上海沿海地區(qū)蛭弧菌分離及其生長(zhǎng)條件研究

程俊茗 尹清干 賈丹 袁海蘭 董龍香 胡鯤 楊先樂

摘要：【目的】了解上海沿海地區(qū)蛭弧菌的分布狀況及其生物學(xué)特性，為蛭弧菌在防治水產(chǎn)動(dòng)物病害方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎秒p層瓊脂平板法對(duì)采自上海沿海地區(qū)不同水域環(huán)境中的蛭弧菌進(jìn)行分離，利用16S rRNA進(jìn)行鑒定，并對(duì)其裂解譜、鹽度耐受性、弧菌裂解差異性和培養(yǎng)方式進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】從上海沿海地區(qū)共分離到12株蛭弧菌，其中3株（4.2、5.1和3N.3）對(duì)弧菌屬具有很強(qiáng)的裂解性，但對(duì)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、脫氮副球菌、乳酸鏈球菌和保加利亞乳桿菌等有益菌無裂解作用。3株蛭弧菌在鹽度1.5%～3.0%的范圍內(nèi)生長(zhǎng)狀況良好，5.1蛭弧菌株對(duì)溶藻弧菌的裂解能力較對(duì)副溶血弧菌和哈維氏弧菌的強(qiáng)，其差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。宿主菌滅活可有效提高蛭弧菌的生長(zhǎng)速度及其濃度，在培養(yǎng)第60 h達(dá)峰值；蛭弧菌與宿主菌（大腸桿菌）經(jīng)異步發(fā)酵后，蛭弧菌在培養(yǎng)第72 h達(dá)峰值。【結(jié)論】從上海沿海地區(qū)分離獲得的蛭弧菌具有良好噬菌能力，對(duì)主要的海水致病菌和淡水致病菌均具有侵染裂解能力，對(duì)有益菌無殺滅效果，且具有廣鹽性特征，可用于蛭弧菌微生態(tài)制劑的研發(fā)。

關(guān)鍵詞： 蛭弧菌；鑒定；裂解譜；鹽度耐受性；裂解差異性；上海

中圖分類號(hào)： S963.211 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）03-0532-08

0 引言

【研究意義】蛭弧菌（Bdellovibrio）是一類以捕食細(xì)菌為生的革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于淡水、污水、沉淀物、土壤和植物根際（Jurkevitch et al.，2000），因其可裂解大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌和少數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌，對(duì)水體中的致病菌具有裂解作用，為水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌病的生物防治提供了新途徑（Fry and staples，1976；宋志萍等，2005）。此外，蛭弧菌基因組可編碼多種有毒物質(zhì)的抗阻蛋白，預(yù)示其有可能成為新型抗生素或消毒劑（蔡俊鵬和趙俊，2006）。蛭弧菌作為一種可裂解水體中致病菌的微生態(tài)制劑，能有效減少水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌病的發(fā)病率，降低藥物殘留和細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)，最終促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】蛭弧菌對(duì)致病菌的裂解作用使其具有巨大的潛在應(yīng)用前景。黃冬菊等（2002）研究表明，蛭弧菌對(duì)海水弧菌具有良好的清除作用； Pineiro等（2004）對(duì)蛭弧菌的宿主范圍進(jìn)行研究，證實(shí)蛭弧菌對(duì)沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、變形桿菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬、弧菌屬中的眾多菌株具有很強(qiáng)的裂解能力；韓韞等（2005）通過研究蛭弧菌對(duì)弧菌的裂解效果，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用4株蛭弧菌的裂解率高達(dá)93.8%；張呂平等（2009）研究表明，運(yùn)用噬菌蛭弧菌能有效預(yù)防對(duì)蝦的弧菌??；儲(chǔ)衛(wèi)華等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌能清除副溶血弧菌，降低因副溶血弧菌感染引起的對(duì)蝦死亡率，即蛭弧菌對(duì)對(duì)蝦感染副溶血弧菌有明顯的預(yù)防效果；黃亮等（2010）研究表明，蛭弧菌對(duì)牡蠣養(yǎng)殖水體和腸道中的副溶血弧菌具有清除作用；林阿乞等（2011）研究表明，將蛭弧菌應(yīng)用到九孔鮑養(yǎng)殖中，其生長(zhǎng)指標(biāo)和存活率均有顯著提高；Cao等（2012， 2015）研究發(fā)現(xiàn)蛭弧菌能夠控制霍亂弧菌和氣單胞菌；李麗等（2013）研究表明，純化的蛭弧菌不僅能夠裂解大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、弧菌等革蘭氏陰性菌，還能夠裂解無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然國內(nèi)市場(chǎng)上已有生產(chǎn)和銷售蛭弧菌制劑，但據(jù)溫崇慶等（2009）對(duì)蛭弧菌制劑的檢測(cè)結(jié)果顯示，絕大多數(shù)產(chǎn)品根本不存在蛭弧菌。本課題組曾采用PCR和傳統(tǒng)的平板法對(duì)26個(gè)蛭弧菌產(chǎn)品進(jìn)行蛭弧菌分離，也均未分離到蛭弧菌。因此，有必要進(jìn)一步探討環(huán)境因素（鹽度、宿主和發(fā)酵方式）對(duì)蛭弧菌生長(zhǎng)的影響，為提高蛭弧菌制劑的性能提供參考。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用雙層瓊脂平板法對(duì)上海沿海地區(qū)不同水域環(huán)境中的蛭弧菌進(jìn)行分離，探究其裂解譜、鹽度耐受性及弧菌裂解差異性，并采用液體培養(yǎng)法研究不同培養(yǎng)方式對(duì)蛭弧菌增菌效果的影響，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，以期為蛭弧菌在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

