10種南藥植物提取物乙酰膽堿酯酶抑制活性的篩選模型研究

丁運(yùn)華 郭少敏 劉燕 鄭建靈

摘 要 采用篩選模型對(duì)10種南藥樣品乙酸乙酯提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：10種南藥（益智、雞血藤、決明子、巴戟天、溪黃草、金櫻子、化橘紅、佛手、絞股藍(lán)、五指毛桃）均具有不同程度的乙酰膽堿酯酶抑制活性。當(dāng)提取物濃度為1.0 mg/mL時(shí)，溪黃草、益智、化橘紅、絞股藍(lán)、五指毛桃表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，平均抑制率大于50%，分別為89.59%，77.10%，67.54%，52.62%，52.29%，其他5種南藥的平均抑制率在20.81%～49.81%之間；提取物濃度為0.1 mg/mL時(shí)，溪黃草、益智、佛手仍表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抑制活性，平均抑制率大于25%，其他7種南藥的平均抑制率在6.07%～24.78%之間。應(yīng)該深入研究復(fù)方中藥治療老年癡呆的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，加大對(duì)南藥資源的開(kāi)發(fā)利用。

關(guān)鍵詞 南藥；乙酰膽堿酯酶；抑制活性；篩選模型

中圖分類(lèi)號(hào) TQ041 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Evaluation of Acetylcholinesterase Inhibitory Activity

of 10 Southern Chinese Herbs by Screening Model

DING Yunhua， GUO Shaomin， LIU Yan， ZHENG Jianling

School of life Science， Huizhou University， Huizhou， Guangdong 516007， China

Abstract In the present study， AChE activity of ethyl acetate-soluble fractions from 10 southern Chinese herb samples were screened by a screening model. The results indicated that all these 10 samples exhibited AChE inhibitory activities. At 1.0 mg/mL of extracts concentrations， higher inhibitory activity appeared in Rabdosia serra （Maxim.）Hara， Alpinia oxyphylla， Citrus grandis cv. Tomentosa， Gynostemma pentaphyllum， and Radix Fici Hirtae， with inhibition ratios of 89.59%， 77.10%， 67.54%， 52.62%， and 52.29%（all of the above more than 50%）respectively， and the inhibition ratios of the other 5 samples at this concentration were between 20.81% and 49.81%. At 0.1 mg/mL of extracts concentrations， Rabdosia serra（Maxim.）Hara， Alpinia oxyphylla， Citrus medica L. and var. sarcodactylis Swingle demonstrated higher inhibitory activites， with average inhibition ratios more than 25%， while the inhibition ratios of the other 7 samples at this concentration were between 6.07% and 24.78%. Exploring of southern Chinese herbs should be strengthened in searching components for treatment of Alzheimers Disease.

Key words Southern Chinese herb； acetylcholinesterase； inhibitory activity； screening model

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.013

阿爾茨海默氏?。ˋlzheimers Disease，AD） 又稱(chēng)早老性癡呆癥，是一種以記憶、判斷和思維等存在認(rèn)知功能障礙以及人格和行為嚴(yán)重改變?yōu)橹饕卣鞯穆陨窠?jīng)退行性疾病。隨著世界人口老齡化進(jìn)程的加快，AD病發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，AD 已成為繼心腦血管疾病和癌癥之后威脅老年人生命健康的嚴(yán)重疾病之一。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前多方面研究表明，AD患者大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)—乙酰膽堿的缺失是導(dǎo)致AD疾病的關(guān)鍵原因[1-5]，AD的病理與患者神經(jīng)間隙中乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）活性過(guò)高具有重要關(guān)系。因此乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEI）藥物是目前研究最多、使用最為廣泛的抗早老性癡呆癥藥物[3-6]。

