真菌造成氧化脅迫。而病原真菌存在一至幾種抗氧化系統(tǒng)，可逃避來自寄主細胞的活性氧簇的殺害。在真菌中，過氧化氫酶被認(rèn)為是植物和病原菌互作過程中幫助病原菌消除寄主分泌的活性氧物質(zhì)的重要成分[14]。

多數(shù)植物病原真菌含有一至數(shù)個過氧化氫酶[15]。新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）的4個過氧化氫酶（Cat1、Cat2、Cat3、Cat4）在對抗內(nèi)外源性的氧化脅迫時，能有相互功能性地重疊和互補[16]。煙曲霉中cat1基因編碼的Cat1P過氧化氫酶參與體外過氧化氫的消除，且能與其他的cat基因一起作用，短暫地保護真菌免受寄主的防御反應(yīng)活性氧迸發(fā)的傷害[17]。粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中的cat1主要存在孢子中，相比其他的過氧化氫酶更耐高溫，且具有良好的鹽堿穩(wěn)定性，還可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧濃度而使細胞抗氧化[18]。有報道稻瘟病菌catB突變株對大麥的致病力嚴(yán)重減弱，且對H2O2非常敏感，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)catB在增強真菌細胞壁方面扮演著重要的角色，對真菌能夠強有力地入侵寄主起到很大的作用[19]。

在Foc4中，齊興柱等[20]研究發(fā)現(xiàn)catA和catC在H2O2誘導(dǎo)下上調(diào)表達。但catP2基因缺失突變體對外源氧化脅迫不敏感[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oc4中的cat1基因敲除突變體玻璃紙穿透能力下降，對H2O2的敏感性增加，且在香蕉葉片的定殖能力大大減弱，對巴西蕉的致病性明顯減弱，推測cat1能夠透過消除寄主分泌的活性氧物質(zhì)來參與病原菌對外源氧脅迫的反應(yīng)，從而參與Foc4的致病過程。這與Foatf1基因的功能相似[3]，他們之間可能存在某些聯(lián)系。但cat1與其他幾個cat之間的關(guān)系及其調(diào)控機制及其在病原菌致病性中的具體機理還有待進一步研究。

同時，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)Δcat1對纖維素的利用能力明顯降低。過氧化氫酶能夠通過共價修飾綁定到纖維素[22]，但具體如何影響菌株對纖維素的利用，或者是cat1在Foc4的纖維素利用調(diào)控途徑中起著某種作用，還需進一步研究。

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