宿主菌株共24株，分別為大腸桿菌21（Escherichia coli）、大腸桿菌AB90054、哈維氏弧菌V-1-3120（Vibrio harveyi）、哈維氏弧菌B0150、霍亂弧菌B0165（V. cho-

lerae）、溶藻弧菌1833（V. alginolyticus）、副溶血弧菌0394（V. parahemolyticus）、鰻弧菌Van-DC12R90387（V. anguillarum）、熒光假單胞菌ATCC10646（Pseudomonas fluorescens）、腐敗假單胞菌0397（P. putrefaciens）、溫和氣單胞菌0398（Aeromonas sobria）、溫和氣單胞菌AB、嗜水氣單胞菌1.927（A. hydrophila）、嗜水氣單胞菌Sc-96-24、嗜水氣單胞菌Ah9802120388、金黃色葡萄球菌B0125（Staphylococcus aureus）、乳酸鏈球菌X13（Streptococcus lactis）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、納豆芽孢桿菌（B. natto）、脫氮副球菌ATCC-

19367（Paracoccus denitrificans）、釀酒酵母20034（Saccharomyces cerevisiae），均由國家水生動(dòng)物病原庫保存提供。細(xì)菌全基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，營養(yǎng)肉湯、瓊脂購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器設(shè)備：掃描電子顯微鏡（S3400N II）、PCR儀（GT9612）、培養(yǎng)箱（MIR253）、離心機(jī)（CF16R）和恒溫?fù)u床[BSD-YX（F）3200]。

1. 2 樣品采集

分別采集上海金山城市沙灘沿海（采樣點(diǎn)1）的海水40 mL及表層底泥20 g、上海崇明島富民農(nóng)場(chǎng)沿海（采樣點(diǎn)2）的海水40 mL及表層底泥20 g、上海蘆潮港沿海（采樣點(diǎn)3）的海水40 mL和上海炮臺(tái)濕地公園沿海（采樣點(diǎn)4）的海水40 mL及表層底泥20 g，樣品采集后冷藏（0～6 ℃）運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將水樣和底泥（以無菌海水稀釋）放入50 mL的離心管中，2000 r/min離心15 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆?。采樣站位分布如圖1所示。

1. 3 蛭弧菌分離純化與鑒定

采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法對(duì)處理過的水樣和泥樣進(jìn)行蛭弧菌分離，根據(jù)出斑時(shí)間及噬菌斑形狀純化蛭弧菌，采用錢天樂等（2009）的方法對(duì)蛭弧菌進(jìn)行電鏡觀察前處理；參照Marchesi等（1998）和Jurkevitch等（2000）的方法設(shè)計(jì)特異性引物，再以通用引物（5'-