中國(guó)藥用植物資源極其豐富，是開(kāi)發(fā)乙酰膽堿酯酶抑制劑的寶庫(kù)。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多海藻[3]、蕨類(lèi)[6]、中草藥[5，7]等天然植物都有乙酰膽堿酯酶抑制活性。如藥理研究表明石杉?jí)A甲、黃皮酰胺對(duì)輕中度早老性癡呆有一定的治療作用[3]。從天然資源中尋找AChEI一直是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。華南地區(qū)中草藥資源蘊(yùn)藏量大，用藥歷史悠久，療效顯著，成為中國(guó)醫(yī)藥學(xué)的重要流派。南藥中的巴戟天、益智、化橘紅、佛手、五指毛桃、溪黃草、雞血藤、決明子、金櫻子等都是華南地區(qū)常用的藥用植物[8-10]。為了更好地開(kāi)發(fā)利用南藥資源，尋找來(lái)源于南藥資源的乙酰膽堿酯酶抑制劑，本研究基于Ellman方法[11]，設(shè)計(jì)篩選模型，對(duì)10種南藥（溪黃草，決明子，巴戟天，雞血藤，金櫻子，茨實(shí)，五指毛桃，絞股藍(lán)，益智，佛手）95%乙醇提取物的乙酸乙酯組分進(jìn)行活性篩選，為篩選高效安全的天然乙酰膽堿酯酶抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 溪黃草、巴戟天、五指毛桃、絞股藍(lán)、益智、佛手、化橘紅、決明子、雞血藤、金櫻子等10種南藥購(gòu)于惠州同仁堂藥店，經(jīng)惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院林芳花副教授鑒定。

1.1.2 試劑與儀器 碘化硫代乙酰膽堿（ATCI，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司進(jìn)口分裝，用50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液配制），二硫代雙對(duì)硝基苯甲酸（DTNB，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司進(jìn)口分裝，用50 mmol/L、pH7.0的PBS溶液配制），乙酰膽堿酯酶（Sigma產(chǎn)品，10 mg酶加入1 mg牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑，用1 mL 50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液溶解，制成2 U/mL的酶液），他克林（tacrine，Sigma公司，用50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液配制），其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑規(guī)格。

723E型可見(jiàn)分光光度計(jì)（天津科納斯光學(xué)分析儀器有限公司），DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海一科儀器有限公司），DK-8B型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

1.2 方法

酶促反應(yīng)體系（篩選模型）的建立：參照Ellman的方法稍作改進(jìn)[11]。Ellman的方法是測(cè)定AChE活性最常用的方法，其原理為AChE催化水解底物碘化硫代乙酰膽堿（ATCI），水解形成的產(chǎn)物碘化硫代乙酰膽堿迅速與顯色劑二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物5-巰基-2硝基苯甲酸，該產(chǎn)物在412 nm處有光吸收。在酶催反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)階段用光吸收值OD值表征酶促反應(yīng)初速度。

1.2.1 非酶促水解光吸收 由于底物ATCI不穩(wěn)定，在儲(chǔ)存及水浴過(guò)程中容易發(fā)生非酶催水解產(chǎn)生碘化硫代乙酰膽堿，其與顯色劑DTNB結(jié)合產(chǎn)生光吸收[11]。因此在測(cè)酶活之前，需測(cè)定ATCI非酶催水解產(chǎn)生的光吸收，排除背景干擾，計(jì)算真正由酶催反應(yīng)所產(chǎn)生的光吸收值。

取pH8.0、50 mmol/L的 PBS 2 730 μL于試管中，依次加入15 mmol/L的DTNB 100 μL，15 mmol/L ATCI 100 μL，不加酶，分別于37 ℃水浴反應(yīng)不同時(shí)間（0，5，10，15，20，25，30 min）；加入100 μL 1%的SDS終止反應(yīng)，測(cè)其在412 nm處的光吸收值OD值，這就是底物ATCI的非酶催水解光吸收值。

1.2.2 OD-t曲線的繪制 取pH8.0、50 mmol/L 的PBS 2 730 μL于試管中，依次加入乙酰膽堿酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L 的ATCI 100 μL，分別于37 ℃水浴反應(yīng)不同時(shí)間（0，5，10，15，20，25，30 min）；加入100 μL 1%的SDS終止反應(yīng)，測(cè)其在412 nm處的OD值，該實(shí)驗(yàn)用于確定酶催反應(yīng)處于穩(wěn)態(tài)的時(shí)間[3]。

