斑茅成熟種子愈傷誘導(dǎo)及再生體系的建立

張瑜++鄢家俊++馬海天才++白史且++張建波++張勁++彭燕++李達(dá)

旭

摘要：為建立斑茅[Erianthus arundinaceum （Retz.） Jeswiet.]的組織培養(yǎng)再生體系，以斑茅的成熟種子為材料，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化和根分化中的植物生長調(diào)節(jié)劑配比及濃度進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，①M(fèi)S中添加0.1～0.2 mg/L的6-BA與1.0～3.0 mg/L的2，4-D愈傷誘導(dǎo)率最高；MS中添加0.5 mg/L的2，4-D時(shí)胚性愈傷誘導(dǎo)率達(dá)54.29%。②MS中添加0.5 mg/L的6-BA與1～2 mg/L的KT更易促進(jìn)芽的分化，芽分化率71.11%。③1/2MS中添加20 g/L的蔗糖促進(jìn)生根效果最好，根分化率96.97%。

關(guān)鍵詞：斑茅[Erianthus arundinaceum （Retz.） Jeswiet.]；愈傷誘導(dǎo)；再生體系；6-BA；2，4-D；KT

中圖分類號(hào)：S566 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）08-1570-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.043

Callus Induction of Mature Seed of Erianthus arundinaceus and Establishment

of the Regeneration System

ZHANG Yu1， YAN Jia-jun1， MAHAI Tian-cai2， BAI Shi-qie1，

ZHANG Jian-bo1， ZHANG Jin1， PENG Yan3， Li Da-xu1

（1.Sichuan Grassland Science Academy， Chengdu 611731， China； 2.Sichuan Sihai Brilliant Ecological Environment Engineering Co.， Ltd.， Chengdu 610041， China；3.Department of Grassland， Sichuan Agricultural University， Yaan 625014， Sichuan， China）

Abstract： For establishing the regeneration system of Erianthus arundinaceus， mature seed of Erianthus arundinaceus was used as test material， the phytohormone combination and phytohormone concentration of callus induction， bud initiation and striking root of Erianthus arundinaceus were screened. The results showed that： ①The highest callus induction efficiency used the MS-medium adding 0.1～0.2 mg/L 6-BA and 1.0～3.0 mg/L 2，4-D. Induction rate of embryonic callus was 54.29% using MS-medium adding 0.5 mg/L 2，4-D. ②Bud initiation was 71.11% using MS-medium adding 0.5 mg/L 6-BA and 1～2 mg/L KT. ③Striking root initiation was 96.97% using 1/2 MS-medium adding 20 g/L Cane sugar.

Key words： Erianthus arundinaceum（Retz.） Jeswiet.； callus induction； regeneration system； 6-BA； 2，4-D； KT

斑茅[Erianthus arundinaceum（Retz.） Jeswiet.]是蔗茅屬（Erianthus）多年生草本植物，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生物量大、富含纖維素等特性，為潛在的能源植物。以斑茅作為能源植物代替玉米、甘蔗、高粱等糧食作物來生產(chǎn)新型清潔能源燃料乙醇，具有不與人畜爭糧、不與糧爭地，降低碳排放，打破目前以不可再生的石油為主要能源的局面，緩解能源危機(jī)。在美國與歐洲，柳枝稷（Panicum virgatum）、芒屬（Miscanthus）作為能生產(chǎn)燃料乙醇的能源草研究較多[1-4]；而在中國，柳枝稷也被引進(jìn)作為能源草研究[5-8]，但對(duì)于在中國廣泛分布、具有本土優(yōu)勢的斑茅用于能源開發(fā)的研究起步較晚。Tew等[9]將斑茅植物基因用于改良能源用甘蔗，Santiago等[10]就甘蔗及其近緣種斑茅等作為能源用植物進(jìn)行了系統(tǒng)闡述。2009年，四川草原科學(xué)研究院能源草研究團(tuán)隊(duì)開始對(duì)中國國內(nèi)大部分地區(qū)的斑茅資源進(jìn)行了廣泛收集與評(píng)價(jià)[11，12]，同時(shí)從斑茅的外部形態(tài)[13]、遺傳多樣性[14，15]、能源用潛力評(píng)價(jià)方面[16]做了大量研究，寧祖林等[17]、曾漢元等[18]對(duì)斑茅進(jìn)行能源用潛力評(píng)價(jià)，但對(duì)斑茅纖維發(fā)酵工藝研究仍處在探索性研究階段[19]。

