細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在水膠體敷料臨床使用安全性評價中的應(yīng)用

許雷鳴，顧 倩，武 谷，堵偉鋒，李 翔，林園園(.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 005;.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 4000;.解放軍第74醫(yī)院，福建 廈門 600)

水膠體敷料是在濕性愈合原理指導(dǎo)下發(fā)展起來的一類新型傷口敷料，由親水性高分子顆粒與橡膠彈性體混合加工而成，集吸收性、對無創(chuàng)皮膚的黏性、隔離細(xì)菌等作用于一身，可應(yīng)用于多種不同傷口的治療，特別是對于慢性難愈性傷口具有顯著療效［1－2］。本試驗根據(jù)《中國藥典》2010年版二部“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”［3］和 GB/T14233.2—2005 中的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗［4］，以及相關(guān)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的文獻(xiàn)［5－20］，對水膠體敷料應(yīng)用鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性進(jìn)行了研究，建立了水膠體敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法并采用凝膠半定量試驗測定產(chǎn)品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，為評價臨床應(yīng)用水膠體敷料的安全性提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

VS-1300L-U潔凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，S648恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械七廠)，MS3 digital混旋儀(IKA)，微量取液器(50～250 μL，上海榮泰生化工程有限公司)，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用具(湛江博康海洋生物有限公司)。試驗所用玻璃儀器均經(jīng)250℃干烤2 h。

水膠體敷料3批(合肥某公司生產(chǎn)，批號為130220、121225、120510，規(guī)格:10 cm ×10 cm)。

鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號:1209101，靈敏度:0.125 EU·mL－1，規(guī)格:每支 0.1 mL。湛江博康海洋生物有限公司，批號:1201052，靈敏度:0.125 EU·mL－1，規(guī)格:每支 0.1 mL。湛江安度斯生物有限公司，批號:1210162，靈敏度:0.03 EU·mL－1，規(guī)格:每支0.1 mL)。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)(中國食品藥品檢定研究院，效價:每支100 EU，批號:150601－201176)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(福州新北生化工業(yè)有限公司，批號:13012115，規(guī)格:每瓶50 mL)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備方法的確立 每片水膠體敷料表面積計為200 cm2，按水膠體敷料表面積每1 cm2加入4 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，37℃保溫浸提2 h，為均一透明的溶液，可作為供試品溶液用于正式試驗。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗 按《中國藥典》2010年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對兩個廠家的鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，2 λ 管均為陽性，0.25 λ 管和陰性對照管均為陰性，兩個不同廠家的3批鱟試劑靈敏度測定值均在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，符合要求，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果

2.3 內(nèi)毒素限值(L)的確定 水膠體敷料的通常臨床用量為每次1片(每片表面積為200 cm2)，根據(jù)公式 L=K/M，注射劑 K=5 EU·kg－1·h－1，式中M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均體重按 60 kg計算，則水膠體敷料 L=1.5 EU·cm－2。同時考慮安全系數(shù)為3的情況下，最終確定限值(L)為 1/3 ×1.5 EU·cm－2=0.5 EU·cm－2。

2.4 干擾試驗預(yù)試驗 目前市售鱟試劑λ通常在0.5 ～0.03 EU·mL－1，根據(jù)公式 MVD=cL/λ，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，c為供試品溶液的濃度，λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，則水膠體敷料供試品溶液對應(yīng)的最大有效稀釋倍數(shù)分別為1、2、4倍。取水膠體敷料樣品一批(批號:130220)，將水膠體敷料浸提液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別配制成為1、2、4倍稀釋液，將此系列溶液記為NPC。同法制備上述系列溶液，向其中加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每一濃度的溶液中均含有2 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，此系列溶液記為PPC。取湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)的靈敏度均為0.125 EU·mL－1鱟試劑，分別與上述NPC和 PPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)做2管，同時設(shè)陽性對照(PC)和陰性對照(NC)，干擾預(yù)試驗結(jié)果見表2。預(yù)試驗結(jié)果表明，本試驗條件下制備的水膠體敷料供試品溶液可能對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。

表2 水膠體敷料供試品溶液干擾試驗預(yù)試結(jié)果

2.5 干擾試驗 為了最終確認(rèn)是否存在干擾因素的影響，取“2.1”項下水膠體敷料樣品(批號:130220)制備的供試品溶液一批，按《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”凝膠法干擾試驗項進(jìn)行正式干擾試驗，結(jié)果見表3。正式干擾試驗結(jié)果表明，采用湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)的靈敏度均為0.125 EU·mL－1的鱟試劑進(jìn)行試驗，Es均在0.5～2.0 λ 內(nèi)且 Et/Es均在 0.5 ～2.0 λ 之間，確認(rèn)水膠體敷料供試品溶液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾。