1.2.3 OD-酶量（酶濃度）曲線的繪制 取pH8.0、50 mmol/L的PBS 2 730 μL，再依次加入不同濃度（0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 U/mL）的乙酰膽堿酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L的ATCI 100 μL，分別于37 ℃水浴反應(yīng)20 min（由1.2.2確定的時(shí)間），測(cè)其在412 nm處的OD 值。該實(shí)驗(yàn)用于確定是否可以用OD值表征酶活。

1.2.4 1/OD-1/[S]雙倒數(shù)曲線的繪制 根據(jù)1.2.2確定的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)時(shí)間，20 min內(nèi)的OD-t曲線具有良好的線性關(guān)系，故在此時(shí)間內(nèi)可用OD值表征反應(yīng)速度v，同理可用1/OD-1/[S]曲線代替1/v-1/[S]曲線以探討乙酰膽堿酯酶的性質(zhì)，并驗(yàn)證其是否符合米氏方程。

取pH8.0、50 mmol/L的 PBS 2 730 μL，加入2 U/mL的乙酰膽堿酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL，再分別加入不同濃度（7.5，3.75，2.5， 1.875，1.5，1.25 mmol/L）的ATCI 100 μL，分別于37 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入100 μL 1%的SDS終止反應(yīng)，測(cè)其在412 nm處的OD值。

1.2.5 樣品的制備 取10種中藥樣品置于干燥箱中以60 ℃干燥24 h，分別稱(chēng)取30 g，粉碎；用600 mL 95%的乙醇溶液分3次浸泡，以50 ℃超聲提取30 min，合并提取液，減壓濃縮，得乙醇提取物；取乙醇提取物，加適量水分散，用600 mL乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液，減壓濃縮，得到乙酸乙酯提取物（膏狀物），測(cè)定活性時(shí)再用50%的乙醇溶液分別將其溶解成1.0 mg/mL和0.1 mg/mL的樣品溶液。

1.2.6 活性測(cè)定及計(jì)算 取PBS（pH8.0，50 mmol/L）2 650 μL、樣品100 μL、乙酰膽堿酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L的ATCI 100 μL，于37 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入100 μL 1%的SDS終止反應(yīng)，測(cè)其在412 nm處的OD值，記為A樣品。

由于中藥樣品本身多有顏色，所以每個(gè)樣品同時(shí)做一個(gè)本底扣除，在上面的測(cè)定中，用100 μL 50 mmol/L的PBS代替底物溶液，測(cè)其在412 nm處的OD值，記為A本底。

空白對(duì)照用100 μL PBS來(lái)代替樣品，測(cè)其在412 nm處的OD值，記為A空白。

陽(yáng)性對(duì)照：測(cè)定方法同A樣品，反應(yīng)體系中用100 μL的他克林代替樣品溶液。

吸光值和抑制率的計(jì)算公式為：

樣品真實(shí)吸光值（A真實(shí)）為：A真實(shí)=A樣品-A本底

樣品抑制率（I）為：I=（A空白-A真實(shí)）/A空白×100%

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 非酶催反應(yīng)的光吸收

由圖1可以看出，ATCI在水浴條件下的吸光值隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，OD-t成線性關(guān)系，表明ATCI的非酶催吸光值不可忽略。

2.2 OD-t曲線確定穩(wěn)態(tài)反應(yīng)時(shí)間

由圖2可看出，本實(shí)驗(yàn)的酶反應(yīng)體系在反應(yīng)開(kāi)始后的20 min內(nèi)線性關(guān)系較好，反應(yīng)處在穩(wěn)態(tài)階段，因此可以取20 min作為該反應(yīng)體系的反應(yīng)時(shí)間，此段時(shí)間內(nèi)的OD412值可表征酶催反應(yīng)的反應(yīng)速率。

2.3 OD-酶活曲線

從圖3可以看出，在20 min的反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，酶濃度為0.8～2.8 U/mL時(shí)，酶濃度和OD值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，因此在此范圍內(nèi)可以用OD值來(lái)表征酶活。