CAGGCCTAACACATGCAACTC-3'）為上游引物、特異引物Bdg842R（5'-CGWCACTGAAGGGGTCAA-3'）

為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50.000 μL，其中，10×PCR Buffer（含1.5 mmol/L Mg2+）7.500 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.400 μL，Taq酶（2 U/μL）0.625 μL，上、下游引物各2.000 μL，DNA模板（10 ng/μL）5.000 μL，用DEPC處理水補(bǔ)足至50.000 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，產(chǎn)物送至上海邁浦生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 4 蛭弧菌裂解譜分析

選取24株宿主菌株，采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法對(duì)3株蛭弧菌進(jìn)行裂解譜分析。雙層瓊脂平板培養(yǎng)基下層為1.2%瓊脂（20 mL）、上層為0.8%瓊脂（10 mL），上層培養(yǎng)基加入3×1011 CFU/mL宿主菌懸液1 mL。宿主菌懸液的制備：用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)宿主菌株24 h，然后4500 r/min離心15 min，用0.85%生理鹽水洗滌菌體沉淀3次，最后將菌懸液濃度調(diào)至3×1011 CFU/mL，4 ℃冷藏備用。

1. 5 蛭弧菌鹽度耐受性分析

采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法，將蛭弧菌置于不同鹽度（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%）下培養(yǎng)，根據(jù)形成噬菌斑數(shù)量判斷蛭弧菌對(duì)鹽度的耐受性，并測(cè)定最佳生長(zhǎng)鹽度。

1. 6 蛭弧菌裂解差異性分析

選用不同宿主菌（溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌和大腸桿菌）對(duì)蛭弧菌株進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，以大腸桿菌為參照，根據(jù)形成的噬菌斑數(shù)量判斷蛭弧菌對(duì)宿主菌侵染裂解作用。噬菌斑形成數(shù)量越多，表明蛭弧菌對(duì)某一宿主的侵染裂解效率越強(qiáng)。

1. 7 培養(yǎng)方法對(duì)蛭弧菌生長(zhǎng)的影響

1. 7. 1 宿主菌滅活對(duì)蛭弧菌發(fā)酵的影響 宿主菌滅活培養(yǎng)法：制備好的大腸桿菌懸液90 ℃水浴滅活30 mim，滅活后的大腸桿菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至3×108 CFU/mL。將蛭弧菌以5%的接種量接入大腸桿菌懸液中，28 ℃下?lián)u床（140 r/min）培養(yǎng)，每隔12 h對(duì)蛭弧菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察記錄，直至96 h結(jié)束。宿主菌不滅活培養(yǎng)法：將新鮮的大腸桿菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至3×108 CFU/mL，除不進(jìn)行滅活處理外，其他處理同宿主菌滅活培養(yǎng)法。

1. 7. 2 發(fā)酵方式對(duì)蛭弧菌生長(zhǎng)的影響 營養(yǎng)肉湯同步發(fā)酵培養(yǎng)法：將大腸桿菌菌液和蛭弧菌液均以5%的接種量同時(shí)接入無菌營養(yǎng)肉湯，28 ℃下?lián)u床（140 r/min）培養(yǎng)。營養(yǎng)肉湯異步發(fā)酵培養(yǎng)法：將大腸桿菌先接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)至3×108 CFU/mL后，再以5%的接種量將蛭弧菌液接入大腸桿菌懸液中，28 ℃下?lián)u床（140 r/min）培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 蛭弧菌的分離鑒定結(jié)果

從4個(gè)采樣點(diǎn)的水樣和泥樣中共分離獲得12株分離菌株，分別命名為5.1、4.2、3N.3、L5.3、C7.2、Y4.1、X1.1、Y4.5、L6.1、8.5、8.1和6.3。經(jīng)PCR擴(kuò)增其16S rRNA序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12株分離菌株均在800 bp附近出現(xiàn)清晰的單一條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示，12株蛭弧菌均與Bdellovibrio聚為一支。因此證實(shí)12株分離菌株均為蛭弧菌。

