家兔Myh7基因生物信息學(xué)分析及表達(dá)規(guī)律研究

趙斌 李挺 趙博昊 穆琳 胡帥帥 陳陽 吳信生

摘要[目的]對(duì)家兔Myh7基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)規(guī)律研究。[方法]利用RT-PCR技術(shù)檢測了Myh7在肌肉發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，并結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)家兔Myh7的序列進(jìn)行深入分析。[結(jié)果]Myh7蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，有Myosin_N和MYSc_class_II這2個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域，其中MYSc_class_II是肌球蛋白重鏈家族特有結(jié)構(gòu)域。MEGA軟件分析家兔Myh7分子進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)其與人、猩猩等物種間同源性較高，與其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近一致。定量分析顯示：在整個(gè)肌肉發(fā)育過程中，Mhy7表達(dá)量在腿肌中基本維持在較低水平，在背肌中的表達(dá)量相對(duì)波動(dòng)較大，而在11周齡時(shí)出現(xiàn)表達(dá)量上升的趨勢(shì)。[結(jié)論]該研究為進(jìn)一步研究Myh7基因在肌肉生長過程中的功能奠定了分子基礎(chǔ)，為研究家兔的肌肉發(fā)育分子機(jī)制提供了一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞兔；肌肉；Mhy7基因；生物信息學(xué)分析；表達(dá)規(guī)律

中圖分類號(hào)S829.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）16-0130-03

Bioinformatics Analysis and Expression Characteristics of Myh7 Gene in Rabbit

ZHAO Bin，LI Ting，ZHAO Bohao，WU Xinsheng* et al（

Jiangsu Key Laboratory of Animal Genetics & Breeding and Mdecular Designing，College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract[Objective]Bioinformatics analysis and expnession characteristics of Myh7 gene in rabbit were studied.[Method]The expression characteristics of Myh7 was detected by RTPCR technique in the process of muscle development，and we further used bioinformatics methods to analyze rabbit Myh7 sequence.[Result]Myh7 protein was unstable and hydrophilic，with the Myosin_N and MYSc_class_II structure domain，MYSc_class_II was the special structure domain of myosin heavy chain.We used MEGA software to analyze Myh7 molecular evolution of rabbit，the result showed that homology was high among rabbit，human and orangutan，which was conforming to the kinship.Quantitative analysis showed that Mhy7 in leg muscle expressed in the low level，and the expression was fluctuant in the back muscle，increased in 11th week old rabbit.[Conclusion] The study provided the molecular basis for exploring the Myh7 gene function in the process of muscle growth，and it could also provide certain reference basis for studying the molecular mechanism of rabbit muscle development.

Key wordsRabbit；Muscle；Mhy7 gene；Bioinformatics analysis；Expression characteristics

兔肉是一種具有高營養(yǎng)價(jià)值的肉類，其含有高氨基酸、高卵磷脂、高蛋白和低膽固醇等，在心腦血管病、肝病、糖尿病患者中較受歡迎。肌肉發(fā)育過程影響著兔肉的產(chǎn)量和質(zhì)量，肌肉發(fā)育包含胚胎期肌纖維的形成、肌纖維的發(fā)育和成年期肌肉的再生等，此發(fā)育過程受到許多基因的相關(guān)調(diào)控。目前，在人和小鼠上已發(fā)現(xiàn)在成肌定向分化早期，Myf5基因和MyoD基因起著關(guān)鍵作用[1]；肌肉干細(xì)胞最終分化為肌管肌纖維的能力與Mrf4基因和MyoG基因調(diào)控密切相關(guān)[2]，這些基因都屬于成肌調(diào)節(jié)因子基因家族。除此之外，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子基因家族、Wnt基因家族也是能直接調(diào)控肌肉發(fā)育的一類家族基因[3-4]。筆者所在課題組前期通過Agilent兔全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選出肌肉中具有差異表達(dá)的基因，在這些差異表達(dá)的基因中，發(fā)現(xiàn)Myh7基因與新西蘭白兔肌肉的生長發(fā)育密切相關(guān)。該研究利用生物信息學(xué)分析方法，對(duì)Myh7基因的理化性質(zhì)和進(jìn)化進(jìn)行了分析和預(yù)測，同時(shí)利用RT-PCR方法檢測不同部位不同時(shí)期肌肉中Myh7基因的表達(dá)規(guī)律，旨在探究Myh7基因在肌肉發(fā)育過程中作用，為研究家兔的肌肉發(fā)育分子機(jī)制提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑采集1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23周齡新西蘭白兔背部和腿部肌肉，公母各1/2，分別取0.5 g 置于無酶管中，液氮凍存帶回實(shí)驗(yàn)室-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量試劑盒（CW0956A）、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒（CW0741A）等購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；上海生工生物工程有限公司提供DNA marker系列、無水乙醇等常規(guī)試劑；RNAstore樣本保存液購自TIANGEN公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析。

