白術(shù)發(fā)生連作障礙后土壤理化性質(zhì)及根泌物的變化

陳秋強(qiáng)++胡朝暉++徐建中++倪方方++徐紅梅++宋騰蛟++袁小鳳

【摘 要】杭白術(shù)Atractylodes macrocephalae有嚴(yán)重的連作障礙，前期研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)根際土壤有機(jī)溶劑浸提物對(duì)幼苗生長(zhǎng)有顯著抑制作用，但具體是哪些化合物還不清楚。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）檢測(cè)連作后白術(shù)根際分泌物組分及含量的變化，以闡明白術(shù)的連作障礙機(jī)制。共鑒定出16種化學(xué)成分，主要為酚類(lèi)（3種）、芳香烴（3），烷烴（3），烴類(lèi)衍生物（2）、醇類(lèi)（2）、酯類(lèi)（1）、胺類(lèi)（1），除S-氰戊菊酯、氟啶胺和谷甾醇外，其余13種均為化感物質(zhì)。 在正常種植、連作2年、3年的白術(shù)根際土中均檢測(cè)到3，5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、惹烯、2，4-二叔丁基苯酚、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、2，4-二（1-苯乙基）-苯酚等5種化合物，只是這些物質(zhì)的含量隨連作年限增加而減少。連作白術(shù)根際中根泌物的種類(lèi)明顯增加，連作3年的白術(shù)死苗中檢測(cè)到15種，連作2年的死苗中有9種，其種類(lèi)遠(yuǎn)超過(guò)活苗，可見(jiàn)白術(shù)的死苗與這些化合物有著必然的聯(lián)系。綜合比較后發(fā)現(xiàn)，2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、四甲基聯(lián)苯、對(duì)二甲苯以及對(duì)氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶是導(dǎo)致白術(shù)自毒作用的主要根泌物。連作后很多白術(shù)會(huì)向土壤分泌一些化感物質(zhì)，例如2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、四甲基聯(lián)苯、對(duì)二甲苯以及對(duì)氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶，正是這些物質(zhì)的自毒作用，導(dǎo)致白術(shù)發(fā)生連作障礙，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

【關(guān)鍵詞】杭白術(shù) 連作障礙 根系分泌物 氣質(zhì)聯(lián)用儀 化感作用

白術(shù)Atractylodes macrocephalae屬菊科多年生草本，以干燥根莖入藥，是著名的道地藥材“浙八味”之一。它作為一種傳統(tǒng)的中藥材，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎之功效，常用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安等癥[1-2]。杭白術(shù)有非常嚴(yán)重的連作障礙，這不僅給藥農(nóng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且制約了我省道地藥材的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。研究表明，作物之所以有連作障礙的主要是因?yàn)橥寥览砘再|(zhì)變劣、化感自毒作用以及土壤微生物區(qū)系的改變[3]。其中，化感自毒作用主要是指連作后植物會(huì)產(chǎn)生一些化感物質(zhì)，這些物質(zhì)通過(guò)影響細(xì)胞膜通透性、酶活性、蛋白質(zhì)的合成等多種途徑來(lái)影響植物生長(zhǎng)[4]。我們的前期研究表明，白術(shù)根際土壤有機(jī)溶劑浸提物對(duì)幼苗生長(zhǎng)有顯著抑制作用[5]，但具體是哪些化合物還不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)檢測(cè)連作后白術(shù)根際土壤中的化合物，分析連作后白術(shù)根際土壤中有機(jī)化合物成分及含量的變化，為探討杭白術(shù)的連作障礙機(jī)制提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

野外栽培實(shí)驗(yàn)設(shè)在規(guī)范栽培基地磐安，實(shí)驗(yàn)田分3組：連作3年的杭白術(shù)、連作2年的杭白術(shù)，第1年種植的杭白術(shù)。試驗(yàn)地設(shè)在同一塊地，土壤類(lèi)型完全相同，每組1m×5m，相鄰而種，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)專(zhuān)人管理。

