亞牛磺酸對(duì)南美白對(duì)蝦多酚氧化酶活性及酶構(gòu)象的影響

周雅琪，黃佳茵，陳美玉，葛雨珺，李 苑，胡亞芹,*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品研究院，智能食品加工技術(shù)與裝備國(guó)家（地方）聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué)寧波研究院，浙江 杭州 315100）

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）是占全球水產(chǎn)養(yǎng)殖蝦產(chǎn)量80%的重要商品蝦[1]，黑變會(huì)嚴(yán)重影響其感官品質(zhì)和貨架期。蝦體內(nèi)酶促褐變的關(guān)鍵酶多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）會(huì)催化無色酚形成有色醌，再通過非酶促褐變形成不溶性黑色素[2]。傳統(tǒng)抑制對(duì)蝦黑變的方法主要是采用低溫和化學(xué)保鮮劑，最常用的化學(xué)保鮮劑就是亞硫酸鹽。亞硫酸鹽是無機(jī)鹽，易分解產(chǎn)生二氧化硫殘留在食品中，容易導(dǎo)致食用者發(fā)生過敏以及哮喘反應(yīng)，在美國(guó)和歐盟國(guó)家已被禁止使用[3]。因此，研究亞硫酸鹽替代品，尋求天然、安全、高效的防對(duì)蝦黑變抑制劑對(duì)于保障食品安全、提高對(duì)蝦的商業(yè)效益具有重要意義。目前一些化學(xué)和天然的食品保鮮劑已經(jīng)被研究作為對(duì)蝦的抗黑變劑，化學(xué)合成的如4-己基間苯二酚、阿魏酸、固載二氧化氯，以及石榴提取物、腰果提取物、葡萄籽提取物等天然獲得的物質(zhì)，均可通過抑制PPO活性減緩對(duì)蝦的黑變[4]。

由于酶的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此近年來除研究黑變抑制劑對(duì)酶活性的抑制作用，其對(duì)酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響也被深入探究。如Xiong Shangling等[5]通過抑制動(dòng)力學(xué)與分子動(dòng)力學(xué)研究了鄰苯三酚對(duì)酪氨酸酶活性和結(jié)構(gòu)的抑制作用，Zhou Lei等[6]研究了超聲波與蘋果酸的協(xié)同作用對(duì)蘑菇PPO活性和構(gòu)象的影響，Hridya等[7]研究了花青素3-槐糖苷對(duì)PPO的抑制機(jī)理及其對(duì)蘋果酶促褐變的影響，劉琦琦[8]研究了香豆素類物質(zhì)對(duì)PPO的抑制機(jī)理及酶構(gòu)象的影響，這些研究都有助于在分子水平上進(jìn)一步研究PPO，從而為有效抑制酶活提供思路。

