單菌株與復(fù)合菌對有機物料腐熟性能的影響

何宗均 梁海恬 李峰

摘要[目的]研究單菌株和復(fù)合菌的腐熟性能。[方法]測定了單菌株和復(fù)合菌的拮抗效果、除臭能力、纖維素酶和蛋白酶活性，以及復(fù)合菌對有機物料的除臭和腐熟效果。[結(jié)果]由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS這5種菌株組成的復(fù)合菌具有較強的纖維素、蛋白質(zhì)分解能力及除臭能力，綜合性能高于任何單一菌株。復(fù)合菌作為腐熟劑進行應(yīng)用后，從菌數(shù)、速效養(yǎng)分、C/N、氣味和發(fā)酵周期效果來看，對有機物料的腐熟和除臭都起到了顯著的促進作用。[結(jié)論]復(fù)合菌在促進有機物料腐熟及除臭方面效果優(yōu)于單菌株。

關(guān)鍵詞復(fù)合菌；有機物料；腐熟

中圖分類號S144文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0045-02

Abstract[Objective]To study the maturity performance of single strain and compound bacteria. [Method]The antagonistic effect， deodorization ability， cellulose and protease activity of single strain and compound bacteria， and deodorization and effect of decomposition of compound bacteria on organic materials were determined. [Result] The test result showed that compound bacterium maked up by TARE1013KC， TARE1003DY， TARE2012SR， TARE2009MQ and TARE2008LS had strong comprehensive ability of cellulose， protein decomposition and deodorization ability than any single strain. After compound bacterium as rotten agent was applied in composting， it has played a significant role in promoting the effect of the rotten and deodorization on organic material by indicators of bacterial count， available nutrients， C/N ratio， smell and fermentation cycle.[Conclusion] The compound bacteria in promoting the decomposition of organic materials and deodorization effect was better than that of single strain.

Key wordsCompound bacterium；Organic material；Rotten

基金項目天津市農(nóng)業(yè)科技成果與推廣項目（201202090）。

作者簡介何宗均（1976—），男，江西寧都人，副研究員，從事農(nóng)業(yè)微生物與廢棄物資源化處理技術(shù)研究。

收稿日期2016-12-23

我國是世界上農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)出量最大的國家，每年產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物約40.0億t，其中畜禽糞便 26.0億 t，農(nóng)作物秸稈7.0億 t，蔬菜廢棄物1.0億～1.5億 t[1]。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，菇渣、中藥渣、園林剪切物廢棄物的產(chǎn)生量也迅猛增加，這些廢棄物由于大部分得不到很好的處理和應(yīng)用，已對水體、大氣、土壤、人體健康及生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴重危害。應(yīng)用有機物料腐熟菌劑快速分解處理有機廢棄物生產(chǎn)有機肥料，是國內(nèi)外解決以上問題的主要措施，這項技術(shù)在國內(nèi)外已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。近年來，我國在這方面已進行了大量研究[2-21]。筆者研究了單菌株與復(fù)合菌的纖維素酶活性、蛋白酶活性和除臭性能，旨在為有機物料腐熟菌劑的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

細菌菌株TARE1013KC、TARE1003DY，真菌菌株TARE2012SR、TARE2009MQ、TARE2008LS。

營養(yǎng)肉汁瓊脂：由蛋白胨5 g、氯化鈉5 g、牛肉膏3 g和蒸餾水1.0 L組成，pH 7.0。

馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：取去皮的馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1.0 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1.0 L，加葡萄糖20 g，溶化后分裝，滅菌30 min，pH自然。

1.2試驗方法

1.2.1菌株的培養(yǎng)。

TARE1013KC和TARE1003DY培養(yǎng)基均為液體營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，經(jīng)121 ℃實罐滅菌30 min后，28～30 ℃培養(yǎng)36～48 h。

TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS采用馬鈴薯、葡萄糖培養(yǎng)基，把液體培養(yǎng)基分裝于0.5 L三角瓶中，經(jīng)滅菌后接入各真菌斜面菌種，于180 r/min 28～30 ℃培養(yǎng)48 h，當(dāng)搖瓶內(nèi)出現(xiàn)菌絲密度大，菌絲球明顯不渾濁即可。

1.2.2菌株間的相互拮抗試驗。

采用鋼圈法進行抑菌試驗。取其中1種菌（A）的發(fā)酵液0.10 mL涂于平板上，然后在每個平板的固體培養(yǎng)基上擺放2個已滅菌的鋼圈，再在每個鋼圈中加入0.25 mL的A菌之外的任何1種菌（B）的發(fā)酵液，每個處理重復(fù)3次，以只接A菌的平皿為對照（CK）。28 ℃培養(yǎng)并定期觀察抑菌情況。

