基于GBS技術(shù)的中華絨螯蟹的遺傳特征分析

高祥剛　鮑相渤　高美玲

摘要[目的] 研究中華絨螯蟹經(jīng)過多年的人工養(yǎng)殖、跨流域引種和增殖放流等活動可能會對其遺傳特性造成的影響。[方法] 基于下一代GBS測序技術(shù)，利用SNP標(biāo)記對遼河家系、遼河野生、長江群體、海南群體、黃河群體進(jìn)行遺傳特征分析。[結(jié)果] 經(jīng)過條件為測序深度4×、Miss0.5、次要等位基因頻率（MAF）>0.05 的過濾后，共獲得 652 746個高質(zhì)量的 SNP 位點(diǎn)用于群體的遺傳分析，各群體平均觀測雜合度（Ho）為0.084 4～0.124 9，平均期望雜合度（He）為0.097 4～0.200 3，群體平均π值（Pi）為0.158 3～0.254 4，群體Fi的平均測量值（Fis）為0.054 2～0.238 43。兩兩群體間遺傳分化指數(shù) Fst值結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生樹，可以看出，長江群體與海南群體的遺傳距離較近，分化較小，表示海南的中華絨螯蟹苗種可能來自長江流域。[結(jié)論] 該研究揭示了不同水系中華絨螯蟹的遺傳差異，探討了其遺傳多樣性水平，為中華絨鰲蟹資源的合理開發(fā)利用與保護(hù)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞中華絨螯蟹； GBS；SNP；遺傳多樣性；種群結(jié)構(gòu)

中圖分類號S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）36-0080-03

Abstract[Objective] To assess the genetic diversity and population structure of the wild and cultured E.sinensis populations （i.e.）. [Method] Based on GenotypingbySequencing technology，genetic character of Liaohe pondreared population （LC），Liaohe wild population （LW），Changjiang pondreared population （CJ），Hainan pondreared population （HN），Huanghe pondreared population （HH） was analyzed by using SNP marker.[Result] After screening with parameter of dp4，miss0.5 and minor alleles frequency （MAF）>0.05，a total of high quality 652 746 SNP sites were retained to analyze genetic character of population.The mean observed heterozygosity （Ho） was from 0.084 4 to 0.124 9，the mean expected heterozygosity （He） was from 0.097 4 to 0.200 3，the mean nucleotide diversity （Pi） was from 0.158 3 to 0.254 4，the average pairwise inbreeding coefficient Fis ranged from 0.054 2 to 0.238 43.Both the Fstatistic （Fst） among populations and phylogenetic analysis suggested that the CJ population had a very close relationship with HN population.It may indicate that the baby crabs of Hainan Province derived from Changjiang river.[Conclusion] The information may be beneficial for biodiversity conservation and management of E.sinensis.

Key wordsEriocheir sinensis； GBS；SNP； genetic diversity；population structure

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹、毛蟹，在動物分類地位上隸屬于節(jié)肢動物門甲殼綱十足目爬行亞目方蟹科絨螯蟹屬[1-2] ，屬高等甲殼動物。該蟹廣泛分布于遼河、黃河、長江、甌江和閩江等我國沿海各大水系，其肉味鮮美，營養(yǎng)豐富[3]。自 20 世紀(jì) 80 年代以來，中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，目前已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一[4]。經(jīng)過多年的人工養(yǎng)殖、跨流域引種和增殖放流等生產(chǎn)活動，已造成不同水系種質(zhì)資源嚴(yán)重混雜[5-6]。因此，為深入了解該蟹不同地理群體的種質(zhì)差異和遺傳特征，更有效保護(hù)和管理利用中華絨螯蟹資源，對不同地理群體中華絨螯蟹的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究勢在必行。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，基因分型的成本持續(xù)降低，GBS（Genotyping-by-sequencing） 技術(shù)作為第2代深度測序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的簡化基因組測序技術(shù)，通過采用酶切加標(biāo)簽的方法，使多樣本高通量平行測序得以實(shí)現(xiàn)。這不僅大大降低了基因測序的成本，也使對大樣本全基因組的基因分型成為可能，對深入了解種質(zhì)資源的遺傳背景和系統(tǒng)演化具有重要意義[7]。同時， GBS 獲得的短讀序列可通過有參或無參基因組的形式進(jìn)行拼接組裝，進(jìn)而獲得高密度的 SNP 標(biāo)記，利用這些 SNP標(biāo)記可進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建、加密，基因組的輔助組裝，全基因組關(guān)聯(lián)分析等相關(guān)研究。目前，GBS 技術(shù)作為基因分型的重要手段，已經(jīng)在遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定及品種識別等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[7-10]。