亞?；撬幔╤ypotaurine，HTU）作為一種生物保鮮劑而受到關(guān)注。它是生物體內(nèi)廣泛存在的一種天然產(chǎn)物，可以從貽貝、牡蠣、文蛤、章魚、魷魚等海洋生物中提取獲得，也是人體內(nèi)半胱氨酸代謝為牛磺酸的中間體。Schulbach等[9]通過對(duì)藍(lán)貽貝中發(fā)現(xiàn)的酶促褐變的抑制劑進(jìn)行液相色譜和質(zhì)譜鑒定，率先發(fā)現(xiàn)了HTU的抗黑變效果。Zhang Ying等[10]研究了HTU對(duì)桃保鮮效果的影響，發(fā)現(xiàn)HTU可以延緩貯藏期間桃果實(shí)的成熟。由于HTU具有PPO的抑制活性，目前在果蔬防黑保鮮領(lǐng)域中已經(jīng)被使用，如HTU能明顯抑制桃[11]、山藥[12]等的褐變，顯示出了良好的護(hù)色保鮮效果。HTU在水產(chǎn)品中廣泛存在，且其在人體內(nèi)終產(chǎn)物為牛磺酸，具有方便獲得和無毒無害的優(yōu)點(diǎn)，之前研究也表明其對(duì)果蔬的抗酶促褐變具有很好的效果，但在水產(chǎn)領(lǐng)域特別是對(duì)南美白對(duì)蝦PPO活性的抑制及酶結(jié)構(gòu)的影響鮮見報(bào)道，對(duì)其抗黑變效果和機(jī)制也尚不明確。本研究旨在對(duì)南美白對(duì)蝦PPO進(jìn)行分離純化，研究HTU對(duì)其活性和結(jié)構(gòu)的影響，為從分子水平上進(jìn)一步研究南美白對(duì)蝦PPO抑制劑的安全高效使用提供參考依據(jù)，同時(shí)也為將HTU應(yīng)用于南美白對(duì)蝦的保鮮提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的南美白對(duì)蝦購(gòu)于浙江杭州駱家莊農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，其養(yǎng)殖產(chǎn)地為浙江舟山，挑選無病害，有活力質(zhì)量大小為（12f 1）g左右的對(duì)蝦，經(jīng)保氧運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并在冰中猝死后放于-80 ℃冰箱備用；HTU 美國(guó)Sigma公司。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、5×蛋白質(zhì)加樣緩沖液、Real Band蛋白預(yù)染Marker、高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒、8-苯胺-1-萘磺酸（8-(phenylamino)naphthalene-1-sulfonic acid，ANS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；左旋多巴（levodopa，L-DOPA）、SDS、十二烷基聚乙二醇醚（Brij35）、甘氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；EPS300電泳儀 上海天能科技有限公司；J-1500型高性能圓二色光譜儀 佰泰科技有限公司；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技有限公司；TGL20M型低溫冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO的粗提取和活性測(cè)定

根據(jù)Simpson等[13]的方法，并略作修改。采用Lowry等[14]的方法測(cè)定粗酶的蛋白濃度。

1.3.2 HTU對(duì)PPO處理前后最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

在離心管中加入0.4 mL的粗酶液，1.0 mL濃度為15 mmol/L的L-DOPA以及1.6 mL 0.05 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液。37 ℃水浴反應(yīng)3 min，用紫外分光光度計(jì)在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)每隔2 min進(jìn)行掃描直至10 min，確定產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)。再按上述方法，測(cè)定經(jīng)質(zhì)量濃度分別為1、5、10、15、20 g/L的HTU溶液處理后酶液的波長(zhǎng)，檢測(cè)其產(chǎn)物吸收峰。

1.3.3 HTU對(duì)PPO活性抑制率的測(cè)定

將100 μL不同質(zhì)量濃度的HTU溶液與100 μL PPO粗提取物混合，在室溫下反應(yīng)30 min。將400 μL 0.05 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液、100 μL去離子水以及600 μL 15 mmol/LL-DOPA的溶液加入引發(fā)反應(yīng)，在37 ℃反應(yīng)3 min后通過紫外分光光度計(jì)記錄475 nm波長(zhǎng)處的吸光度的變化。酶活性定義：每毫升酶液每分鐘在475 nm波長(zhǎng)下吸光度增加0.001為1 U。通過從反應(yīng)混合物中分別排除底物和酶制備酶和底物空白，并使用去離子水代替。用去離子水代替HTU作為對(duì)照，以相同的方式進(jìn)行。PPO抑制活性用抑制率表示，計(jì)算公式如下：

式中：A為對(duì)照的PPO活性；B為加入HTU后的PPO活性。

1.3.4 HTU對(duì)PPO的抑制機(jī)理

配制不同質(zhì)量濃度的HTU溶液，在0.05 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中固定加入0.1 mL HTU，再加入不同量的酶液，混合30 min后，加入1.0 mL 15 mmol/LL-DOPA，每隔30 s記錄一次475 nm波長(zhǎng)處吸光度，共測(cè)定5 min，計(jì)算酶促反應(yīng)速率代表酶活性。以HTU作用后的酶活性對(duì)酶濃度作圖，測(cè)定不同HTU質(zhì)量濃度下，酶濃度增加時(shí)酶促反應(yīng)速率的變化。

