紫蘇梗酶解糖化條件優(yōu)化

趙莉娟 胥江河 王星敏 邵承斌 曾雪

摘要：【目的】研究復合酶制劑催化水解紫蘇梗的適宜條件，為紫蘇梗生物質資源化利用提供技術支持。【方法】選用質量比4∶25∶12的纖維素酶、木聚糖酶和漆酶為復合酶制劑，在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法，以還原糖含量（Y）為響應值，建立紫蘇梗水解糖化的數(shù)學模型和優(yōu)化其工藝參數(shù)，并探究復合酶制劑投加量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）和pH（D）4個因素對復合酶制劑催化水解紫蘇梗組織纖維的影響?！窘Y果】建立的紫蘇梗催化水解二次多項回歸方程為Y=107.28+7.26A+6.88B+3.09C-1.68D-20.57A2-19.41B2-18.42C2-28.26D2-3.63AB-4.98AC-

2.93AD+1.93BC-1.20BD-1.33CD，其中復合酶制劑投加量對紫蘇梗還原糖含量影響極顯著（P<0.01），酶解時間影響顯著（P<0.05）。復合酶制劑催化水解紫蘇梗的最佳工藝條件為：在復合酶制劑投加量1.0 g、酶解溫度45 ℃、pH 5的條件下酶解5.4 h，可水解產還原糖108.8 mg/g，與預測值相差0.1 mg/g。【結論】采用響應曲面法優(yōu)化獲得的復合酶制劑催化水解紫蘇梗產糖工藝，具有試驗周期短、耗能低等優(yōu)點，建立的數(shù)學模型對優(yōu)化工藝具有可行性，可用于實際預測。

關鍵詞： 紫蘇梗；酶解；還原糖；工藝優(yōu)化

中圖分類號： TK6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）06-1054-08

Optimization of enzymatic saccharification for perilla stem

Abstract：【Objective】The appropriate conditions for compound enzyme preparation to catalyze hydrolysis of perilla stem were studied in order to improve the resource utilization of perilla stem. 【Method】Using compound enzyme with cellulase， xylanase and laccase（mass ratio 4∶25∶12）， on the basis of single factor experiment， response surface methodology was conducted. With reducing sugar content（Y） as response value， the mathematical model and optimization process parameters of hydrolysis and saccharification of perilla stem were established. And effects of compound enzyme dosage（A）， enzyme hydrolysis time（B）， enzymolysis temperature（C） and pH（D） on hydrolysis of perilla stem tissue fiber by compound enzyme preparation were investigated. 【Result】Two regression equations of catalytic hydrolysis of perilla stem were established： Y=107.28+7.26A+6.88B+3.09C-1.68D-20.57A2-19.41B2-18.42C2-28.26D2-3.63AB-4.98AC-2.93AD+1.93BC-

1.20BD-1.33CD. The dosage of compound enzyme had extremely significant influence on content of reducing sugar in perilla stem（P<0.01）， and enzymolysis time had significant influence on it（P<0.05）. When 1.0 g compound enzyme preparation were applied for saccharification of perilla stem， saccharification rate of 108.8 mg/g was obtained after 5.4 h hydrolysis at 45 ℃ and pH 5.Relative deviations was 0.1 mg/g compared to expected value. This was the optimum process for hydroly-

zing perilla stem by compound enzyme preparation. 【Conclusion】The optimization of enzyme catalyzed hydrolysis of perilla stem saccharification process obtained by response surface method has a short test period and low energy consumption. The mathematical model of the optimization process is feasible， and can be used in actual forecast.