1.2.3

除臭能力的測定。

采用氨氣檢測、硫化氫檢測和感官檢測對微生物菌劑的除臭能力進行評價。將活化后的TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS分別用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到各個菌株的菌液。將各個菌株的菌液和復(fù)合菌劑分別進行如下試驗：將菌液接在發(fā)酵除臭基質(zhì)內(nèi)，于500 mL燒杯中混勻（每份發(fā)酵除臭基質(zhì)接種10 mL菌液），作為試驗樣本，設(shè)置發(fā)酵除臭基質(zhì)作為對照樣本，各樣本用牛皮紙及1層塑料紙封口。每個樣本（6種試驗樣本和1種對照樣本）設(shè)置3個平行處理，每個平行處理設(shè)置3次重復(fù)。在第1個平行中放置內(nèi)盛20 mL 2%硼酸溶液的小燒杯，用以吸收發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨氣，第7天用酸滴定法測定；在第2個平行中放置內(nèi)盛20 mL 0.05 kg/L乙酸鋅溶液，用以吸收發(fā)酵過程中產(chǎn)生的硫化氫，第7天用碘量法測定；第3個平行，第7天進行感官測定。

1.2.4蛋白酶和纖維素酶活性的測定。

蛋白酶活性測定方法參照中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準QB/T 1803—1993《工業(yè)酶制劑通用試驗方法》中附錄A3蛋白酶的測定方法。

纖維素酶活性的測定方法：稱取樣品用蒸餾水稀釋10倍，充分振蕩，靜置30 min，過濾，其濾液即為原樣酶液。取3支帶有20 mL刻度的試管，1支作為空白對照，其余2支作為平行樣品管。樣品管中加1 mL原樣酶液，然后3支試管中分別加入4 mL已預(yù)熱至60 ℃的底物溶液，在60 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min取出，每管立即加入1 mL 2.0 mol/L氫氧化鈉溶液和2 mL DNS顯色液，搖勻后在對照管中再加入1 mL原樣酶液。將3支試管放入沸水浴中，顯色5 min后立即取出，流水冷卻，定容至20 mL，用分光光度計于490 nm處測定OD值。

根據(jù)標(biāo)準曲線換算成葡萄糖量

式中，U為樣品的酶活力（μg/min）；M0為對照葡萄糖量（μg）；

M1為分解后樣品質(zhì)量（μg）；20為酶與底物反應(yīng)時間（min）。

1 mL原樣酶液1 min產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為1個酶活力單位（U）。

1.2.5復(fù)合菌在有機物料的除臭和腐熟上的應(yīng)用試驗。

堆肥原料：雞糞、牛糞、玉米秸稈、可堆腐生活垃圾和蘑菇渣，質(zhì)量比為5〖DK〗∶5∶3∶2∶2。設(shè)2個處理，即加復(fù)合菌處理和未加菌劑的空白對照（CK），每個處理2 t原料，3次重復(fù)，垛型堆制發(fā)酵。發(fā)酵周期以發(fā)酵溫度降至室溫為止計算所得，發(fā)酵第15天對2個處理進行取樣分析，包括速效氮、速效磷、速效鉀總量、C/N、菌數(shù)和大腸桿菌，并觀察發(fā)酵的物理狀態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1復(fù)合菌

將TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS單菌種質(zhì)量比為3∶2∶2∶1∶2混合拌勻后制得復(fù)合菌，復(fù)合菌有效活菌數(shù)達2×108 個/g。

2.2拮抗試驗

由表1可知，TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS 5種菌之間無抑制作用，拮抗反應(yīng)均為陰性。

2.3除臭能力

結(jié)合感官、氨氣和硫化氫含量的檢測結(jié)果可知，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS組成的復(fù)合菌與TARE1013KC單個菌株的除臭效果不存在顯著差異，但顯著好于TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ、TARE2008LS和CK（表2）。

2.4纖維素酶和蛋白酶活性

由表3可知，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS菌株組成的復(fù)合菌具有很強的纖維素和蛋白質(zhì)分解能力，綜合性能高于任何單一菌株，也高于有機物料腐熟劑國家標(biāo)準規(guī)定的纖維素酶活性（30.00 U/mL）和蛋白酶活性（15.00 U/mL）的要求，復(fù)合菌可以作為有機物料腐熟劑進行使用。

2.5復(fù)合菌對有機物料的除臭能力和腐熟效果

由表4可知，從各項指標(biāo)來看，復(fù)合菌的發(fā)酵效果好于CK，其中復(fù)合菌的發(fā)酵溫度在2 d內(nèi)能夠達55 ℃，CK需要4 d；發(fā)酵的結(jié)果表現(xiàn)為復(fù)合菌微生物數(shù)量生長繁殖活躍，菌數(shù)和速效N、P、K含量均高于CK，發(fā)酵周期也大大縮短，其中復(fù)合菌為15 d，CK 32 d，復(fù)合菌發(fā)酵顏色黑褐色，無臭味，而CK為淺色，有臭味。發(fā)酵15 d后復(fù)合菌和CK的C/N分別為153、22.3，C/N愈低，表示微生物對堆肥有機物料中纖維素降解作用越好。從菌數(shù)、速效養(yǎng)分、C/N、氣味和發(fā)酵周期效果來看，加入復(fù)合菌對有機物料的腐熟和除臭都有促進作用。

