Na+、K+、葡萄糖及甘油對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力的影響

張濤　李勝忠　牛建功　時(shí)春明　焦飛

摘要：【目的】明確水體介質(zhì)參數(shù)與高體雅羅魚(yú)精子活力的關(guān)系，解決高體雅羅魚(yú)人工繁殖受精率低及魚(yú)苗魚(yú)種生產(chǎn)效率低的技術(shù)難題?！痉椒ā恳钥焖龠\(yùn)動(dòng)時(shí)間（FT）、壽命時(shí)間（LT）和精子激活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究Na+、K+、葡萄糖及甘油對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力的影響。【結(jié)果】Na+濃度為135 mmol/L時(shí)高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，F(xiàn)T為71 s，LT為1020 s，精子激活率為95%；K+濃度為5 mmol/L時(shí)高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，F(xiàn)T為52 s，LT為280 s，精子激活率為80%；葡萄糖濃度為180 mmol/L時(shí)高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，F(xiàn)T為78 s，LT為1200 s，精子激活率為95%；甘油濃度為180 mmol/L時(shí)高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，F(xiàn)T為79 s，LT為1380 s，精子激活率為90%?！窘Y(jié)論】適宜濃度的Na+、K+、葡萄糖及甘油具有單獨(dú)提高高體雅羅魚(yú)精子活力的作用，但高濃度Na+、K+、葡萄糖及甘油對(duì)高體雅羅魚(yú)精子的激活率呈明顯抑制作用。實(shí)際生產(chǎn)中，可選擇135 mmol/L Na+、5 mmol/L K+、180 mmol/L葡萄糖或180 mmol/L甘油作為高體雅羅魚(yú)精子的激活液，提高其人工繁殖生產(chǎn)效率。

關(guān)鍵詞： 高體雅羅魚(yú)；精子活力；快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（FT）；壽命時(shí)間（LT）；精子激活率

中圖分類號(hào)： S965.199 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）04-0734-05

Abstract：【Objective】The relationship between water medium parameters and sperm motility of Leuciscus idus was studied to solve the technical problems of low fertility rate and and low production efficiency of fry in L. idus artificial breeding. 【Method】With fast moving time（FT）， life time（LT） and sperm activation rate as evaluation indexes， the effects of Na+， K+， glucose and glycerinon on sperm motility of L. idus were studied. 【Result】When the concentration of Na+ was 135 mmol/L， the sperm motility of L. idus was the strongest， with FT being 71 s， LT 1020 s， and sperm activation rate 95%. When the concentration of K+ was 5 mmol/L， the sperm motility of L. idus was the strongest， with FT being 52 s， LT 280 s ， and sperm activation rate 80%. When the concentration of glucose was 180 mmol/L， the sperm motility of L. idus was the strongest， with FT being 78 s， LT 1200 s， and sperm activation rate 95%. When the concentration of glycerinon was 180 mmol/L， the sperm motility of L. idus was the strongest， with FT being 79 s， LT 1380 s， and sperm activation rate 90%. 【Conclusion】Appropriate concentrations of Na+，K+，glucose and glycerol alone can increase L. idus sperm motility. But high concentrations of Na+， K+， glucose and glycerol inhibit sperm activation rate. In actual cultivation， 135 mmol/L Na+， and 5 mmol/L K+， 180 mmol/L glucose or 180 mmol/L glycerol can be chosen as sperm activation medium for L. idus to improve the efficiency of artificial breeding.

Key words： Leuciscus idus； sperm motility； fast moving time（FT）； life time（LT）； sperm activation rate