Key words： perilla stem； enzymolysis； reducing sugar； process optimization

0 引言

【研究意義】以生物質為原料生產燃料乙醇是解決能源危機和環(huán)境問題、保持社會可持續(xù)發(fā)展的一條有效途徑（金士威等，2006；張鴨關等，2016）。我國天然木質纖維素類生物質豐富，僅農作物秸稈和皮殼每年產生約7.0×108 t（張繼泉等，2002）；廢棄的生物質同樣含有豐富的碳素，全部培耕還田如處理不當不僅引發(fā)農村面源污染，還會導致生物質資源浪費。紫蘇系一年生草本植物，是國家衛(wèi)生部首批頒布的藥食同源植物之一（張志軍，2011）。目前紫蘇的利用主要集中在紫蘇籽及紫蘇葉上，紫蘇梗除少量入藥外，雖有資源化提取紫蘇梗中黃酮類物質（李秀信等，2002）、揮發(fā)油（任淑清等，2008）、迷迭香酸（溫獻業(yè)等，2014）等報道，但大多被丟棄或焚燒，綜合利用率極低。紫蘇梗富含木質纖維素，其纖維素和半纖維素含量達62.7%（張志軍，2011）。若將紫蘇梗有效水解成葡萄糖，進一步開發(fā)成生物質燃料乙醇等，不僅有利于改善資源緊缺、環(huán)境惡化的現(xiàn)狀，還對人類社會實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有重要的經濟和社會意義?！厩叭搜芯窟M展】生物質水解糖化是生物質燃料乙醇生產過程中關鍵的一步（Turon et al.，2008）。目前，生物質水解方法主要有酸解法、超（亞）臨界法、蒸汽爆破法、離子液體水解法和酶解法等。其中，酸解法需在高溫、高壓下進行，耗能高，副產物較多，且因酸對設備的腐蝕作用，故該法對設備的要求較高（Lin and Tanaka，2006）。超（亞）臨界法和蒸汽爆破法雖能有效打破木質素的桎梏作用，但對試驗條件要求較高，投資成本高，制約了生物質大規(guī)模生產（徐桂轉和常春，2012）。酶解法具有產糖率高、副產物少、生產條件可控等優(yōu)點（李夢雪等，2013；劉品華等，2016），在生物質水解產糖技術中運用廣泛，如呂學斌等（2008）利用響應曲面法對玉米秸稈酶水解條件進行優(yōu)化，結果表明，響應曲面所得最優(yōu)條件較單因子試驗中玉米秸稈酶水解產糖率高；任天寶等（2010）采用稀酸對稻草秸稈進行預處理后，可提高稻草秸稈酶解液的產糖率；張偉等（2015）探討纖維素酶水解小麥秸稈產糖的最佳工藝條件，結果表明，在最優(yōu)條件（底物質量分數(shù)8.0%、溫度50 ℃、pH 5.4、酶投加量35 FPU/g）下水解96 h，還原糖產率為60.73%?！颈狙芯壳腥朦c】植物組織中木質素致密結晶結構阻礙纖維素和半纖維素的水解轉化，因此木質素去除效果直接影響生物質資源化利用。目前僅有李夢雪等（2013）利用纖維素酶催化水解紫蘇梗產糖，但單一酶通常不能同時降解纖維素、半纖維素和木質素3種物質，至今尚未見復合酶催化水解紫蘇梗產糖的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】采用單因素試驗和響應曲面法，優(yōu)化復合酶催化水解紫蘇梗產糖的適宜工藝參數(shù)，并解析因素間的交互作用，為紫蘇梗生物質資源化利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

紫蘇梗采自重慶市南川區(qū)。纖維素酶（50000 U/g）購自和氏璧生物技術有限公司，木聚糖酶（50000 U/g）購自深圳市綠微康生物工程有限公司，漆酶（2000 U/g）購自蘇柯漢（濰坊）生物工程有限公司；鹽酸、氫氧化鈉購自成都市科龍化工試劑廠。

主要儀器設備：KC-1000高速粉碎機（北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)式真空泵、SHA-C水浴振蕩器（鞏義市予華儀器責任有限公司）；EL104電子天平、Phs-3C酸度計（成都世紀方舟科技有限公司）；80-2型高速離心機（上海君竺儀器制造有限公司）；SAB-40C生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 復合酶制劑催化水解紫蘇梗 根據(jù)紫蘇梗植物組織成分，選取質量比4∶25∶12的纖維素酶、木聚糖酶、漆酶作為復合酶制劑。稱取2.00 g過60目篩的紫蘇梗置于100 mL錐形瓶中，加入0.6～1.4 g復合酶制劑和40 mL蒸餾水，調節(jié)pH 3～7，混勻后于35～55 ℃水浴搖床中酶解3.0～7.0 h；取出冷卻至室溫，過濾、離心后得澄清溶液，待測；固體渣集中收集，待進一步資源化利用。