1.3.5 HTU對(duì)PPO的抑制類型與抑制常數(shù)的測(cè)定

配制不同質(zhì)量濃度的HTU溶液，在離心管中加入1.6 mL 0.05 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液與0.3 mL酶液，以及0.1 mL不同質(zhì)量濃度的HTU，混合30 min后加入1.0 mL不同濃度（2、4、6、8、10 mmol/L）的L-DOPA，計(jì)算酶促反應(yīng)速率。通過以L-DOPA濃度的倒數(shù)為橫軸，酶促反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱軸，進(jìn)行Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，判斷HTU的抑制類型。

1.3.6 SDS-PAGE測(cè)定

按照Laemmli[15]方法對(duì)南美白對(duì)蝦中PPO粗提物進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定。將提取物與不同質(zhì)量濃度的HTU溶液反應(yīng)30 min后，與5×蛋白質(zhì)加樣緩沖液以1∶1的體積比混合。制備6%分離膠和5%濃縮膠，樣品和Marker的加樣量分別為20 μL和5 μL。采用恒壓電源先80 V跑0.5 h，再120 V進(jìn)行約1.5 h。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)R-250中染色，用25%甲醇和10%乙酸溶液進(jìn)行脫色。選擇Real Band蛋白Marker估計(jì)蛋白的表觀分子質(zhì)量。

1.3.7 圓二色譜的測(cè)定

參考Yi Jianyong等[16]的方法并作修改，取200 μL PPO樣品及與不同質(zhì)量濃度的HTU溶液反應(yīng)后的PPO置于樣品池后立即掃描，掃描波長(zhǎng)為280～190 nm，掃描速度為50 nm/min，帶寬1 nm，在室溫下重復(fù)掃描3 次，取平均值。圓二色譜數(shù)據(jù)用平均橢圓率表示，單位為（mdegg cm2）/dmol。PPO質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，采用Dichroweb網(wǎng)站的SELCON 3算法計(jì)算PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.8 表面疏水性的測(cè)定

參考Kobayashi等[17]方法并略作修改，取不同質(zhì)量濃度HTU溶液處理過的PPO樣品4 mL，加入8 mmol/L的ANS溶液20 μL，置于4 ℃黑暗處15 min。在激發(fā)波長(zhǎng)374 nm、發(fā)射波長(zhǎng)范圍420～600 nm、縫寬5 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度和蛋白濃度作圖，曲線的初始斜率表示為表面疏水性指數(shù)。

1.3.9 熒光光度的測(cè)定

將不同質(zhì)量濃度HTU溶液處理過的PPO樣品放入熒光比色皿中，樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL，儀器激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)和發(fā)射縫均為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行后取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于所有參數(shù)，通過方差分析（ANOVA）確定差異顯著性，P＜0.05，差異顯著。使用Duncan的多范圍測(cè)試測(cè)定平均值的差異。數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性由Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行判斷。該分析由SPSS 21版軟件執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 南美白對(duì)蝦PPO的純化結(jié)果

通過對(duì)南美白對(duì)蝦的頭胸部進(jìn)行研磨、均質(zhì)、離心、鹽析和透析得到對(duì)蝦PPO粗酶液。王凌燕[18]研究了不同飽和度的鹽析方法下PPO的純化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用40%～75%飽和度的(NH4)2SO4進(jìn)行蛋白鹽析沉淀是較好的PPO提純方法，因此本實(shí)驗(yàn)采用40%的(NH4)2SO4進(jìn)行純化，通過對(duì)粗酶液進(jìn)行酶活性和蛋白濃度測(cè)定，得到酶活性為182.25 U/mL、蛋白質(zhì)量濃度為5.306 mg/mL、比活力為34.45 U/mg的PPO粗酶液用于后續(xù)酶活性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。其中磷酸鹽提取液中含有的Brij-35是一種可以提取膜蛋白的非離子表面活性劑，PPO作為一種含銅離子的膜蛋白酶，使用Brij-35可以提高得率[19]。