蛋白的氨基酸序列組成等理化性質(zhì)采用ProtParam軟件進(jìn)行分析，基因編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)通過ExPASy工具對(duì)進(jìn)行分析，運(yùn)用NCBI的CDD軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測Myh7蛋白結(jié)構(gòu)域；氨基酸序列的親水性分析通過ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行，運(yùn)用MEGA軟件分析Myh7蛋白分子進(jìn)化；運(yùn)用TMPRED（http：//www.ch.embnet.org/software/）分析預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PSORT II Prediction（http：//www.psort.org/）對(duì)Myh7的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.2總RNA提取及cDNA 合成。

用傳統(tǒng) Trizol 法提取樣品的總RNA，分光光度計(jì)測定總 RNA 的純度和濃度，立即對(duì)提取后的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取0.5 mL Ependorf 管，以總RNA 提取液2 μg為模板， oligo d（T）為反轉(zhuǎn)錄引物，在反轉(zhuǎn)錄酶 M-M LVRT 作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為25 μL。

1.2.3RT-PCR法對(duì)Mhy7基因表達(dá)差異進(jìn)行檢測。根據(jù)已報(bào)道的Mhy7基因cDNA 部分序列設(shè)計(jì)引物，該引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息見表1。北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供熒光定量PCR預(yù)混體系，表達(dá)水平以GAPDH基因作為內(nèi)參進(jìn)行均一化處理。

2結(jié)果與分析

2.1家兔Mhy7的生物信息學(xué)分析

2.1.1家兔Mhy7蛋白理化性質(zhì)分析。

根據(jù) GenBank 上已發(fā)表的家兔的Myh7基因序列可知，家兔的Myh7基因全長20 869 bp。其中，編碼序列由5 808個(gè)堿基組成，編碼1 935個(gè)氨基酸殘基，是一個(gè)較為保守的基因。經(jīng)ProtParam在線軟件預(yù)測，分子式為C9 722H15 810N2 772O3 090S66，原子總數(shù)為31 460個(gè)，分子量為223 087.1 ku，理論等電點(diǎn)為5.61。在所有編碼氨基酸中，Glu （E）含量最高，為13.2%，Trp （W） 只占0.5%（表2）。帶負(fù)電荷殘基的總數(shù)量（ASP + Glu）：359，帶正電荷殘基的總數(shù)量（Arg+Lys）：315，不穩(wěn)定指數(shù)是47.38，說明這個(gè)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。

由圖1可知，Myh7蛋白疏水性最小值為-3.111，最大值為2.189。其主要親水平均數(shù)（GRAVY）值是-0.421，因此Myh7蛋白為親水蛋白。Myh7主要分布在細(xì)胞核（69.6 %）中，少量定位在細(xì)胞質(zhì)中（17.4 %），說明Myh7主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.1.2家兔Myh7蛋白的分子進(jìn)化分析。

將人、豬、牛、羊、馬、猩猩、貓、狗、小鼠、雞的Myh7基因編碼蛋白及兔Myh7蛋白序列調(diào)入MEGA中，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。由圖2可知，進(jìn)化樹總體分為兩支，家禽雞本身獨(dú)立成為一支，其余的10個(gè)物種成立為一個(gè)獨(dú)立大分支，而家兔Myh7基因與人、猩猩Myh7基因的分子進(jìn)化距離最近，親緣關(guān)系最近。

2.1.3家兔Mhy7保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析。

1 935個(gè)氨基酸由家兔Mhy7基因的CDS區(qū)編碼，利用NCBI在線工具CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示：Myh7蛋白有2個(gè)特殊的區(qū)域，N端34～75 aa區(qū)段為Myosin_N結(jié)構(gòu)域，79～799 aa區(qū)段為MYSc_class_II結(jié)構(gòu)域。其中N端的Myosin_N區(qū)是肌凝蛋白SH3樣結(jié)構(gòu)域，而MYSc_class_II區(qū)由2個(gè)重鏈組成，頭和尾域的卷曲螺旋把2個(gè)重鏈結(jié)合在一起，它有ATP的結(jié)合位點(diǎn)和P環(huán)結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.1.4家兔Mhy7蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。