1. 2. 2 紫蘇梗還原糖含量測定 采用SAB-40C生物傳感分析儀測定還原糖含量（YRS）。

YRS=CRS×V/m

式中，CRS為還原糖質量濃度（mg/L）；V為溶液總體積（L）；m為紫蘇梗質量（g）。

1. 2. 3 單因素試驗 考察復合酶制劑投加量（0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 g）、酶解時間（3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 h）、酶解溫度（35、40、45、50和55 ℃）和pH（3、4、5、6和7）對還原糖含量的影響。

1. 2. 4 響應曲面優(yōu)化紫蘇梗產糖工藝 在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken原理，以復合酶制劑投加量、酶解時間、酶解溫度和pH為自變量，以還原糖含量為響應值，利用Design-Expert v8.0設計4因素3水平的響應面分析試驗，因素水平編碼見表1。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Design-Expert v8.0對響應曲面試驗結果進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2. 1 影響紫蘇梗轉化產糖的單因素分析結果

2. 1. 1 復合酶制劑投加量對紫蘇梗還原糖含量的影響 生物質經酶催化水解產糖與酶制劑種類及其投加量有關。由圖1可知，在固定酶解時間4.0 h、酶解溫度45 ℃、溶液pH 5的條件下，當復合酶制劑投加量由0.6 g增至1.0 g時，紫蘇梗水解產糖速度迅速增加，還原糖含量可達58.8 mg/g。這是因為增加酶制劑投加量，可適當增加酶與底物接觸機會，增加接觸位點，促使酶與底物接觸位點接近飽和。當復合酶制劑投加量大于1.0 g時，還原糖含量明顯降低，表明酶與底物的接觸位點已達飽和，不會隨復合酶制劑投加量的增加而增加；且隨著復合酶制劑投加量的增加，反應體系中生成產物除還原糖外，戊糖等其他水解產物隨之增加，其中戊糖會結合體系中的酸轉化為糠醛（李穎暢等，2014），影響反應體系的酸堿性，進而影響酶活性，抑制植物組織的水解糖化。

2. 1. 2 酶解時間對紫蘇梗還原糖含量的影響 由圖2可知，在固定復合酶制劑投加量1.0 g、酶解溫度45 ℃、溶液pH 5的條件下，紫蘇梗催化水解在3.0～5.0 h范圍內還原糖含量迅速增加，在5.0～6.0 h時趨于平緩，且在6.0 h時還原糖含量達最大值（51.2 mg/g）。分析其原因，在酶解反應初期，酶與底物充分接觸，酶解速率較快，隨著酶解時間的延長，根據(jù)稀釋效應，反應液中的還原糖含量越來越高，會對酶解反應產生抑制作用（楊青丹和胡婷春，2010）；且酶解時間過長容易促使糠醛等發(fā)酵抑制物的產生，對后續(xù)發(fā)酵工藝產生不利影響（路鵬等，2006）。

2. 1. 3 酶解溫度對紫蘇梗還原糖含量的影響 酶具有最適溫度，其催化作用受溫度影響較明顯。從圖3可看出，在固定復合酶制劑投加量1.0 g、酶解時間6.0 h、溶液pH 5的條件下，隨著酶解溫度的升高，還原糖含量逐漸增加，于50 ℃下達最大值（47.5 mg/g）；超過50 ℃后，還原糖含量快速下降。這是因為酶的適宜溫度范圍一般在45～65 ℃（楊青丹和胡婷春，2010；張霞等，2014）；在最適溫度范圍內，溫度升高，活化分子數(shù)會相應增多，進而提高酶活性，促進酶解反應；但溫度過高會使酶蛋白質結構變性而失活，導致還原糖轉化降低。