0 引言

【研究意義】高體雅羅魚(yú)（Leuciscus idus）又名圓腹雅羅魚(yú)，主要分布于北歐至西伯利亞水系，在我國(guó)僅見(jiàn)于新疆額爾齊斯河水系，已被列入新疆二級(jí)保護(hù)魚(yú)類，是典型的淡水冷水性魚(yú)類，多棲息在水流較緩慢的江河和湖泊中（高攀等，2015）。高體雅羅魚(yú)肉質(zhì)鮮美，在俄羅斯西伯利亞地區(qū)為主要漁撈對(duì)象，20世紀(jì)90年代前曾為我國(guó)新疆阿勒泰地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。近年來(lái)，受過(guò)度捕撈和水利工程建設(shè)的影響，高體雅羅魚(yú)的種群數(shù)量急劇下降，而且其人工繁殖技術(shù)尚未成熟，主要表現(xiàn)為精子受精率及受精卵孵化率較低。因此，篩選出適宜的高體雅羅魚(yú)精子激活液，對(duì)其人工增養(yǎng)殖和種群保護(hù)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)雅羅魚(yú)人工繁殖的研究已有報(bào)道。尹家勝等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，灘頭雅羅魚(yú)成魚(yú)在水溫升高時(shí)排卵，魚(yú)卵順利破膜發(fā)育到稚魚(yú)，即使天氣突變、水溫下降，幼魚(yú)也能耐受低溫考驗(yàn)。金永煥和鄭偉（2003）研究認(rèn)為，勃氏雅羅魚(yú)親魚(yú)的優(yōu)劣對(duì)性腺發(fā)育至IV期能否產(chǎn)卵起關(guān)鍵作用。黃孝湘等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸后雄性勃氏雅羅魚(yú)性腺退化嚴(yán)重，極易出現(xiàn)精液過(guò)熟現(xiàn)象。柳宗元（2006）在勃氏雅羅魚(yú)的人工繁殖過(guò)程中采用3針注射法對(duì)親魚(yú)進(jìn)行催產(chǎn)。孟和平等（2006）認(rèn)為達(dá)里湖東北雅羅魚(yú)的孵化率及苗種成活率不僅取決于總堿度，還與鹽度、鈣離子（Ca2+）濃度等因素有關(guān)。金萬(wàn)昆等（2009）通過(guò)高體雅羅魚(yú)人工繁殖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高體雅羅魚(yú)人工授精的受精率僅比自然受精率高6.9%。楊榮國(guó)等（2012）研究證實(shí)，采用LRH-A2+DOM兩種藥物合劑對(duì)勃氏雅羅魚(yú)進(jìn)行催產(chǎn)，能取得較好的效果，其產(chǎn)卵率可達(dá)98%，3年累計(jì)獲得受精卵855萬(wàn)粒。韓國(guó)蒼等（2015）研究表明，人工輔助天然繁殖技術(shù)能使達(dá)里湖大量增殖瓦氏雅羅魚(yú)水花魚(yú)苗，且該技術(shù)具有成本低、操作簡(jiǎn)單、無(wú)污染等特點(diǎn)，便于推廣應(yīng)用。閆浩等（2016）通過(guò)組織學(xué)觀察東北養(yǎng)殖灘頭雅羅魚(yú)性腺發(fā)育特征，發(fā)現(xiàn)2～3齡個(gè)體不論在淡水或弱堿水環(huán)境中養(yǎng)殖，其性腺發(fā)育時(shí)相無(wú)明顯差異；性成熟的灘頭雅羅魚(yú)性腺發(fā)育高峰期一年僅出現(xiàn)一次，即為一次性產(chǎn)卵類型?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大多數(shù)魚(yú)類具有體外受精的習(xí)性，因此魚(yú)類精子的活力狀況與水溫、鹽度、滲透壓等水體環(huán)境等因素密切相關(guān)（舒琥等，2005；劉鑒毅等，2007），但至今未見(jiàn)有關(guān)高體雅羅魚(yú)精子激活體系的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探究Na+、K+、葡萄糖及甘油對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力的影響，明確水體介質(zhì)參數(shù)與精子活力的關(guān)系，為解決高體雅羅魚(yú)人工繁殖受精率及魚(yú)苗魚(yú)種生產(chǎn)效率低的技術(shù)難題提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試高體雅羅魚(yú)取自新疆水產(chǎn)科學(xué)研究所水生野生動(dòng)物保護(hù)中心，為3齡體質(zhì)強(qiáng)健、體表鮮亮完好、輕壓腹部有精液流出的雄魚(yú)；體長(zhǎng)25～35 cm，體重0.5～0.8 kg。精液采集要求呈乳白色，避免尿液、血液混入，共采集14條雄魚(yú)精液。試驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，用去離子水配置。參照李飛和萬(wàn)全（2009）的研究結(jié)果，鈉離子（Na+）濃度梯度設(shè)為0、45、85、135和150 mmol/L（以NaCl配制），鉀離子（K+）濃度梯度設(shè)為0、5、10、20和50 mmol/L（以KCl配制），葡萄糖濃度梯度設(shè)為0、90、180、270和360 mmol/L，甘油濃度梯度設(shè)為0、90、180、270和360 mmol/L。藥品溶液配制后分裝至分裝瓶中，3 ℃以下密閉遮光保存。試驗(yàn)環(huán)境溫度18 ℃。