2.6 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草 取本品適量，以水膠體敷料表面積每1 cm2加入4 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的比例，37 ℃保溫浸提 2 h，按 GB/T14233.2—2005中的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗進(jìn)行，每1 cm2中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5 EU。

表3 水膠體敷料供試品溶液的干擾試驗結(jié)果

2.7 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 根據(jù)“2.5”項下結(jié)果，取3批樣品，分別用兩個不同廠家靈敏度為0.125 EU·mL－1的鱟試劑按本試驗起草的標(biāo)準(zhǔn)和《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”凝膠限度試驗對樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表4。結(jié)果表明3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合起草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

表4 水膠體敷料樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

2.8 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素的凝膠半定量檢測 用靈敏度為0.03 EU·mL－1的鱟試劑對水膠體敷料供試品溶液作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，則最大有效稀釋倍數(shù)為4。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將3批供試品溶液分別作1、2、4倍稀釋(NPC)，按《中國藥典》2010年版二部附錄的凝膠半定量試驗進(jìn)行，同時制備供試品陽性對照PPC(添加內(nèi)毒素使其含外加內(nèi)毒素為0.06 EU·mL－1)。分別取上述溶液0.1 mL，加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，每個濃度做2管，混合均勻，同時設(shè)陽性對照和陰性對照，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均在每片25～50 EU之間。

3 討論

隨著對傷口愈合認(rèn)識的深入，薄膜類、泡沫類、水凝膠類、水膠體類、藻酸鹽類、藥用類等一系列醫(yī)用新型敷料不斷涌現(xiàn)。2000年8月美國食品藥品管理局(FDA)在新頒布的創(chuàng)面醫(yī)療用品(外用藥和敷料)行業(yè)指南中特別強(qiáng)調(diào)，保持創(chuàng)面的濕潤環(huán)境是標(biāo)準(zhǔn)的處理方法，新型密閉性敷料逐漸成為醫(yī)用敷料發(fā)展的主流。水膠體敷料由水狀膠粘劑、覆蓋層薄膜和粘結(jié)劑組成，主要用于慢性傷口(如壓瘡)和靜脈潰瘍傷口的治療，也可用于急性傷口的護(hù)理并且還是一種適用于兒童使用的理想敷料。本文對水膠體敷料應(yīng)用鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性進(jìn)行了研究，以期采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法控制本品的致熱物質(zhì)。

供試品溶液的制備是本試驗的一個重要環(huán)節(jié)。供試品浸提時間不得少于1 h，但浸提時間過長，浸提液會變得黏稠，干擾凝膠法測定。浸提時間定為2 h較為合適。每片水膠體敷料表面積為200 cm2，經(jīng)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，按水膠體敷料表面積每1 cm2加入2 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，37℃保溫浸提2 h，有輕微渾濁現(xiàn)象。按水膠體敷料表面積每1 cm2加入4 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，37℃保溫浸提2 h，則為均一透明的溶液。

根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”和GB/T14233.2—2005中的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗以及水膠體敷料的臨床實際應(yīng)用情況，確定該品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值為0.5 EU·cm－2。由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法限值計算采用的是每小時最大可接受的靜脈注射內(nèi)毒素劑量，而本品臨床使用途徑為體表小傷口的覆蓋，其限值不如靜脈注射劑要求嚴(yán)格，并同時考慮到安全系數(shù)為3，因此采用0.5 EU·cm－2作為本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值是可以保證臨床使用安全的。不同廠家的鱟試劑在工藝、質(zhì)量等方面有一定差異，其抗干擾能力也存在差異，通過采用2個不同廠家的鱟試劑進(jìn)行試驗，可客觀地評價供試品溶液對鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的干擾程度。經(jīng)干擾試驗確證，在本實驗條件下，水膠體敷料浸提液(按水膠體敷料表面積每1 cm2加入4 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，37℃保溫2 h)對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用，可選擇靈敏度為0.125 EU·mL－1及以上的鱟試劑對本品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。按擬定標(biāo)準(zhǔn)檢驗，本品3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合起草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，凝膠半定量試驗結(jié)果表明3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均在每片25～50 EU之間，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來檢測該產(chǎn)品中的致熱原是可行的。

表5 水膠體敷料樣品凝膠半定量試驗結(jié)果

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