蛭弧菌在雙層瓊脂培養(yǎng)基上形成的噬菌斑具有多樣性（圖4），與大腸桿菌共培養(yǎng)60 h后可觀察到清晰的噬菌斑。不同蛭弧菌形成的噬菌斑略有不同，主要表現(xiàn)為凹陷程度和透明斑大小，如5.1蛭弧菌株的噬菌斑形態(tài)為深入凹陷且透明，4.2蛭弧菌株的噬菌斑形態(tài)透明但不凹陷，8.1蛭弧菌株的噬菌斑非常小、透明、不凹陷。經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌呈圓桿狀，具有端生單根鞭毛，菌體大小0.65 μm×0.30 μm，鞭毛長(zhǎng)2.00 μm（圖5）。

2. 2 分離蛭弧菌的裂解譜

從12株蛭弧菌中選取3株（4.2、5.1和3N.3）進(jìn)行裂解試驗(yàn)，結(jié)果表明，3株蛭弧菌對(duì)所有宿主弧菌（哈維氏弧菌V-1-3120、哈維氏弧菌B0150、霍亂弧菌B0165、溶藻弧菌1833、副溶血弧菌0394和鰻弧菌Van-DC12R90387）均具有良好的裂解能力，但對(duì)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、脫氮副球菌、乳酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌等有益菌沒有裂解作用（表1）。其中，5.1蛭弧菌株對(duì)致病菌具有良好的裂解能力，除了能裂解弧菌外，對(duì)嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和腐敗假單胞菌也有裂解作用，是一株裂解譜較廣的優(yōu)良蛭弧菌株。

2. 3 蛭弧菌鹽度耐受性分析結(jié)果

由圖6可看出，3株蛭弧菌在鹽度1.5%～3.0%的范圍內(nèi)生長(zhǎng)狀況良好。其中，5.1蛭弧菌株對(duì)鹽度的耐受范圍是0.5%～4.0%，最適生長(zhǎng)鹽度2.5%；4.2蛭弧菌株對(duì)低鹽度具有較好的耐受性，最適生長(zhǎng)鹽度1.5%；3N.3蛭弧菌株具有較強(qiáng)的耐鹽能力，在鹽度為4.5%時(shí)依然能生長(zhǎng)，是一株廣鹽性菌株。

2. 4 蛭弧菌裂解差異性分析結(jié)果

以5.1蛭弧菌株為代表，分析溶藻弧菌1833、副溶血弧菌0394、哈維氏弧菌V-1-3120和大腸桿菌AB90054等宿主菌對(duì)蛭弧菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果（圖7）表明，5.1蛭弧菌株在以溶藻弧菌1833為宿主菌的雙層瓊脂培養(yǎng)基上能夠形成大量噬菌斑，與副溶血弧菌0394、哈維氏弧菌V-1-3120和大腸桿菌AB90054相比，存在顯著差異（P<0.05），表明5.1蛭弧菌株對(duì)溶藻弧菌的侵染效果強(qiáng)于副溶血弧菌、哈維氏弧菌和大腸桿菌。

2. 5 培養(yǎng)方法對(duì)蛭弧菌增菌效果的影響

由圖8可看出，宿主菌（大腸桿菌）經(jīng)滅活后，蛭弧菌在培養(yǎng)第60 h達(dá)峰值，相對(duì)于其他3種方法，營養(yǎng)肉湯滅活宿主菌法達(dá)峰值時(shí)間最短。宿主菌未經(jīng)滅活處理而直接與蛭弧菌同步發(fā)酵培養(yǎng)，蛭弧菌達(dá)峰時(shí)間延遲，但濃度并未快速下降。其原因可能是將宿主菌滅活后其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到破壞，減少蛭弧菌進(jìn)入宿主菌的阻力，達(dá)到快速進(jìn)入宿主的目的，導(dǎo)致蛭弧菌快速增殖；到培養(yǎng)后期，其他3個(gè)處理組的宿主菌形態(tài)結(jié)構(gòu)和活力變化不明顯，而滅活處理組中由于未被侵染的宿主菌發(fā)生自溶，失去原有結(jié)構(gòu)，致使蛭弧菌下降最迅速。