連作白術(shù)的死苗率很高，而未連作的白術(shù)沒(méi)有死苗，為分析死苗和活苗的根際土差異，我們分別采集活苗和死苗的根際土。在7月份一個(gè)晴天的下午采樣，利用土培收集法收集根分泌[6]，具體如下：按照五點(diǎn)采樣法分別采集連作3年、連作2年以及種植1年的白術(shù)根際土，同時(shí)采集連作3年、連作2年的死亡白術(shù)的根際土。采集根際土的方法如下：先撥開(kāi)表層土，將整株根系從土壤中挖出，抖掉與根系松散結(jié)合的土塊，然后將與根系緊密結(jié)合在4mm 范圍內(nèi)的土壤用毛刷刷下，過(guò)2mm尼龍篩后即為根際土，然后裝袋帶回。此外，收集附近未種植物的空地土壤，過(guò)篩、裝袋，速帶回實(shí)驗(yàn)室，自然風(fēng)干，備用。每組樣品3個(gè)重復(fù)。

1.2 土壤理化性質(zhì)分析

利用電極法測(cè)土壤pH[7]。稱(chēng)取10g過(guò)20目篩的風(fēng)干土樣于50 mL 燒杯中，加入25 mL 無(wú)CO2 蒸餾水，用玻璃棒混和均勻，靜置30 min，同時(shí)注意避免空氣中NH4或揮發(fā)性酸等氣體的影響。將玻璃電極與甘汞電極插入土壤懸液中，讀取pH值。每份樣品測(cè)定結(jié)束后即用蒸餾水沖洗電極，并用干濾紙將水吸干，每份樣品測(cè)三次。

采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法[8]，稱(chēng)1g過(guò)100目篩的風(fēng)干土樣，放入50mL普通試管中，加5mL重鉻酸鉀溶液和5mLH2SO4，搖勻（同時(shí)做無(wú)土樣空白），放入100℃恒溫箱中，90min后放冷水浴中冷卻，用注射器加水至50mL，搖勻停放3h或過(guò)夜，取上清液比色，用1cm光徑比色杯在590nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收值。用空白樣液調(diào)比色計(jì)零點(diǎn)。

采用靛酚比色法（苯酚-次氯酸鈉比色法）測(cè)土壤脲酶活性[9]。稱(chēng)取5.0000g過(guò)100目篩的風(fēng)干土樣于50mL三角瓶中，用1mL甲苯處理（以能全部使土樣濕潤(rùn)為度），15min后加入10mL 10%尿素溶液和20mL檸檬酸鹽緩沖液（pH6.7）。仔細(xì)混合后，將反應(yīng)物放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，對(duì)每個(gè)樣品設(shè)用10mL水代替基質(zhì)作有土無(wú)基質(zhì)對(duì)照，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)無(wú)土無(wú)基質(zhì)對(duì)照。過(guò)濾后取3mL濾液于50mL容量瓶中，加水至20mL，再加入4mL苯酚鈉，仔細(xì)混合，加入3mL次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20min，用水稀釋至刻度。將著色液在分光光度計(jì)上于578nm處進(jìn)行比色測(cè)定。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

采用磷酸苯二鈉比色法[9]測(cè)土壤磷酸酶活性。稱(chēng)取5.0000g過(guò)100目篩的風(fēng)干土樣于50mL三角瓶中，加入0.25mL甲苯，再加入20mL 0.5%磷酸苯二鈉溶液，充分振蕩后于37℃溫育2h，對(duì)每個(gè)樣品設(shè)用20mL水代替基質(zhì)作有土無(wú)基質(zhì)對(duì)照，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)無(wú)土無(wú)基質(zhì)對(duì)照。取培養(yǎng)后的濾液5mL置于50mL容量瓶，加入蒸餾水20mL，再加入0.25mL氯化銨-氫氧化銨緩沖液（pH9.8），0.5mL 2% 4-氨基氨替比林液，0.5mL 8%鐵氰化鉀液，每次加入試劑都要充分搖勻，最后定容至刻度，15min內(nèi)在分光光度計(jì)上于510nm處進(jìn)行比色測(cè)定。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.3 土壤中有機(jī)化合物的提取