1. 2 試驗(yàn)方法

采用平板載玻片法觀察精子的運(yùn)動(dòng)情況，以膠頭吸管吸1滴不同藥品溶液滴在載玻片上，在200倍鏡頭下定好視野，用尖頭針粘取精液至載玻片上，立即觀察，秒表計(jì)時(shí)。以快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（FT）、壽命時(shí)間（LT）和精子激活率3個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)精子活力（魯大椿等，1989；喻達(dá)輝等，1998；江世貴等，2000），每個(gè)濃度梯度進(jìn)行2次重復(fù)。FT：當(dāng)精子與溶液相遇，在顯微鏡下只觀察到翻滾的黑點(diǎn)，精子運(yùn)動(dòng)速度很快，在整個(gè)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中看不清路線。LT：精子開(kāi)始活動(dòng)直至90%以上精子停止死亡的時(shí)間。精子激活率：在給定視野內(nèi)被激活的精子數(shù)量占全部精子數(shù)量的百分比（吳清毅等，2011）。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 Na+對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力的影響

當(dāng)Na+濃度在0～135 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力隨Na+濃度的升高而增加；Na+濃度為135 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，其FT、LT和激活率分別為71 s、1020 s和95%（表1）。Na+濃度超過(guò)135 mmol/L后，高體雅羅魚(yú)精子活力驟然下降。方差分析結(jié)果表明，當(dāng)Na+濃度為135 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子的FT、LT和激活率均極顯著高于其他濃度梯度（P<0.01，下同）。可見(jiàn)，Na+對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力存在明顯的激活或抑制作用。

2. 2 K+對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力的影響

當(dāng)K+濃度在0～5 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力隨K+濃度梯度的升高而增加；K+濃度為5 mmol/L 時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，其FT、LT和激活率分別為52 s、280 s和80%（表2）。當(dāng)K+濃度超過(guò)10 mmol/L后，高體雅羅魚(yú)精子活力隨K+濃度的增加而下降。方差分析結(jié)果表明，當(dāng)K+濃度為5 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子的LT和激活率極顯著高于其他濃度梯度，而FT極顯著高于除10 mmol/L外的其他濃度梯度，說(shuō)明K+對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力存在明顯的激活或抑制作用。

2. 3 葡萄糖對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力的影響

當(dāng)葡萄糖濃度在0～180 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力隨葡萄糖濃度的升高而增加；葡萄糖濃度為180 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，其FT、LT和激活率分別為78 s、1200 s和95%（表3）。葡萄糖濃度超過(guò)180 mmol/L后，高體雅羅魚(yú)精子活力隨葡萄糖濃度的增加而驟然下降。方差分析結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖濃度為180 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子的FT、LT和激活率均極顯著高于其他濃度梯度?？梢?jiàn)，葡萄糖對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力具有明顯的激活或抑制作用。

2. 4 甘油對(duì)高體雅羅魚(yú)精子活力的影響

當(dāng)甘油濃度在0～180 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力隨甘油濃度的升高而增加；當(dāng)甘油濃度為180 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，其FT、LT和激活率分別為79 s、1380 s和90%（表4）。甘油濃度超過(guò)180 mmol/L后，高體雅羅魚(yú)精子活力隨甘油濃度的增加而驟然下降。方差分析結(jié)果表明，當(dāng)甘油濃度為180 mmol/L時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子的FT、LT和激活率極顯著高于其他濃度梯度?？梢?jiàn)，甘油對(duì)高體雅羅魚(yú)的精子活力也有明顯的激活或抑制作用。