2.4 1/OD-1/[S]曲線

從圖4可以看出，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)1/OD與1/[S]成正比，即反應(yīng)速度倒數(shù)與底物濃度倒數(shù)之間符合線性關(guān)系，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中的Sigma乙酰膽堿酯酶為米氏酶，符合米氏方程：

v=Vmax[S]/（Km+[S]）

2.5 南藥提取物的AChE抑制活性

依據(jù)1.2.5的樣品制備方法得到2種濃度的樣品溶液：1.0 mg/mL和0.1 mg/mL， 以Sigma乙酰膽堿酯酶為酶源，采用1.1.2的方法配制成酶液，按照1.2改良的Ellman方法及篩選模型，利用1.2.6的抑制率計(jì)算公式，得到10種南藥乙酸乙酯提取物在2種濃度（1.0，0.1 mg/mL）時(shí)的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在提取物濃度為1.0 mg/mL和0.1 mg/mL時(shí)，10種南藥均具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性。其中，提取物濃度為1.0 mg/mL時(shí)溪黃草、益智和化橘紅表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，平均抑制率分別達(dá)到89.59%、77.1%和67.54%；五指毛桃和絞股藍(lán)的平均抑制率都在52%；雞血藤和佛手的平均抑制率接近50%；金櫻子和決明子的平均抑制率都在40%；巴戟天的平均抑制率在選取的10種南藥中最低，為20.81%。當(dāng)提取物濃度為0.1 mg/mL時(shí)，所有10種南藥仍具有一定的抑制活性，其中益智的抑制活性最高，平均抑制率為48.04%；其次是溪黃草，平均抑制率為30.78%；佛手、五指毛桃、雞血藤和決明子等4種南藥的平均抑制率都在20%以上；化橘紅的平均抑制率為19.69%，接近20%；金櫻子和巴戟天的平均抑制率在10%以上；絞股藍(lán)的平均抑制率最低，為6.07%。

3 討論

治療AD目前最有效的方法是應(yīng)用乙酰膽堿酯酶抑制劑，尋找安全毒副作用小、選擇性強(qiáng)的藥物，目前公開(kāi)的主流方法均由Ellman法改進(jìn)而來(lái)[3，5，12]。本研究首次運(yùn)用基于Ellman法的篩選模型，對(duì)10種南藥植物進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選，結(jié)果表明，溪黃草、益智、化橘紅、佛手、五指毛桃、雞血藤、絞股藍(lán)、決明子、巴戟天、金櫻子等10種南藥均表現(xiàn)出一定的抑制活性，其中溪黃草、益智、化橘紅、佛手、五指毛桃等5種南藥在1.0 mg/mL和0.1 mg/mL 2種不同的提取物濃度下都表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制活性。研究結(jié)果可以為篩選高效、安全的乙酰膽堿酯酶抑制劑提供新線索。

南藥在用于預(yù)防和治療老年性癡呆等方面已經(jīng)有一些報(bào)道。胡增峣等[13]通過(guò)研究132首與老年癡呆有關(guān)的中藥復(fù)方，發(fā)現(xiàn)益智、巴戟天、雞血藤，決明子、化橘紅等5種南藥已作為復(fù)方中藥的配伍組成用于治療老年癡呆癥。佛手作為益智聰腦顆粒的配方能改善老年癡呆患者的總體功能[14]。五指毛桃與熟地黃、何首烏、黃精等組成的中藥制劑具有鎮(zhèn)靜安神、寧心益智的作用[15]。梁宏宇等[16]研究發(fā)現(xiàn)巴戟天膠囊對(duì)血管性癡呆患者的智能改善有一定療效。以上大部分應(yīng)用停留在中藥復(fù)方配伍的水平上，對(duì)于其中藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。劉學(xué)貴等[17]發(fā)現(xiàn)金櫻子的醇提取物對(duì)預(yù)防老年癡呆癥有一定的作用。石紹淮等[18]的研究發(fā)現(xiàn)益智正丁醇提取物可促進(jìn)老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善。金虹等[19]發(fā)現(xiàn)益智的乙醚提取物有較強(qiáng)的乙酰膽堿酯酶抑制活性，這與本研究結(jié)果比較接近，在提取方法上稍有不同。關(guān)于溪黃草和絞股藍(lán)在預(yù)防和治療老年性癡呆方面的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)溪黃草具有很強(qiáng)的乙酰膽堿酯酶抑制活性，在選取的10種南藥中排在首位；絞股藍(lán)的乙酰膽堿酯酶抑制活性在決明子、巴戟天和金櫻子之上。因此，很有必要對(duì)這些中草藥進(jìn)行進(jìn)一步的研究，揭示南藥預(yù)防和治療老年性癡呆的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從中發(fā)現(xiàn)活性更強(qiáng)的有效成分，從而為防治早老性癡呆癥的藥物研究提供有價(jià)值的活性先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。