每組稱(chēng)取根際土10 g，加入100 mL蒸餾水溶解，然后振蕩離心，上清液即為根分泌物，濃縮后至于具塞錐形瓶中，加入正己烷50 mL淹沒(méi)樣品，20 ℃超生浸提30 min（SK2510HP超聲波清洗儀，上海右一儀器有限公司），離心、過(guò)濾得上清液，20 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至1 mL（R-201濃縮儀，上海申順生物科技有限公司），過(guò)0.45μm微孔有機(jī)濾膜后，作GC-MS檢測(cè)。

1.4 GC-MS分析

檢測(cè)儀器為安捷倫氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（氣相色譜儀Agilent Technologies 7890；質(zhì)譜檢測(cè)器Agilent Technologies 5975）。采用電子轟擊源，轟擊電壓70eV，掃描范圍M/Z30-500，掃描速度0.4s掃描全程。毛細(xì)管柱：SE-54（30 m×0. 25 mm ×0. 25 μm），離子源溫度：230 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；接口溫度：280 ℃；箱溫度程：70 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃；載氣為He，流量1mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。通過(guò)質(zhì)譜分析和計(jì)算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)普庫(kù)檢索，并采用峰面積歸一化法確定各化合物的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果分析

2.1 連作后土壤理化性質(zhì)的變化

白術(shù)活株根際土的pH值和磷酸酶活性低于死株的根際土，但活株根際土的有機(jī)質(zhì)含量高于死株根際土如圖1。土壤理化性質(zhì)的差異說(shuō)明了白術(shù)在不同時(shí)期會(huì)分泌不同的根泌物，這些根泌物會(huì)影響土壤的理化性質(zhì)。同時(shí)，土壤也會(huì)反過(guò)來(lái)影響白術(shù)的生長(zhǎng)。隨著連作年限的上升，白術(shù)根際土的pH明顯升高，而磷酸酶活性則表現(xiàn)出先上升，在第三年下降的趨勢(shì)。有機(jī)質(zhì)的含量變化不大，范圍為2.5-2.66%。與非根際土相比，根際土的pH和磷酸酶活性均上升。

利用GC-MS對(duì)不同生長(zhǎng)年限、不同生長(zhǎng)狀態(tài)的杭白術(shù)根際土壤浸提液進(jìn)行質(zhì)譜掃描，質(zhì)譜如圖2所示。各色譜峰通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)在Willey等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中查找，匹配度在80%以上的有機(jī)化合物共16種如表1，主要為酚類(lèi)（3種）、芳香烴（3），烷烴（3），烴類(lèi)衍生物（2）、醇類(lèi)（2）、酯類(lèi)（1）、胺類(lèi)（1），除S-氰戊菊酯、氟啶胺和谷甾醇外，其余13種均為化感物質(zhì)。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)查，S-氰戊菊酯為農(nóng)藥殘留物[10]，氟啶胺是一種保護(hù)性殺菌劑，對(duì)誘發(fā)杭白術(shù)白絹病的致病菌有抑制作用[11]。谷甾醇具有抑菌活性[12]，除此之外，其余13種均為化感物質(zhì)。

2.2 連作對(duì)白術(shù)根際分泌物的影響

在種植1年的白術(shù)根際土中檢測(cè)到了5種化合物，包括酚類(lèi)3種、烯烴類(lèi)1種、醛類(lèi)1種，而連作白術(shù)根際土中也檢測(cè)到這5種物質(zhì)，這些分泌物的含量隨著種植年限的增加均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，說(shuō)明連作后白術(shù)根分泌3，5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、惹烯、2，4-二叔丁基苯酚、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、2，4-二（1-苯乙基）-苯酚等物質(zhì)的量會(huì)減少。此外，在連作白術(shù)根際土中，除了這5種物質(zhì)以外，還檢測(cè)到糞甾烷-3-醇及8-異丙基-1，3-二甲基菲、S-氰戊菊酯，這3種物質(zhì)的含量均表現(xiàn)出連作3年比連作2年更高，說(shuō)明連作會(huì)促進(jìn)這些物質(zhì)分泌。