3 討論

弧菌病在魚、蝦、蟹及貝類等水產(chǎn)動(dòng)物中發(fā)病率高，是一類危害最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（李亞晨等，2004；楊少麗等，2005）。本研究從上海沿海地區(qū)分離獲得12株蛭弧菌，有3株（4.2、5.1和3N.3）對(duì)5種弧菌具有良好的裂解能力，且表現(xiàn)為對(duì)溶藻弧菌的裂解能力較對(duì)副溶血弧菌和哈維氏弧菌的強(qiáng)，但對(duì)芽孢桿菌、脫氮副球菌、乳酸菌等有益菌無裂解作用。其中，5.1蛭弧菌株對(duì)致病菌具有良好的裂解能力，除了能裂解5種弧菌外，對(duì)嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和腐敗假單胞菌也具有裂解作用，是一株裂解譜較廣的優(yōu)良蛭弧菌株。Taylor等（1974）研究表明，從海水分離獲得的蛭弧菌對(duì)大多數(shù)海洋細(xì)菌及陸生細(xì)菌均有裂解能力，但對(duì)少數(shù)陸生菌株的裂解效率較低。Takubo等（1989）研究認(rèn)為，裂解差異可能與宿主表面結(jié)構(gòu)及蛭弧菌的識(shí)別系統(tǒng)差異有關(guān)。此外，蛭弧菌鹽度耐受性分析結(jié)果表明，5.1蛭弧菌株（分離自上海蘆潮港水樣）具有廣鹽性特征，可能是采樣點(diǎn)受海水與淡水相互作用而導(dǎo)致菌株的廣鹽性；3N.3蛭弧菌株分離自上海炮臺(tái)濕地公園的水樣，因采樣點(diǎn)地處海水侵蝕區(qū)域?qū)е缕鋵?duì)鹽度耐受性較強(qiáng)；4.2蛭弧菌株對(duì)鹽度的耐受性不及上述的2株蛭弧菌株?？梢?，蛭弧菌能夠適應(yīng)鹽度變化，且對(duì)大多數(shù)致病菌具有裂解作用，能達(dá)到凈化水質(zhì)、消除致病菌和防治細(xì)菌性疾病等多重目的。

為優(yōu)化蛭弧菌的培養(yǎng)條件，本研究采用液體培養(yǎng)法探討不同培養(yǎng)方式對(duì)蛭弧菌增菌效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宿主菌（大腸桿菌）滅活處理后，蛭弧菌在培養(yǎng)第60 h達(dá)峰值，相對(duì)于其他3種方法，該方法的達(dá)峰時(shí)間最短；宿主菌不滅活組的蛭弧菌在培養(yǎng)第72 h達(dá)峰值，相對(duì)于宿主菌滅活組的達(dá)峰時(shí)間延遲，且蛭弧菌濃度相對(duì)較低。Shemesh和Jurkevitch（2004）研究認(rèn)為，蛭弧菌裂解大多數(shù)革蘭氏陰性宿主細(xì)菌后，殘余的宿主細(xì)胞對(duì)蛭弧菌具有耐受性。即滅活宿主菌失去對(duì)蛭弧菌的耐受性，有助于蛭弧菌生長(zhǎng)，使得蛭弧菌滴度提高且峰濃度提前；而未滅活宿主菌對(duì)蛭弧菌的侵染產(chǎn)生耐受性，阻礙其生長(zhǎng)。此外，在同步發(fā)酵和異步發(fā)酵中，殘余的大腸桿菌對(duì)蛭弧菌可能會(huì)產(chǎn)生耐受性。Varon和Zeigler（1978）曾研究認(rèn)為，蛭弧菌和宿主菌的比例需達(dá)1∶250時(shí)蛭弧菌才可以捕食；Frataminco和Whiting（1995）報(bào)道宿主菌與蛭弧菌比例為10∶1是蛭弧菌裂解宿主的最佳條件。本研究的同步發(fā)酵處理在遲緩期（培養(yǎng)第12 h）呈下降趨勢(shì)，可能是初始接種的宿主菌量未達(dá)上述比例要求，無法供蛭弧菌正常生長(zhǎng)而導(dǎo)致其死亡。