對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析有助于認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)主要是多肽鏈主鏈骨架中局部的構(gòu)象[5]。使用TMPRED和Swiss-Model軟件分別對(duì)家兔Myh7的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測發(fā)現(xiàn)Myh7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，其中α螺旋（h）74.94%，無規(guī)卷曲（c）19.17%，延伸鏈（e）5.89%；而Myh7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)由2條互相交織程度不明顯、較為簡單且長度不等的螺旋鏈組成，呈現(xiàn)出鏈狀分布，該蛋白與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致（圖4）。

2.2不同生長階段Mhy7基因表達(dá)規(guī)律

分析新西蘭白兔在生長發(fā)育不同階段背、腿肌Myh7基因的表達(dá)規(guī)律，從圖5可以看出，背肌中Myh7的表達(dá)量在1～23周齡這一生長發(fā)育時(shí)期，所呈現(xiàn)出的波動(dòng)較大，而在腿肌中Myh7基因的表達(dá)量基本處在較低水平；1～9周齡Myh7基因在背肌中的表達(dá)量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，11周齡Myh7基因的表達(dá)量在腿肌中開始出現(xiàn)上升趨勢(shì)；而腿肌中的表達(dá)量在13周齡以后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，最后維持在較低水平，Myh7基因在背肌中表達(dá)量相對(duì)于腿肌而言總體偏高，且呈現(xiàn)出不規(guī)則變化。

3討論

肌肉的生長發(fā)育包含胚胎期肌纖維的形成、出生后肌纖維的發(fā)育和成年期肌肉的再生等步驟，是一個(gè)復(fù)雜的過程。從整體上看，整個(gè)過程伴隨大量的調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄組水平和通路水平等多層次的調(diào)控，為成肌始祖細(xì)胞發(fā)育成為適應(yīng)各種生命過程的終末肌纖維提供保障。這些調(diào)控包含成肌調(diào)節(jié)因子、miRNA、表觀遺傳、肌肉生長抑制素、GH-IGFs通路、Wnt/β-catenin 通路等[6]。

Myh7基因是肌球蛋白重鏈家族基因中的一員，肌球蛋白重鏈家族基因在肌肉的生長發(fā)育中扮演重要角色，通過前期差異表達(dá)基因篩選，發(fā)現(xiàn)Myh7基因與新西蘭白兔肌肉發(fā)育密切相關(guān)。已有研究表明，Myh7基因的突變能夠引發(fā)人類肥厚型心肌病，30%～50%的家族性肥厚型心肌病由Myh7基因的突變所致[7-9]。王虎等[10]對(duì)一個(gè)中國人肥厚型心肌病家族進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該病與Myh7基因的第14號(hào)外顯子雜合突變c.1273G>A相關(guān)，且攜帶者的臨床表型存在明顯差異。Myh7基因nt2025C插入和nt2013c缺失被楊春等[11]在一家族中發(fā)現(xiàn)，屬國內(nèi)罕有的移碼突變，與該家族肥厚型心肌病患者中存在的致病基因的突變相關(guān)。楊忠偉等[12]對(duì)3個(gè)HCM家族成員進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在1個(gè)家族中，

Myh7基因14外顯子存在Thr441Met突變，該突變首次在我國被發(fā)現(xiàn)。故可以通過Myh7基因突變的篩查使提前知曉家族性肥厚型心肌病病變的存在成為可能。

該試驗(yàn)通過生物信息學(xué)方法對(duì)家兔Myh7基因進(jìn)行分析研究， 結(jié)果表明Myh7蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，有MYSc_class_II和Myosin_N這2個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域，其中MYSc_class_II是肌球蛋白重鏈家族特有結(jié)構(gòu)域。通過MEGA軟件對(duì)家兔Myh7蛋白進(jìn)行分子進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)家禽雞單獨(dú)成一個(gè)分支，而家兔與人、猩猩等物種間同源性較高，與其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近相一致。利用RT-PCR方法研究了1～23周齡不同生長階段背、腿肌Mhy7基因的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示，Mhy7基因在家兔整個(gè)生長發(fā)育時(shí)期因不同部位表現(xiàn)出不完全一致的表達(dá)規(guī)律，其在腿肌中的表達(dá)量基本處在較低的水平；而在背肌中，Mhy7基因的表達(dá)量波動(dòng)較大，提示Myh7基因在背肌中的調(diào)控作用更大。在11周齡時(shí)出現(xiàn)明顯上升，此時(shí)背肌和腿肌中Myh7基因的表達(dá)量均有上升。該研究初步探索了Mhy7基因在肌肉發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，并結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行探究，能為研究家兔的肌肉發(fā)育分子機(jī)制提供一定的參考依據(jù)。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

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