2.2 HTU對(duì)PPO活性抑制作用分析

圖1 HTU對(duì)PPO的抑制動(dòng)力學(xué)分析Fig.1 Kinetics of inhibition of PPO by HTU

通過紫外分光光度計(jì)研究HTU對(duì)PPO活性的影響，圖1A是未加抑制劑時(shí)，不同時(shí)間下PPO與酶底物L(fēng)-DOPA反應(yīng)的紫外光譜圖，由于PPO會(huì)催化L-DOPA形成多巴醌，進(jìn)而聚合形成黑色物質(zhì)，所以醌類物質(zhì)在可見光區(qū)有一定的吸收，可以發(fā)現(xiàn)在495 nm波長(zhǎng)處形成了一個(gè)特征峰，因此推測(cè)這可能是酶促反應(yīng)過程中形成的醌類物質(zhì)，且反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，形成的醌類物質(zhì)越多。圖1B、C分別是加入了HTU抑制劑后的光譜圖和光度圖，隨著抑制劑的加入，延緩了495 nm波長(zhǎng)處特征峰的上升，且質(zhì)量濃度越大上升的越慢。圖1D是HTU對(duì)PPO的活性抑制率，隨著HTU質(zhì)量濃度的增加，PPO活性的抑制率在前期呈現(xiàn)較慢的上升趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度在10～20 g/L時(shí)上升較快，其抑制率最高達(dá)到79.38%，其最大半數(shù)抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值為16.09 g/L。

綜上所述，HTU可以抑制PPO活性，且質(zhì)量濃度越高其抑制能力越強(qiáng)，推測(cè)其原因一可能是HTU與醌類物質(zhì)反應(yīng)形成了硫-醌復(fù)合物，阻礙了酶促反應(yīng)的進(jìn)行，另一種推測(cè)是HTU作為一種強(qiáng)還原劑，將形成的醌類物質(zhì)還原成酚，研究同時(shí)表明硫原子在抑制PPO活性中起到了極其重要的作用[20]。因此HTU對(duì)PPO活性的抑制能力很可能是減緩冷藏期間南美白對(duì)蝦中由PPO引起黑變現(xiàn)象的主要原因。

2.3 HTU對(duì)PPO的抑制作用

圖2 在不同質(zhì)量濃度HTU下PPO活性和酶量的關(guān)系Fig.2 Relationship between PPO activity and its concentration in the presence of different concentrations of HTU

如圖2所示，HTU質(zhì)量濃度越大，直線的斜率越小，表明其酶促反應(yīng)速率下降，且每條直線都穿過原點(diǎn)，推測(cè)HTU可能并未與PPO形成共價(jià)鍵，而是存在非共價(jià)的分子間相互作用。HTU與PPO的可逆結(jié)合抑制了其活性，酶量沒有減少，但酶活性下降。該結(jié)果表明HTU可能是PPO的可逆抑制劑，且此現(xiàn)象與用芹菜素[21]、槲皮素[22]對(duì)酪氨酸酶的抑制趨勢(shì)一致。

用Lineweaver-Burk圖確定HTU對(duì)PPO活性的抑制類型，如圖3所示，觀察到垂直軸截距（1/Vmax）和水平軸截距（-1/Km）的變化，5 條直線相交于Y軸上的一點(diǎn)，計(jì)算最大反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km），可以發(fā)現(xiàn)Vmax不變（2 mmol/（Lg min）），Km隨著HTU質(zhì)量濃度的增大而增大，因此推測(cè)HTU是一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。HTU對(duì)酶活性的影響可能是通過與酶進(jìn)行結(jié)合，而不與酶-底物的絡(luò)合物結(jié)合，根據(jù)HTU質(zhì)量濃度與米氏方程斜率的二次作圖，可得到HTU對(duì)PPO的抑制常數(shù)KI為0.445 mmol/L。研究表明曲酸、肉桂酸、含羞草素等都是PPO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和底物競(jìng)爭(zhēng)酶的結(jié)合位點(diǎn)，阻止底物和酶的結(jié)合，從而抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行，若是增加底物的濃度，則可以增大與酶活性位點(diǎn)結(jié)合的概率，從而緩解抑制劑對(duì)酶的抑制作用[23]。

圖3 HTU對(duì)PPO抑制作用的Lineweaver-Burk曲線（A）和米氏常數(shù)（B）Fig.3 Lineweaver-Burk curve (A) and inhibition constant (B) of HTU against PPO