一般情況下，蛭弧菌生長(zhǎng)較緩慢，至少需要培養(yǎng)48 h才能形成肉眼可見的噬菌斑，且許多蛭弧菌屬于非可培養(yǎng)細(xì)菌（李祎等，2013）。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，快速檢測(cè)蛭弧菌的方法不斷優(yōu)化，但針對(duì)其活體的檢測(cè)只有平板培養(yǎng)法?？捣f倩等（2014）、溫崇慶等（2015）分別采用16S rRNA基因擴(kuò)增和構(gòu)建克隆文庫對(duì)水體中的蛭弧菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分離出高度多樣的蛭弧菌；薛明等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在分離計(jì)數(shù)海洋蛭弧菌及其多樣性檢測(cè)時(shí)采用海水培養(yǎng)基的效果優(yōu)于聚蛋白胨培養(yǎng)基。目前，只有極少數(shù)的近海海洋微生物能通過傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得菌落，而絕大多數(shù)能在顯微鏡下觀察到的環(huán)境微生物都不能在傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基上形成可見菌落（Eilers et al.，2000；Rappe and Giovannoni，2003）?？梢?，蛭弧菌的培養(yǎng)獲得仍是其優(yōu)勢(shì)種篩選及研究的瓶頸。加之蛭弧菌在保存過程中極易死亡，即使綜合運(yùn)用甘油和液氮進(jìn)行嘗試（田雙娥和蔡俊鵬，2014）也未能獲得良好的效果，因此今后需要進(jìn)一步優(yōu)化蛭弧菌的培養(yǎng)及保藏方法。

4 結(jié)論

從上海沿海地區(qū)分離獲得的蛭弧菌具有良好噬菌能力，對(duì)主要的海水致病菌和淡水致病菌均具有侵染裂解能力，對(duì)有益菌無殺滅效果，且具有廣鹽性特征，可用于蛭弧菌微生態(tài)制劑的研發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

蔡俊鵬，趙俊. 2006. 蛭弧菌的最新研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào)，46（6）：1028-1032.

Cai J P，Zhao J. 2006. The recent research progress on Bdellovibrio bacteriourus[J]. Acta Microbiologica Sinica，46（6）：1028-1032.

儲(chǔ)衛(wèi)華，朱衛(wèi)，康春濤. 2009. 海洋蛭弧菌的分離鑒定及其對(duì)副溶血弧菌的作用[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，36（1）：20-24.

Chu W H，Zhu W，Kang C T. 2009. Isolation，identification of marine Bdellovibrios and its effect on Vibrio parahaemolyticus[J]. Microbiology，36（1）：20-24.

韓韞，蔡俊鵬，宋志萍，王志. 2005. 應(yīng)用蛭弧菌清除海產(chǎn)品潛在致病弧菌的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，24（11）：23-25.

Han Y，Cai J P，Song Z P，Wang Z. 2005. Elimination of potentially pathogenic vibrios in seafood by Bdellovibrio sp.[J]. Fisheries Science，24（11）：23-25.

黃冬菊，林紅華，白泉陽. 2002. 噬菌蛭弧菌微生態(tài)制劑對(duì)海水中弧菌的凈化作用[J]. 福建畜牧獸醫(yī)，24（5）：4.

Huang D J，Lin H H，Bai Q Y. 2002. Purification effects of Bdellovibrio sp. probiotics on vibrio in sea water[J]. Fujian Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，24（5）：4.

黃亮，蔡俊鵬，陳曉紅，肖小麗. 2010. 應(yīng)用蛭弧菌清除牡蠣中潛在致病弧菌的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，26（3）：225-230.

Huang L，Cai J P，Chen X H，Xiao X L. 2010. Elimination of potential pathogenic vibrios in oysters by Bdellovibrio sp.[J]. Modern Food Science and Technology，26（3）：225-230.

康穎倩，劉濤華，曾佳，王梅竹，金方，牟麗麗，呂倩，王顏顏. 2014. 云貴地區(qū)淡水湖中類蛭弧菌多樣性分析[J]. 貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，39（5）：621-624.