3 討論

Na+和K+對(duì)魚(yú)類精子活力發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但在不同魚(yú)類中這種調(diào)控作用存在明顯差異。潘德博等（1999）研究證實(shí)，Na+濃度為3‰時(shí)廣東魴精子的FT最長(zhǎng)；蘇德學(xué)等（2004a）發(fā)現(xiàn)在5‰ NaC1溶液條件下的白斑狗魚(yú)精子LT最長(zhǎng)；谷巍等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，高白鮭精子在NaC1濃度為5‰～6‰的條件下FT和LT最長(zhǎng)；劉鑒毅等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Na+濃度為2‰時(shí)中華鱘精子LT最長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，Na+濃度為135 mmol/L（鹽度為7.9‰）時(shí)高體雅羅魚(yú)的精子FT和LT最長(zhǎng)，精子激活率最高，說(shuō)明Na+對(duì)不同魚(yú)類精子活力的調(diào)控濃度各不相同。谷巍等（2005）證實(shí)1.0‰的K+可提高白鮭精子活力；劉鑒毅等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，K+濃度為0.005‰時(shí)中華鱘精子活力最佳，其FT、LT分別為80和174 s；而本研究發(fā)現(xiàn)，K+濃度為5 mmol/L（0.37‰）時(shí)，高體雅羅魚(yú)精子活力最強(qiáng)，LT最長(zhǎng)。可見(jiàn)，K+對(duì)不同魚(yú)類精子活力的調(diào)控濃度也不相同，且K+激活魚(yú)類精子的適宜濃度遠(yuǎn)低于Na+的適宜激活濃度。

Na+和K+是通過(guò)滲透壓來(lái)改變魚(yú)類精子活力。魚(yú)類精漿中Na+、K+等離子所產(chǎn)生的高滲環(huán)境抑制了魚(yú)類精子活動(dòng)，當(dāng)精液排入水體后滲透壓的改變促使精子激活，而精子激活后大量消耗自身能量，致使其活力明顯降低（蘇德學(xué)等，2004b；王位瑩等，2015）。這種魚(yú)類精子活力的降低可通過(guò)選擇適宜的Na+和K+濃度來(lái)阻止或減緩。因此，在魚(yú)類人工授精中應(yīng)選擇適宜滲透壓的Na+、K+激活液，降低魚(yú)類精子能量消耗，延長(zhǎng)精子活力，提高魚(yú)類受精率。

國(guó)內(nèi)外已有許多研究證實(shí)，魚(yú)類精液中有葡萄糖、果糖等糖類物質(zhì)的存在，且這些糖類物質(zhì)在維持魚(yú)類精子活力方面發(fā)揮重要作用。Phronen和Hyvarinen（1983）在硬頭鱒、白鮭的精液中發(fā)現(xiàn)有葡萄糖；蘇德學(xué)等（2004a，2004b）研究指出，適宜濃度的葡萄糖可延長(zhǎng)白斑狗魚(yú)和丁■的精子活力時(shí)間和壽命；李勝忠等（2005）研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖能有效提高凹目白鮭精子活力。本研究結(jié)果表明，在180 mmol/L葡萄糖溶液中高體雅羅魚(yú)精子的FT和LT最長(zhǎng)，且優(yōu)于在Na+、K+溶液中的活力表現(xiàn)。說(shuō)明葡萄糖能有效提高魚(yú)類精子活力，且葡萄糖提高魚(yú)類精子活力的作用強(qiáng)于Na+、K+等。其原因是適宜葡萄糖濃度下魚(yú)類精子能利用外源性葡萄糖補(bǔ)充其激活后在滲透壓適應(yīng)和運(yùn)動(dòng)上的能量消耗（李勝忠等，2005；王位瑩等，2015）。本研究還發(fā)現(xiàn)，甘油濃度為180 mmol/L時(shí)高體雅羅魚(yú)精子的FT和LT均達(dá)峰值，且與葡萄糖的激活效果相當(dāng)。這在白斑狗魚(yú)精子上已得到證實(shí)（李勝忠等，2013），但有關(guān)甘油對(duì)魚(yú)類精子活力調(diào)控的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

適宜濃度的Na+、K+、葡萄糖及甘油具有單獨(dú)提高高體雅羅魚(yú)精子活力的作用，但高濃度Na+、K+、葡萄糖及甘油對(duì)高體雅羅魚(yú)精子的激活率呈明顯抑制作用。實(shí)際生產(chǎn)中，可選擇135 mmol/L Na+、5 mmol/L K+、180 mmol/L葡萄糖或180 mmol/L甘油作為高體雅羅魚(yú)精子的激活液，提高其人工繁殖生產(chǎn)效率。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）