2.4 SDS-PAGE分析

圖4 SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis

如圖4所示，通過對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)在凝膠上出現(xiàn)了PPO的單一蛋白條帶，通過遷移率對(duì)比，其分子質(zhì)量約為200 kDa，和Manheem等[24]測(cè)定的表觀分子質(zhì)量一致。據(jù)報(bào)道來自不同蝦的PPO具有不同的異構(gòu)體，分子質(zhì)量也會(huì)有所不同，例如深水粉紅蝦的PPO分子質(zhì)量為500 kDa和200 kDa，而白蝦的分子質(zhì)量為20 kDa和25 kDa[25]。圖中經(jīng)過不同質(zhì)量濃度HTU處理后PPO的條帶數(shù)目與位置并未發(fā)生明顯變化，推測(cè)HTU可能不是通過破壞PPO蛋白分子質(zhì)量和電泳特性而影響酶活力，該結(jié)果與4-羥基香豆素處理PPO時(shí)的電泳結(jié)果一致[8]。

2.5 圓二色譜結(jié)果分析

表1 不同質(zhì)量濃度HTU處理后對(duì)PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)比例的影響Table 1 Influence of different concentrations of HTU on secondary structure contents of PPO

酶結(jié)構(gòu)的輕微變化都可能導(dǎo)致其功能和性質(zhì)發(fā)生改變，本實(shí)驗(yàn)采用圓二色譜檢測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。如表1所示，利用Dichroweb網(wǎng)站計(jì)算了樣品中各結(jié)構(gòu)比例，PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由25.41%的α-螺旋和41.92%的無規(guī)卷曲組成。隨著HTU質(zhì)量濃度的增大，PPO的α-螺旋和β-折疊比例出現(xiàn)下降，而β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)卷曲的比例上升。有研究表明α-螺旋是通過肽鏈的羰基氧和氨基氫之間的分子內(nèi)氫鍵維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[26]，而α-螺旋比例的下降說明其結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。推測(cè)可能是HTU的加入，誘導(dǎo)了PPO蛋白的展開，使得α-螺旋的氫鍵遭到破壞，并促使α-螺旋和β-折疊向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲進(jìn)行轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致疏水基團(tuán)的暴露，使得酶的催化活性降低，且HTU的質(zhì)量濃度越高，蛋白的結(jié)構(gòu)破壞的越明顯。Anantharaman等[27]研究了類胡蘿卜素對(duì)酪氨酸酶構(gòu)象的影響，也發(fā)現(xiàn)酶的α-螺旋比例降低導(dǎo)致疏水性增強(qiáng)引起酶活性變化。呂艷芳等[28]在研究曲酸對(duì)南美白對(duì)蝦PPO構(gòu)象的影響的實(shí)驗(yàn)中也得到了相似的結(jié)論。因此推測(cè)HTU的加入，可能導(dǎo)致PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而引起了酶活性的降低。

2.6 表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性是表征蛋白構(gòu)象變化的重要指標(biāo)，它能夠反映蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸殘基的分布情況，而PPO作為一種酶蛋白，其表面疏水性的變化可能會(huì)引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而導(dǎo)致酶活性發(fā)生改變。如圖5所示，相比對(duì)照組的PPO，添加HTU能夠顯著增加PPO的表面疏水性（P＜0.05）。隨著HTU質(zhì)量濃度的增大，蛋白的表面疏水性在前期呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)HTU質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，其上升程度有所減緩。天然酶蛋白的疏水性殘基一般集中在螺旋的核心，因此PPO表面疏水性的增加表明HTU的處理導(dǎo)致了PPO蛋白結(jié)構(gòu)的展開，使得疏水性氨基酸暴露于蛋白的表面，酶分子之間聚集的程度下降，從而影響PPO的活性。而后續(xù)表面疏水性的上升程度減緩可能是由于更多的酶分子的疏水性基團(tuán)暴露，酶分子之間由于疏水相互作用而發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致了疏水性的上升減慢。Jia Na等[29]在研究蘆丁對(duì)蛋白的疏水性影響中也得出了類似的結(jié)論，同時(shí)這也與上述圓二色譜的結(jié)果相一致。綜上所述，HTU的加入能夠提高PPO的表面疏水性，這可能影響PPO的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響酶活性。