Kang Y Q，Liu T H，Zeng J，Wang M Z，Jin F，Mou L L，Lü Q，Wang Y Y. 2014. Diversity and phylogenetic analysis of Bdellovibrio-like organisms in fresh water in Yun-Gui region[J]. Journal of Guiyang Medical College，39（5）：621-624.

李麗，李林桂，周俊芳，王元，房文紅. 2013. 蛭弧菌AS212菌株的分離、鑒定及其裂解特性[J]. 海洋漁業(yè)，35（2）：202-208.

Li L，Li L G，Zhou J F，Wang Y，F(xiàn)ang W H. 2013. Isolation，identification and lysing characteristics of Bdellovibrio AS212 strain[J]. Marine Fisheries，35（2）：202-208.

李祎，鄭偉，鄭天凌. 2013. 海洋微生物多樣性及其分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，40（4）：655-668.

Li Y，Zheng W，Zheng T L. 2013. Advances in research of marine microbial diversity and molecular ecology[J]. Microbiology China，40（4）：655-668.

李亞晨，包永明，呂建發(fā)，安利佳. 2004. 海洋水產(chǎn)動(dòng)物弧菌病的生物防治[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，23（2）：35-38.

Li Y C，Bao Y M，Lü J F，An L J. 2004. Biological control of vibriosis of the marine economic animals[J]. Fisheries Science，23（2）：35-38.

林阿乞，陳小紅，蔡俊鵬. 2011. 蛭弧菌在九孔鮑養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 海洋湖沼通報(bào)，（4）：100-105.

Lin A Q，Chen X H，Cai J P. 2011. Applied research of Bdellovibrio-and-like organism in the aquaculture of Halio-

tis diversicolor Aquatilis[J]. Transactions of Oceanology and Limnology，（4）：100-105.

錢天樂，周逸卿，鄒珍友，王琰，孔肖菡，史永紅，茅冬梅，譚同和，丁海東，郭凱，趙靜. 2009. 微生物掃描電鏡樣品清洗方法的改進(jìn)與固定干燥方法比較[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，37（23）：10886-10888.

Qian T L，Zhou Y Q，Zou Z Y，Wang Y，Kong X H，Shi Y H，Mao D M，Tan T H，Ding H D，Guo K，Zhao J. 2009. Improvement of bathing method of microorganism samples for SEM and compparison of their fixing and dryness method[J]. Journal of Anhui Agriculture Science，37（23）：10886-10888.

宋志萍，蔡俊鵬，王志，韓韞. 2005. 蛭弧菌的分離及其生長(zhǎng)條件和裂解能力的研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)，45（4）：571-575.

Song Z P，Cai J P，Wang Z，Han Y. 2005. Study of bacteria-lysis abilities and growth conditions of 4 Bdellovibrio[J]. Acta Microbiologica Sinica，45（4）：571-575.

田雙娥，蔡俊鵬. 2014. 6種保護(hù)劑對(duì)蛭弧菌BDS01的保質(zhì)作用研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，41（16）：129-133.

Tian S E，Cai J P. 2014. Effects of six kinds of protectants on shelf-life of Bdellovibrio sp. BDS01[J]. Guangdong Agricultural Sciences，41（16）：129-133.

溫崇慶，薛明，梁華芳，周世寧. 2015. 湛江海水蝦池免培養(yǎng)蛭弧菌類生物的多樣性[J]. 微生物學(xué)報(bào)，55（10）：1314-1326.

Wen C Q，Xue M，Liang H F，Zhou S N. 2015. Diversity of Bdellovibrio-and-like organisms from shrimp mariculture ponds in Zhanjiang[J]. Acta Microbiologica Sinica，55（10）：1314-1326.

溫崇慶，薛明，張金燕，黃瑜，周世寧. 2009. 水產(chǎn)養(yǎng)殖用蛭弧菌類生物制劑的檢測(cè)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，33（2）：326-333.

Wen C Q，Xue M，Zhang J Y，Huang Y，Zhou S N. 2009. The detection of Bdellovibrio-and-like organisms in commercial preparations used for aquaculture[J]. Journal of Fisheries of China，33（2）：326-333.