斑茅雖富含纖維素，但其木質(zhì)素的特殊結(jié)構(gòu)，使得纖維素酶呈不可逆狀態(tài)吸附在木質(zhì)素上，降低纖維素酶的活性，使得纖維素本身難以分解[20]，木質(zhì)素含量高成為其生產(chǎn)燃料乙醇的主要障礙。本研究旨在篩選愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比及濃度，優(yōu)化斑茅再生體系，為利用RNAi技術(shù)創(chuàng)制低木質(zhì)素斑茅材料提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

斑茅野生植株采集于海南昌江路邊荒地（19°19′N，108°58′E），保存于四川省大邑縣韓場鎮(zhèn)四川省草原科學(xué)研究院基地內(nèi)；斑茅種子于2013年9-12月收集。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理 以斑茅種子為外植體，將采集回的斑茅成熟種子用鑷子剝出，無菌水浸泡12 h備用。消毒處理為70%乙醇浸泡30 s，無菌水漂洗2～3次，用0.1% HgCl2溶液表面滅菌7～10 min，無菌水漂洗3～5次。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 愈傷組織誘導(dǎo)采用培養(yǎng)基配方為MS+A（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 2，4-D）+B（0、0.5、1.0、1.5、3.0、6.0 mg/L 6-BA）+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5.8。其中6-BA和2，4-D的處理濃度共計(jì)36個(gè)處理組合，每瓶接種20塊外植體，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，置于25 ℃下暗培養(yǎng)，每隔20 d左右更換一次新鮮培養(yǎng)基。暗培養(yǎng)20 d左右后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率；再培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷率，胚性愈傷為顆粒狀、致密的淡黃色或者淡綠色的愈傷組織。愈傷誘導(dǎo)率=（出愈數(shù)/接種數(shù)）×100%；胚性愈傷誘導(dǎo)率=（胚性愈傷數(shù)/出愈數(shù)）×100%。

1.2.3 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 在暗培養(yǎng)條件下，將培養(yǎng)出的胚性愈傷組織，剝離后轉(zhuǎn)到2，4-D 1 mg/L、6-BA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，溫度（25±1） ℃，每隔20 d左右更換一次新鮮培養(yǎng)基。

1.2.4 芽分化 經(jīng)過繼代培養(yǎng)，將結(jié)構(gòu)致密、顆粒狀、淡黃色的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，芽分化培養(yǎng)基為MS+C（0.5、1.0 mg/L 6-BA）+D（0.5、1.0、2.0 mg/L KT）+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5.8，共計(jì)6個(gè)處理組合，每瓶接種10塊愈傷，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。置（25±1）℃、2 000 lx下光照培養(yǎng)。每隔20 d左右更換一次新鮮培養(yǎng)基，逐漸生出叢生芽，形成無根幼苗，統(tǒng)計(jì)分化率。芽分化率=（分化出芽的愈傷數(shù)/接種的愈傷數(shù)）×100%。

1.2.5 根分化 將幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，根分化培養(yǎng)基為E（MS、1/2MS）+F（10、20、30 g/L蔗糖）+瓊脂7 g/L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5.8，6個(gè)處理組合，每瓶接種正常芽分化愈傷10塊，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)。置（25±1）℃、2 000 lx下光照培養(yǎng)，每隔20 d左右更換一次新鮮培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)生根率。根分化率=（生根苗數(shù)/接種的幼苗數(shù)）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的2，4-D和6-BA對(duì)斑茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1中可以看出，在36個(gè)處理中，有17個(gè)處理的愈傷誘導(dǎo)率在76.67%以上，且17個(gè)處理差異不顯著；2，4-D濃度為0 mg/L的6個(gè)處理未能誘導(dǎo)出愈傷組織，說明在斑茅的愈傷誘導(dǎo)中不能缺少2，4-D；愈傷誘導(dǎo)率在93.00%以上的處理共有6個(gè)，其中6-BA濃度為0.2 mg/L有4個(gè)，說明該濃度的6-BA更有利于斑茅愈傷組織的形成。A2B5、A3B3、A3B4的愈傷誘導(dǎo)率均為100.00%，說明這3個(gè)處理的愈傷誘導(dǎo)的效果最好，即2，4-D濃度為1.0～3.0 mg/L。從產(chǎn)生胚性愈傷個(gè)數(shù)來看，處理A1B2高達(dá)5.00個(gè)，其次是處理A4B3（4.67個(gè)）以及A4B4和A3B3（3.33個(gè)），除2，4-D濃度為0 mg/L的6個(gè)處理沒有形成胚性愈傷外，還有處理A2B6未形成胚性愈傷，說明適宜濃度的2，4-D是形成胚性愈傷的關(guān)鍵。從胚性愈傷誘導(dǎo)率來看，50.00%以上的處理只有A1B2；40.00%以上的處理有A4B3、A6B2和A6B5；2，4-D濃度為0 mg/L的6個(gè)處理與A2B6胚性愈傷誘導(dǎo)率為0.00%。故MS中添加0.1～0.2 mg/L的6-BA與1.0～3.0 mg/L的2，4-D是誘導(dǎo)斑茅愈傷組織的最佳配比。