2. 1. 4 pH對紫蘇梗還原糖含量的影響 由圖4可知，在固定復合酶制劑投加量1.0 g、酶解時間6.0 h、酶解溫度50 ℃的條件下，紫蘇梗還原糖含量隨溶液pH的增大呈先增加后減少的變化趨勢，當pH為4時，還原糖含量最高，略低于Insu等（2010）提出的酶最適pH范圍4.5～5.5。其原因是溶液pH改變會破壞酶的空間結構，影響酶活性中心催化基團的功能，進而影響酶解反應的速率和酶解產率（劉娜等，2005；李夢雪等，2013）；pH過高或過低均會破壞酶的結構且失活，從而影響纖維素的降解作用，還原糖含量因此降低。

2. 2 紫蘇梗催化水解產糖的響應曲面優(yōu)化結果

2. 2. 1 Box-Behnken設計條件及結果 根據(jù)單因素試驗確定的水平范圍，利用Design-Expert v8.0設計的試驗條件及試驗結果見表2，所得復合酶制劑投加量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）、pH（D）與還原糖含量（Y）之間的二次多項回歸方程為：Y=107.28+7.26A+

6.88B+3.09C-1.68D-20.57A2-19.41B2-18.42C2-28.26D2-

3.63AB-4.98AC-2.93AD+1.93BC-1.20BD-1.33CD。

2. 2. 2 模型顯著性檢驗結果 由表3的方差分析結果可知，模型P<0.01，表明該模型影響極顯著，說明此模型擬合性好，可用該模型對紫蘇梗的還原糖含量進行測定和分析。由F可知，影響紫蘇梗還原糖含量的因素排序為：A>B>C>D，即復合酶制劑投加量>酶解時間>酶解溫度>pH。結合表3中回歸模型方差分析結果和二次多項回歸方程，進一步分析4個因素不同項對還原糖含量的影響發(fā)現(xiàn)，一次項中，A影響極顯著（P<0.01，下同），B影響顯著（P<0.05），C和D影響均不顯著（P>0.05，下同）；二次項中4個因素的影響均極顯著，但交互項的影響均不顯著。

2. 2. 3 響應曲面分析結果 由圖5～圖10可知，還原糖含量均呈先增加后減少的變化趨勢，在中心點附近達響應值的最高點。由圖5可知，隨著復合酶制劑投加量的增加和酶解時間的延長，還原糖含量逐步提高，復合酶制劑投加量和酶解時間存在協(xié)同效應。在本研究水平范圍內，復合酶制劑投加量和酶解時間分別在0.8～1.3 g和3.4～6.0 h范圍內，還原糖含量可達最大值。沿著復合酶制劑投加量方向有較明顯的變化趨勢，說明復合酶制劑投加量對還原糖含量的影響較強。

同樣的協(xié)同作用也表現(xiàn)在圖6～圖10。由圖6和圖7可知，復合酶制劑投加量與酶解溫度及pH對還原糖含量的影響均呈拋物線型，隨著酶解溫度的升高、pH和復合酶制劑酶投加量的相應增大，還原糖含量呈先增加后減少的變化趨勢，復合酶制劑投加量在0.6～1.0 g時還原糖含量的增加趨勢相比酶解溫度在35～45 ℃及pH為3～5時增加趨勢更明顯，說明復合酶制劑投加量對還原糖含量的影響強于酶解溫度及pH。由圖8可知，酶解溫度和酶解時間分別在37～50 ℃和4.1～6.7 h范圍內，還原糖含量可達最大值。如圖9所示，pH為3～5時，還原糖含量呈上升趨勢，在pH為5時還原糖含量達最大值，pH大于5后，還原糖含量急速降低；只有在適宜的pH條件下，酶的催化作用才能達到最佳狀態(tài)，此時酶促反應速度達最大值，從而提高還原糖產率。由圖10可知，當酶解溫度一定時，還原糖含量隨pH的增大呈先增后減趨勢；當pH一定時，還原糖含量隨酶解溫度的升高也呈先增加后減少的變化趨勢，而隨著酶解溫度的升高還原糖含量的變化更加明顯，故酶解溫度較pH對還原糖含量的影響更顯著。