采用GBS測序技術(shù)對中華絨螯蟹5個群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)展開研究，以揭示不同中華絨螯蟹地理群體的遺傳差異，探討其遺傳多樣性水平，為該蟹種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用與有效保護(hù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)分析的群體為5個，均為（2齡）發(fā)育成熟個體，分別是取自盤錦遼河口的野生中華絨螯蟹群體、培育的遼河家系群體、采集自長江南通的養(yǎng)殖群體、采自黃河口附近東營的養(yǎng)殖群體，以及購買自?？诤ｕr市場的海南養(yǎng)殖群體（表1）。解剖出體壁肌肉保存于-40 ℃冰箱備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取和 GBS文庫構(gòu)建。

對采集的肌肉組織樣品，利用天根生化科技（北京）有限公司的基因組 DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取DNA。使用紫外分光光度計（Nanodrop，Thermo Scientific），在 260和280 nm 處分別測定 DNA 的吸光值，并通過 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的質(zhì)量。

提取的樣品 DNA 送上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行 DNA 質(zhì)檢、建庫和測序，采用限制性內(nèi)切酶（HindⅢ+Bfal）對全基因組 DNA 進(jìn)行完全酶切，回收插入片段大小在220～450 bp 之間的酶切片段，按照 Double Digest Genotyping-by-Sequencing （dd-GBS） 的方式進(jìn)行建庫，利用第2代測序技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS），基于 Illumina Hiseq測序平臺，對文庫進(jìn)行雙末端（Paired-end，PE）150 bp的測序。

1.2.2單核苷酸多態(tài)性（SNP）鑒定，

每條測序數(shù)據(jù)按照條碼劃分到對應(yīng)的樣本中，對每條序列進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控篩選，去除原始測序序列中的接頭序列和低質(zhì)量的短讀序列，包括單端測序中含有的 N 數(shù)量超過該條序列長度的 10%，或者單端測序中低質(zhì)量（Q≤5）堿基數(shù)超過該條序列長度 50%的序列。SNP 檢測采用 Samtools 軟件進(jìn)行，對齊的匹配文件用 Samtools 軟件轉(zhuǎn)換為 BAM 文件后進(jìn)行變異調(diào)用，Samtools 收集 BAM 文件中的匯總信息，計算可能基因型的似然值，再利用 Bcftools 應(yīng)用先驗(yàn)值進(jìn)行變異調(diào)用，采用貝葉斯模型檢測群體中的多態(tài)性位點(diǎn)獲得 VCFs 文件。

1.2.3遺傳數(shù)據(jù)分析。對5個群體的樣本，采用 stacks 程序包中的 populations 命令進(jìn)行群體遺傳多樣性各參數(shù)、Fst值計算，分析各群體的遺傳多樣性水平、群體間的遺傳分化程度[11-12]。采用 FastTree 軟件中的 ML 算法，利用P-distance 計算樣品間的遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。建樹完成后，對系統(tǒng)發(fā)育樹分支的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證（bootstrap， 1000 replications）。

2結(jié)果與分析

2.1測序質(zhì)量GBS 測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，24個中華絨螯蟹樣本的總測序數(shù)據(jù)量為44.7 Gb，去除低質(zhì)量的序列后，產(chǎn)生的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)量為 38.5 Gb，平均每個樣本數(shù)據(jù)量為 1 604 Mb。測序質(zhì)量較高（Q20≥94.67%，Q30≥85.38%），GC 分布正常，測序的峰值在Q40左右，測序質(zhì)量較高。經(jīng)過條件為測序深度4×、Miss0.5、次要等位基因頻率（MAF）>0.05 的過濾后，最后共獲得 652 746個高質(zhì)量的 SNP 位點(diǎn)用于群體的遺傳分析。