圖5 HTU對(duì)PPO表面疏水性的影響Fig.5 Effect of HTU on surface hydrophobicity of PPO

2.7 內(nèi)源熒光光譜分析

當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，蛋白質(zhì)中的色氨酸、酪氨酸殘基能夠發(fā)射熒光，因此對(duì)于蛋白質(zhì)周圍微環(huán)境的變化非常敏感，當(dāng)其他分子與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，蛋白質(zhì)的這些氨基酸殘基的內(nèi)源熒光強(qiáng)度也會(huì)受到影響，從而可以通過熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[30]。

圖6 HTU對(duì)PPO內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.6 Effect of HTU on endogenous fluorescence spectrum of PPO

如圖6所示，未加入HTU時(shí)，PPO具有較大的熒光強(qiáng)度和較短的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)（λmax），說明色氨酸等氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)的核心，酶蛋白處于折疊狀態(tài)。HTU的添加以質(zhì)量濃度依賴的方式降低了PPO內(nèi)源熒光強(qiáng)度，當(dāng)HTU質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，PPO的內(nèi)源熒光強(qiáng)度比原酶降低了29.85%。同時(shí)隨著HTU質(zhì)量濃度的增加，PPO的λmax顯示出了348.2～349.7 nm輕微紅移。這表明HTU與PPO相互作用后，蛋白質(zhì)發(fā)生解折疊，導(dǎo)致色氨酸等疏水性氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)的表面，暴露于親水環(huán)境中，使得氨基酸殘基周圍環(huán)境的極性增強(qiáng)，因此HTU的加入降低了PPO的熒光強(qiáng)度并使λmax發(fā)生紅移[16]。Liu Wei等[31]研究表明檸檬酸會(huì)導(dǎo)致蘑菇酪氨酸酶發(fā)生熒光猝滅，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)從341 nm紅移到344 nm。方志超等[32]對(duì)乳酸處理后的蘑菇酪氨酸酶構(gòu)象進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酶的最大峰值從346 nm移動(dòng)到353 nm。這些結(jié)論與HTU處理后PPO內(nèi)源熒光強(qiáng)度的改變類似，同時(shí)上述蛋白表面疏水性的增加也能證明PPO發(fā)生了解折疊，導(dǎo)致了疏水性基團(tuán)的暴露。因此可以推測(cè)HTU可能誘導(dǎo)PPO分子構(gòu)象發(fā)生部分去折疊，猝滅了其固有熒光，導(dǎo)致酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，從而使得酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，同時(shí)酶活性也隨之下降，表明酶構(gòu)象的變化可能影響了酶活性，兩者之間存在一定的相關(guān)性。

3 結(jié) 論

對(duì)南美白對(duì)蝦進(jìn)行分離純化，獲得了比活力為34.45 U/mg（182.25 U/mL）的PPO粗提液。研究表明HTU質(zhì)量濃度與PPO抑制活性呈正相關(guān)，說明HTU是PPO活性的有效抑制劑，當(dāng)HTU質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，其抑制率最高達(dá)到79.38%，IC50值為16.09 g/L。HTU對(duì)PPO活性的抑制屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制，其抑制常數(shù)KI為0.445 mmol/L。隨著HTU的加入，PPO分子質(zhì)量沒有發(fā)生顯著變化，圓二色譜結(jié)果表明酶的α-螺旋與β-折疊含量降低，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的含量略有增多，表明酶蛋白分子展開，導(dǎo)致了疏水性氨基酸殘基的暴露。表面疏水性的結(jié)果也證實(shí)了PPO的疏水性隨著HTU質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。內(nèi)源熒光光譜的結(jié)果說明HTU會(huì)導(dǎo)致酶發(fā)生熒光猝滅，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移。這些結(jié)果均說明HTU與PPO結(jié)合后，可能通過影響酶空間結(jié)果導(dǎo)致酶活性發(fā)生變化。