3結(jié)論與討論

（1）該研究表明，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS菌株組成的復(fù)合菌具有較強的纖維素、蛋白質(zhì)分解能力及除臭能力，綜合性能高于任何單一菌株，作為有機物料腐熟劑進行應(yīng)用后，從菌數(shù)、速效養(yǎng)分、C/N、氣味和發(fā)酵周期效果來看，對有機物料的腐熟和除臭都起到了顯著的促進作用。柳玲玲等[2]對不同腐熟菌劑對雞糞堆肥效果的影響研究表明，雞糞堆肥通過接種微生物菌劑，可以明顯提高堆肥初期的發(fā)酵溫度，加快堆肥物料的水分揮發(fā)，縮短堆肥發(fā)酵周期，促進堆肥快速腐熟。趙曉鋒等[8]分離篩選出細菌KB217、放線菌KA46和真菌KF21這3個菌株，使雞糞堆肥的氨氣釋放量分別降低了59.40%、55.05%和56.38%。3種菌株之間無拮抗作用，三者混合制劑能使氨氣釋放量降低67.33%，且縮短氨氣釋放時間，這與該研究結(jié)果相似。

（2）微生物菌株是一種容易變異的生物，生長繁殖受環(huán)境影響也非常大，因此，微生物腐熟劑或除臭劑的特性易變異，性能不穩(wěn)定，對有機物料的腐熟和除臭效果也會造成不同程度的影響，今后應(yīng)該在這方面加大研究力度。

參考文獻

[1] 郜玉環(huán)，李彥，孫明，等.山東省可農(nóng)用有機廢棄物的利用現(xiàn)狀與技術(shù)分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（7）：98-101.

[2] 柳玲玲，范成五，芶久蘭，等.不同腐熟菌劑對雞糞堆肥效果的影響[J].耕作與栽培，2015（5）：18-19.

[3] 梁雄.不同秸稈腐熟劑應(yīng)用效果對比研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2011，17（15）：127-129.

[4] 劉軍.產(chǎn)高溫蛋白酶高溫菌的篩選[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2004，23（4）：22-23.

[5] 翁海波，敬蔚然，楊丹麗，等.產(chǎn)高溫堿性蛋白酶菌株篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].鄭州大學(xué)學(xué)報（工學(xué)版），2010，31（1）：70-73.

[6] 楊冠東，杜少平，楊礎(chǔ)華，等.產(chǎn)堿性蛋白酶的嗜熱菌株篩選及發(fā)酵條件研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（10）：71-73.

[7] 劉月，許修宏，徐杰，等.功能菌劑對堆肥中木質(zhì)纖維素降解的影響[J].中國土壤與肥料，2014（4）：81-86.

[8] 趙曉鋒，于文清，田艷洪，等.雞糞除氨菌株的分離、篩選與菌劑配制[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（6）：85-87.

[9] 徐大勇，黃為一.接種外源腐熟菌劑對牛糞高溫堆肥的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（13）：7759-7762.

[10] 熊駿生，魏姣皎，陸倩，等.垃圾堆肥過程惡臭污染及其控制技術(shù)研究進展[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，14（4）：405-411.

[11] 曾蘇，李南華，賀琨，等.垃圾微生物除臭劑的篩選、復(fù)配及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].微生物學(xué)雜志，2015，35（2）：72-77.

[12] 席鋒，高穎，吳良政，等.生物除臭劑的制備及除臭效果測定[J].貴州畜牧獸醫(yī)，2011，35（3）：1-3.

[13] 梁軍，羅洪，羅英，等.生物除臭劑對雞糞除臭處理的研究[J].四川環(huán)境，2012，31（S1）：13-17.

[14] 劉勝洪，周玲艷，劉文，等.生物除臭菌對豬糞堆肥腐熟效果的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，45（3）：425-428.

[15] 張云峰.嗜熱蛋白酶生產(chǎn)菌的篩選[J].西南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，31（2）：157-161.

[16] 陸文龍，崔廣明，陳浩泉，等.微生物除臭劑對污泥和生活垃圾臭氣抑制效果的中試研究[J].環(huán)境衛(wèi)生工程，2012，20（2）：23-25.

[17] 趙曉鋒，隋文志.微生物除臭劑研究進展[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2011（6）：26-28.

[18] 劉勝洪，程駒，郭長江，等.微生物除臭菌對改善畜禽養(yǎng)殖場環(huán)境的應(yīng)用初探[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，17（4）：25-27.

[19] 楊伯杰，張淑娟，林創(chuàng)發(fā)，等.污泥堆肥惡臭氣體生物處理技術(shù)的研究進展[J].廣東化工，2014，41（16）：124-125.

[20] 李南華，胡子全，趙海泉，等.新型生物除臭劑在垃圾滲濾液除臭效果評估[J].廣州環(huán)境科學(xué)，2013，28（1）：18-19，30.

[21] 崔玉雪，郭廣寨，黃皇，等.用于填埋場惡臭氣體控制的微生物除臭劑篩選及其除臭機制研究[J].環(huán)境污染與防治，2014，36（1）：60-63.