2.2群體遺傳多樣性分析

采用 stacks 程序包獲得各群體的遺傳多樣性結(jié)果，遼河家系、遼河野生、長江群體、海南群體、黃河群體的平均觀測雜合度（Ho）分別為：0.109 6、0.122 2、0.084 4、0.124 9、0.110 5，平均期望雜合度（He）分別為：0.145 0、0.097 4、0.172 5、0.190 7、0.200 3，群體平均π值（Pi）分別為：0.191 1、0.158 3、0.203 8、0.241 3、0.254 4，群體Fi的平均測量值（Fis）分別是：0.125 9、0.054 2、0.234 8、0.193 7、0.238 4（表2）。

2.3群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

兩兩群體間遺傳分化指數(shù) Fst 值顯示，遼河家系與遼河野生群體之間的Fst 值較大，長江群體與海南群體之間的Fst 值較小。各群體間的Fst 值差異不顯著，為0.134 375～0.278 688。由ML 系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）可以看出，遼河家系首先和遼河的野生中華絨螯蟹群體聚在一起，長江群體和海南群體聚在一起，最后這4個群體再與黃河群體聚在一起。

3結(jié)論與討論

基于GBS技術(shù)的遼河家系、遼河野生、長江群體、海南群體、黃河群體5個群體的SNP遺傳多樣性，其Ho為0.084 4～0.124 9， He為0.097 4～0.200 3， Pi為0.158 3～0.254 4。而閆龍等[6] 利用線粒體D_Loop控制區(qū)基因?qū)θ∽员P錦、丹東、南京、墾利的野生群體的遺傳多樣性分析，表明其Pi在0.010～0.019，其遺傳多樣性處于較高的水平；劉青等[13]采用微衛(wèi)星標(biāo)記分析取自長江、遼河、黃河的6個中華絨螯蟹群體遺傳水平，均表現(xiàn)出較高的遺傳雜合度水平（Ho=0.702～0.744）；熊良偉等[14] 利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析中華絨螯蟹興化、盤錦、宣城養(yǎng)殖群體的遺傳水平，發(fā)現(xiàn)其Ho為 0.70～0.75； He為 0.87～0.90，該蟹養(yǎng)殖群體也具有較高的遺傳多樣性水平。該研究與閆龍等[6]相比，群體平均π值（Pi）要高一個數(shù)量級，與劉青等[13]、熊良偉等[14]的微衛(wèi)星分析結(jié)果相比，則遺傳多樣性水平要低很多，而產(chǎn)生這樣的分析結(jié)果可能是分析方法不同造成的，該研究采用的第2代高通量測序技術(shù)，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能更真實(shí)，誤差更小。

當(dāng)群體內(nèi)觀測雜合度小于期望雜合度，同時 Fis 為正值，則表示群體內(nèi)近交程度較為嚴(yán)重[15]，該研究的 5個群體的 Fis均為正值，除遼河野生群體的Ho>He，其他群體的Ho群體的遺傳分化值數(shù)（Fst）能揭示種群間的遺傳分化程度，F(xiàn)st 值為0～0.05，群體的遺傳分化較弱；Fst 值為0.05～0.15時，遺傳分化水平中等；Fst 值大于 0.15 時，遺傳分化較大[16]。該研究的幾個群體間，除了長江群體與海南群體、黃河群體的 Fst值分別為：0.134 375、0.139 275，小于0.15，說明長江群體與這2個群間的遺傳分化較?。黄溆嗳后w間的Fst 值均大于 0.15，說明各群間的遺傳分化較大。閆龍等[6]基于線粒體控制區(qū)對4個野生群體的遺傳多樣性分析，兩兩群體間遺傳分化指數(shù) Fst值顯示在0.020 00～0.129 09。熊良偉等[14]對4個中華絨螯蟹群體在 10 個微衛(wèi)星位點(diǎn)上平