薛明，關(guān)敏麗，王飛燕，溫崇慶. 2014. 兩種培養(yǎng)基對(duì)對(duì)蝦苗池海洋蛭弧菌的分離及其多樣性分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，41（9）：1723-1732.

Xue M，Guan M L，Wang F Y，Wen C Q. 2014. Comparison of two media for isolation and diversity analysis of marine Bdellovibrio-and-like organisms in shrimp hatchery system[J]. Microbiology China，41（9）：1723-1732.

楊少麗，王印庚，董樹剛. 2005. 海水養(yǎng)殖魚類弧菌病的研究進(jìn)展[J]. 海洋水產(chǎn)研究，26（4）：75-83.

Yang S L，Wang Y G，Dong S G. 2005. Progress of research on Vibriosis in marine cultured fish[J]. Marine Fisheries Research，26（4）：75-83.

張呂平，胡超群，羅鵬，沈琪. 2009. 噬菌蛭弧菌預(yù)防對(duì)蝦弧菌感染的應(yīng)用研究[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，30（1）：26-33.

Zhang L P，Hu C Q，Luo P，Shen Q. 2009. Prevention of Vibrio infection by application of Bdellovibrio bacteriovorus in intensively cultured shrimp[J]. Progress in Fishery Sciences，30（1）：26-33.

Cao H P，An J，Zheng W D，He S. 2015. Vibrio cholera pathogen from the freshwater-cultured whiteleg shrimp Penaeus vannamei and control with Bdellovibrio bacteriovorus[J]. Joural of Invertebrate Pathology，130：13-20.

Cao H P，He S，Wang H C，Hou S L，Lu L Q，Yang X L. 2012. Bdellovibrios，potential biocontrol bacteria against pathogenic Aeromonas hydrophila[J]. Veterinary Microbiology，154（3-4）：413-418.

Eilers H，Perenthaler J，Gl ckner F O，Amann R. 2000. Culturability and in situ abundance of pelagic bacteria from the North Sea[J]. Applied and Environmental Microbiology，66（7）：3044-3051.

Fratamico P M，Whiting R C. 1995. Ability of Bdellovibrio bacteriovorus 109J to lyse gram-negative food-borne pathogenic and spoilage bacteria[J]. Journal of Food Protection，58（2）：160-164.

Fry J C，Staples D G. 1976. Distribution of Bdellovibrio bacterio-

vorus in sewage works，river water，and sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology，31（4）：469-474.

Jurkevitch E，Minz D，Ramati B，Barel G. 2000. Prey range charac-

terization，ribotyping，and diversity of soil and rhizosphere Bdellovibrio spp. isolated on phytopathogenic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiolog，66（6）：2365-2371.

Marchesi J R，Sato T，Weightman A J，Martin T A，F(xiàn)ry J C，Hiom S J，Dymock D，Wade W G. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology，64（2）：795-799.

Pineiro S A，Sahaniuk G E，Romberg E. 2004. Predation pattern and phylogenetic analysis of Bdelovibrionaceae from the Great Salt Lake， Utah[J]. Current Microbilogy，48（2）：113-117.

Rappe M S，Giovannoni S J. 2003. The uncultured microbial majority[J]. Annual Review of Microbiology，57：369-394.

Shemesh Y，Jurkevitch E. 2004. Plastic phenotypic resistance to predation by Bdellovibrio and like organisms in bacterial prey[J]. Environmental Microbiology，6（1）：12-18.

Takubo Y，Nishimura Y，Zytoon E M，Nishihara T，Kondo M. 1989. Isolation of the saprophytic strain of MC-3 and participation of the cell surface structure in predation[J]. Microbiology and Immunology，33（2）：1053-1057.

Taylor V I，Bauman P，Reichelt J L，Allen R D. 1974. Isolation，enumeration，and host range of marine Bdellovibrios[J]. Archives of Microbiology，98（2）：101-114.

Varon M，Zeigler B P. 1978. Bacterial predator-prey interaction at low prey density[J]. Applied and Environmental Microbiology，36（1）：11-17.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）