由圖5～圖10可知，雙因素間的交互作用與4個因素對還原糖含量的影響排序基本吻合。

2. 2. 4 響應曲面優(yōu)化驗證結果 選擇合適的pH、酶解時間、酶解溫度及復合酶制劑投加量可獲得較高的還原糖含量，通過Design-Expert v8.0對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得出最佳工藝條件為：在復合酶制劑投加量1.0712 g、酶解溫度45 ℃、pH 4.87的條件下酶解5.36 h，可獲得還原糖含量理論最大值（108.9 mg/g）。考慮到試驗過程中的可操作性，將最佳工藝條件修正為：復合酶制劑投加量1.0 g、酶解時間5.4 h、酶解溫度45 ℃、pH 5，在修正條件下進行試驗，還原糖含量試驗值為108.8 mg/g，與理論預測值相差僅0.1 mg/g，說明響應曲面法得出的最優(yōu)工藝參數(shù)具有重現(xiàn)性，且該模型對優(yōu)化此工藝具有可行性。

3 討論

近年來，酶解技術在廢棄農作物資源化利用中廣泛應用。李夢雪等（2013）利用纖維素酶水解紫蘇梗，以正交試驗優(yōu)化水解工藝條件，在pH 5.0和纖維素酶投加量720 U的條件下酶解24 h，酶水解率達72.42%。王雪雅等（2013）通過比較纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶及果膠酶4種酶對小麥秸稈的糖化效果，發(fā)現(xiàn)小麥秸稈在木聚糖酶的水解作用下還原糖含量最高；通過正交試驗得出最優(yōu)糖化工藝參數(shù)，在此工藝條件下，還原糖含量為33.55%，表明小麥秸稈酶解糖化比酸解糖化和堿解糖化的還原糖含量高。馬俊洋等（2014）用稀酸對麥稈進行預處理，再進行酶解反應，通過正交試驗優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，在最優(yōu)條件下，還原糖含量達707.07 mg/g。本研究利用質量比4∶25∶12的纖維素酶、木聚糖酶和漆酶為復合酶制劑對紫蘇梗進行水解糖化，纖維素酶、木聚糖酶和漆酶分別作用于紫蘇梗植物組織中的纖維素、半纖維素和木質素，在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法優(yōu)化獲得紫蘇梗水解糖化的數(shù)學模型及適宜參數(shù)，最優(yōu)條件為：復合酶制劑投加量1.0 g、酶解溫度45 ℃、酶解時間5.4 h、pH 5，在此條件下，還原糖含量為108.8 mg/g，與理論值僅相差0.1 mg/g，酶解時間較李夢雪等（2013）采用單一纖維素酶水解紫蘇梗所需時間縮短18.6 h，酶解溫度降低了5 ℃?？梢?，本研究建立的模型優(yōu)化紫蘇梗水解糖化工藝具有可行性，不僅縮短試驗周期，還能節(jié)約能源。

本研究探究了各因素對復合酶制劑催化水解紫蘇梗組織纖維的影響，結果表明，復合酶制劑投加量對紫蘇梗還原糖含量有極顯著影響，酶解時間有顯著影響，4個因素的二次項均有極顯著影響，但兩因素間的交互作用對其影響不顯著。在研究酶解糖化廢棄生物質資源化利用中，任天寶等（2010）、馬俊洋等（2014）在酶解之前分別用稀酸預處理稻草秸稈和麥稈，可提高還原糖含量，故預處理方法的選擇將作為下一步研究重點。

4 結論

采用響應曲面法優(yōu)化獲得的復合酶制劑催化水解紫蘇梗產糖工藝，具有試驗周期短、耗能低等優(yōu)點，建立的數(shù)學模型對優(yōu)化工藝具有可行性，可用于實際預測。

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（責任編輯 羅 麗）