2.3 白術(shù)死亡后根際分泌物的變化

連作后，白術(shù)會(huì)產(chǎn)生連作障礙。比較死苗和活苗白術(shù)的根際分泌物組分發(fā)現(xiàn)，死亡白術(shù)根際土中化合物種類(lèi)明顯增加，連作3年的白術(shù)死苗中檢測(cè)到15物質(zhì)，而活苗中僅有8種；連作2年的死苗中檢測(cè)到9種物質(zhì)，活苗僅6種，可見(jiàn)白術(shù)的死苗與這些化合物有著必然的聯(lián)系，連作促進(jìn)了白術(shù)化感物質(zhì)的分泌。連作2年的白術(shù)死苗根際比活株中多了3種化合物，分別為8-異丙基-1，3-二甲基菲、氟啶胺、糞甾烷-3-醇；而連作3年的白術(shù)死苗根際則比活株多了7種化合物，分別為2，2'，5，5'-四甲基聯(lián)苯、對(duì)二甲苯、2，6，10，14，18-正二十二烷、二十九烷、對(duì)氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶、氟啶胺、谷甾醇，這些多出的化合物必定與連作障礙相關(guān)。此外，2，6-二叔丁基對(duì)甲酚的百分比在連作3年的死苗根際最高，其含量是連作3年活苗的26倍，連作2年活苗的8倍，是正常種植白術(shù)的6倍，值得進(jìn)一步關(guān)注。2，4-二（1-苯乙基）-苯酚在死苗根際的含量均比活苗高，而2，4-二叔丁基苯酚則在死苗根際的含量比活苗低。

2.4 根際土壤與非根際土壤中化合的差異

在白術(shù)非根際土中一共檢測(cè)到了8種化合物，有7種與白術(shù)根際相同，說(shuō)明這些化合物可能是土壤中共有的物質(zhì)。其中，1-乙苯基-1-苯基乙烷是白術(shù)非根際其特有的。與非根際土相比，種植杭白術(shù)后的土壤中新出現(xiàn)了7種化合物，分別是2，2'，5，5'-四甲基聯(lián)苯、對(duì)二甲苯、8-異丙基-1，3-二甲基菲、對(duì)氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶、氟啶胺、S-氰戊菊酯。

3 討論

研究表明，根泌物對(duì)土壤顆粒大小、分布情況、吸附性、穩(wěn)定性及親水性等物理性質(zhì)均有顯著影響[13]。根泌物還能影響根際土壤pH，究其原因，主要是因?yàn)橹参锔鶎?duì)陰陽(yáng)離子吸收不均衡[14]、以HCO3-、Cl-和SO42-為主植物根泌物中有機(jī)陰離子的釋放[15]、根泌物中含草酸、檸檬酸和蘋(píng)果酸等有機(jī)酸[17-20]、植物根部的呼吸作用[21-22]等。我們研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)連作死苗的根際pH明顯高于活苗，說(shuō)明白術(shù)根泌物分泌會(huì)提高根際土壤酸度，而死亡以后這種影響也隨之消失。

白術(shù)忌連作，其種過(guò)之地須隔 5-10 年才能再種，否則其病害發(fā)病率大大提高，嚴(yán)重時(shí)甚至絕苗絕收。安信伯等[10]研究結(jié)果表明，重茬白術(shù)易患根腐病，所引起的死苗率達(dá)50%以上，重病田則達(dá)90%。我們?cè)谶B作1年、2年的土壤上繼續(xù)種植白術(shù)，發(fā)現(xiàn)其死苗率也在一半以上。比較不同連作年限的白術(shù)活苗根分泌物發(fā)現(xiàn)，無(wú)論連作與否，或連作2年還是3年，其活苗中的根泌物種類(lèi)基本相同，均包括3，5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、惹烯、2，4-二叔丁基苯酚、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、2，4-二（1-苯乙基）-苯酚等物質(zhì)，差異主要體現(xiàn)在分泌的量不同。連作后這些化感物質(zhì)分泌量明顯減少，而且這些物質(zhì)在白術(shù)的非根際土中也有檢測(cè)到，說(shuō)明這些化合物含量的增加或減少應(yīng)該不是導(dǎo)致白術(shù)死亡的主要原因，但2，6-二叔丁基對(duì)甲酚例外。它雖然在所有樣品中均檢測(cè)到，但在死苗中的含量遠(yuǎn)超活苗，而且隨著連作年限增加含量急劇上升，說(shuō)明2，6-二叔丁基對(duì)甲酚是連作白術(shù)的化感自毒物質(zhì)，它的高分泌量應(yīng)該是白術(shù)死苗的主要原因之一。