參考文獻(xiàn)

[1] 董賢慧， 柴錫慶. 阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志， 2014， 10（34）： 5 906-5 911.

[2] 王延江，卜先樂(lè). 阿爾茨海默病的防治研究進(jìn)展[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 36（21）： 2 153-2 156.

[3] 張 翼， 馮 妍， 李曉明， 等. 海藻組分抑制乙酰膽堿酯酶活性研究[J]. 海洋與湖沼， 2005， 36（5）： 459-465.

[4] 陶紀(jì)寧. 膽堿酯酶抑制劑治療阿爾茨海默病病的研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)進(jìn)展， 2001， 25（4）： 202-206.

[5] 楊中鐸， 賴(lài)東海， 張東博， 等. 具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的總生物堿提取物的篩選[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)， 2011， 39（3）： 71-74.

[6] 殷帥文， 黃風(fēng)春， 張圓圓， 等. 不同蕨類(lèi)植物提取物乙酰膽堿酯酶抑制活性的評(píng)價(jià)[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2009， 21（5）： 854-857.

[7] 楊 赟， 劉 敏， 李 建. 藥用植物中乙酰膽堿酯酶抑制活性和抗氧化活性的篩選[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2013， 19（2）： 213-218.

[8] 駱焱平， 鄭服叢， 楊 葉. 128種南藥植物提取物對(duì)6種病原菌的生長(zhǎng)抑制作用[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2004， 25（4）： 106-111.

[9] 陳蔚文， 徐鴻華. 南藥資源的保護(hù)與可持續(xù)利用研究[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 26（3）： 201-203.

[10] 李小婷， 龐玉新， 楊 全， 等. 四大南藥資源開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)狀分析[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥， 2015， 17（2）： 99-104.

[11] Ellman G L， Courtney D， Andres V， et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[J]. Biochem Pharmacol， 1961， 7： 88-95.

[12] 孫黔云， 楊付梅. 乙酰膽堿酯酶抑制劑微量篩選模型的比較研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2008， 24（10）： 1 387-1 392.

[13] 胡增峣， 黃 晏， 劉 港. 中藥復(fù)方治療老年癡呆的用藥規(guī)律分析[J]. 中藥藥理與臨床， 2012， 28（5）： 252-256.

[14] 邵 靜， 曹淑麗. 益智聰腦顆粒聯(lián)合多奈哌齊片治療老年癡呆臨床研究[J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào)， 2013， 28（10）： 1 558-1 560.

[15] 林 惠， 梅金喜， 曾聰彥. 五指毛桃及其制劑在臨床中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)藥房， 2013， 24（15）： 1 434-1 435.

[16] 梁宏宇， 吳 偉， 陳宏珪. 巴戟素治療血管性癡呆改善語(yǔ)言功能的初步探索[J]. 現(xiàn)代康復(fù)， 2001，5（11）： 29-30.

[17] 劉學(xué)貴， 李佳駱， 高品一， 等. 藥食兩用金櫻子的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)， 2013， 34（11）： 392-398.

[18] 石紹淮， 張晨寧， 劉 冰， 等. 益智仁不同極性提取物抗老年癡呆作用的研究[J]. 中國(guó)藥房， 2013， 24（27）： 2 507-2 509.

[19] 金 虹， 胡志勇. 幾種治療AD的中藥材抑制乙酰膽堿酯酶的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中藥材， 2007， 1（30）： 69-71.