均配對遺傳分化系數(shù)統(tǒng)計量 Fst介于 0.012 3～0.020 7，處于低等程度分化，該研究與它們相比，遺傳分化較高。結(jié)合圖1的系統(tǒng)發(fā)生樹，可以看出，長江群體與海南群體的遺傳距離較近，分化較小，表明海南的中華絨螯蟹苗種可能來自長江流域。黃河口收集的中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體與長江流域的群體遺傳分化也較近，表示其苗種有可能來自南方。Sui等[17] 和Chang等[18]運(yùn)用微衛(wèi)星對中華絨螯蟹群體遺傳學(xué)度研究表明，遼河水系與黃河水系、長江水系中華絨螯蟹群體之間存在較顯著的遺傳差異，而黃河水系與長江水系中華絨螯蟹群體間遺傳差異不明顯，該研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相近。

參考文獻(xiàn)

[1]

王瑤，楊志剛，郭子好，等.中華絨螯蟹RXR基因全長cDNA克隆及表達(dá)分析[J].水產(chǎn)學(xué)報，2013，37（12）：1761-1769.

[2] LI X G，XU Z Q，ZHOU G，et al.Molecular characterization and expression analysis of five chitinases associated with molting in the Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis[J].Comp Biochem Physiol，Part B，2015，187：110-120.

[3] 孔曉瑜，喻子牛，劉亞軍，等.中華絨螯蟹與日本絨螯蟹線粒體COI基因片段的序列比較研究[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報，2001，31（6）：861-866.

[4] 宋林生，季延賓，蔡中華，等.溫度驟升對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）幾種免疫化學(xué)指標(biāo)的影響[J].海洋與湖沼，2004，35（1）：74-77.

[5] 谷孝鴻，趙福順.長江中華絨螯蟹的資源與養(yǎng)殖現(xiàn)狀及其種質(zhì)保護(hù)[J].湖泊科學(xué)，2001，13（3）：267-271.

[6] 閆龍，宋娜，王俊，等.基于線粒體控制區(qū)的中華絨螯蟹群體遺傳多樣性分析[J].水生生物學(xué)報，2015，39（3）：615-620.

[7] 王小柯，江東，孫珍珠.利用GBS技術(shù)研究240份寬皮柑橘的系統(tǒng)演化[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（9）：1666-1673.

[8] LIN M，CAI S B，WANG S，et al.Genotypingbysequencing （GBS） identified SNP tightly linked to QTL for preharvest sprouting resistance[J].Theoretical and applied genetics，2015，128（7）：1385-1395.

[9] LU F，LIPKA A E，GLAUBITZ J，et al.Switchgrass genomic diversity，ploidy，and evolution：Novel insights from a networkbased SNP discovery protocol[J].PLoS Genetics，2013，9（1）：1-14.

[10] BAJAJ D，DAS S，BADONI S，et al.Genomewide highthroughput SNP discovery and genotyping for understanding natural （functional） allelic diversity and domestication patterns in wild chickpea[J].Sci Rep，2015，5：12468.

[11] CATCHEN J M，AMORES A，HOHENLOHE P，et al.Stacks：Building and genotyping Loci de novo from shortread sequences[J].G3（Bethesda），2011，1（3）：171-182.

[12] CATCHEN J，HOHENLOHE P A，BASSHAM S，et al.Stacks：An analysis tool set for population genomics[J].Mol Ecol，2013，22（11）：3124-3140.

[13] 劉青，劉皓，吳旭干，等.長江、黃河和遼河水系中華絨螯蟹野生和養(yǎng)殖群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J].海洋與湖沼，2015，46（4）：958-968.

[14] 熊良偉，李真，馬克異，等.利用微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記分析中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體遺傳分化[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2012，20（12）：1441-1448.

[15] FRANKHAM R，BALLOU J D，BRISCOE D A.Introduction to conservation genetics[M].Cambridge：Cambridge University Press，2010：260-308.

[16] BALLOUX F，LUGONMOULIN N.The estimation of population differentiation with microsatellite markers[J].Mol Ecol，2002，11（2）：155-165.

[17] SUI L Y，ZHANG F M，WANG X M，et al.Genetic diversity and population structure of the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis in its native range[J].Mar Biol，2009，156（8）：1573-1583.

[18] CHANG Y M，LIANG L Q，MA H T，et al.Microsatellite analysis of genetic diversity and population structure of Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）[J].J Genet Genomics，2008，35（3）：171-176.