大量報(bào)道稱(chēng)，酚類(lèi)物質(zhì)具有一定自毒作用，可抑制種子的萌發(fā)、幼苗的生長(zhǎng)、以及通過(guò)影響核酸和蛋白質(zhì)合成而抑制植物的生長(zhǎng)[11]。張新慧等[12]發(fā)現(xiàn)2，4-二叔丁基苯酚對(duì)?？浦参锲【苹℉umulus lupulus具有強(qiáng)烈的化感自毒作用。高濃度的2， 4 - 二叔丁基苯酚作用下啤酒花根際微生物數(shù)量下降，多樣性指數(shù)降低，其地上生產(chǎn)力也相對(duì)較低。馬云華[13]研究表明，酚酸類(lèi)物質(zhì)能夠刺激真菌的繁殖與生長(zhǎng)，或是為真菌的生長(zhǎng)提供了有效碳源，而連作白術(shù)大部分死亡原因是白術(shù)感染了真菌土傳病害如根腐病、白絹病等[14]。此外，酚類(lèi)物質(zhì)還可破壞細(xì)胞的完整性使病原菌入侵[15]。白術(shù)之所以死亡，是因?yàn)檫B作后白術(shù)向土壤中分泌了高濃度的2，6-二叔丁基對(duì)甲酚，該化感物質(zhì)的存在促進(jìn)了真菌尤其是致病真菌在白術(shù)根部土壤中的生長(zhǎng)和富集，同時(shí)由于酚類(lèi)物質(zhì)的存在白術(shù)根部細(xì)胞遭到破壞，致使病菌更容易入侵植物根部，最終導(dǎo)致白術(shù)的連作障礙。具體機(jī)制還有待于下一步研究證實(shí)。

在檢測(cè)到的白術(shù)根泌物中，大部分均為化感物質(zhì)，這些物質(zhì)可通過(guò)浸析、揮發(fā)、植物殘?bào)w分解和根系分泌等方式進(jìn)入環(huán)境中[25-26]。其中，根系分泌物種類(lèi)復(fù)雜，其組成和含量的變化是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫最直接、最明顯的反應(yīng)[27-28]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)栽植土壤的有機(jī)溶劑浸提液對(duì)白術(shù)幼苗生長(zhǎng)有顯著抑制作用，推測(cè)導(dǎo)致白術(shù)連作障的原因很可能是白術(shù)的自毒作用。GC-MS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生連作障礙的白術(shù)死苗根際中的確分離到了很多化合物，其化合物的種類(lèi)遠(yuǎn)超過(guò)未發(fā)生連作障礙的白術(shù)活苗。對(duì)照白術(shù)活苗和死苗根際、不同連作白術(shù)活苗根際，以及白術(shù)根際與非根際中的各類(lèi)化合物的組成與含量，綜合分析認(rèn)為，除2，6-二叔丁基對(duì)甲酚外，四甲基聯(lián)苯、對(duì)二甲苯以及對(duì)氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶等化感物質(zhì)的分泌可能也是導(dǎo)致白術(shù)死苗的主要原因。

4 結(jié)語(yǔ)

由于根際土壤中化合物的種類(lèi)較多，包含不同極性的化學(xué)成分，本研究采用GC-MS主要分析了杭白術(shù)根際土壤化合物中非極性成分。研究結(jié)果表明，連作后很多白術(shù)會(huì)向土壤分泌一些化感物質(zhì)，其中2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、四甲基聯(lián)苯、對(duì)二甲苯以及對(duì)氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶，由于這些物質(zhì)的存在，最終導(dǎo)致白術(shù)發(fā)生連作障礙而死苗，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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