2.2 不同濃度的6-BA和KT對(duì)斑茅愈傷分化成芽的影響

從表2中可以看出，處理C1D2和C1D3的芽分化率最高，均為71.11%，顯著高于其他處理；其后依次為C1D1（46.67%）、C2D1（35.56%）、C2D2（33.33%）和C2D3（28.89%），4個(gè)處理均差異不顯著。故MS中添加0.5 mg/L的6-BA與1.0～2.0 mg/L的KT是促進(jìn)斑茅愈傷組織分化成芽的最佳配比。

2.3 不同培養(yǎng)基和不同濃度蔗糖對(duì)斑茅愈傷分化生根的影響

以1/2MS和MS培養(yǎng)基添加不同濃度的蔗糖來誘導(dǎo)幼苗生根。從表2中可以看出，分化率最高的處理是E1F2（96.97%），其后依次是E1F3（89.75%）、E1F1（77.78%）、E2F1（72.22%）、E2F3（60.61%）和 E2F2（53.33%）。E1F2和E1F3差異不顯著，但是顯著高于其他4個(gè)處理。故1/2MS中添加20 g/L的蔗糖促進(jìn)生根效果最好。

3 小結(jié)與討論

生長調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)中有著重要的作用。在斑茅的再生體系研究中，通過在MS培養(yǎng)基中調(diào)整生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度來研究其對(duì)斑茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，2，4-D是斑茅形成愈傷的限制性因子，即所有2，4-D濃度為0 mg/L的處理均未產(chǎn)生愈傷，這與前人的研究結(jié)果一致[21]。斑茅愈傷組織誘導(dǎo)率與2，4-D濃度呈一定相關(guān)性[22]，在添加0～3.0 mg/L 2，4-D的范圍內(nèi)愈傷誘導(dǎo)率隨著2，4-D濃度的增高而增高，當(dāng)超過3.0 mg/L則出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象，且隨著濃度的增高，抑制現(xiàn)象更加明顯；同樣添加6-BA對(duì)愈傷誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，但濃度超過0.3 mg/L后也出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn)MS中添加0.1～0.2 mg/L的6-BA與1.0～3.0 mg/L的2，4-D愈傷誘導(dǎo)率最高， 6-BA濃度為0 mg/L、2，4-D濃度為0.5 mg/L的胚性愈傷誘導(dǎo)率最高，愈傷誘導(dǎo)率則約為90.00%，2，4-D和6-BA配合使用的愈傷組織誘導(dǎo)率要高于單獨(dú)使用2，4-D[23]。但愈傷誘導(dǎo)率越高不等于可用的胚性愈傷就越多，而胚性愈傷才是形成再生苗的關(guān)鍵，篩選最佳生長調(diào)節(jié)劑要綜合誘導(dǎo)愈傷與誘導(dǎo)胚性愈傷兩者。故本研究得出MS中添加0.1～0.2 mg/L的6-BA與1.0～3.0 mg/L的2，4-D愈傷誘導(dǎo)率最高；MS中添加0.5 mg/L的2，4-D胚性愈傷誘導(dǎo)率最高。在根分化中，在1/2MS培養(yǎng)基中添加20g/L的蔗糖效果最好。其次是 1/2MS培養(yǎng)基中添加30 g/L蔗糖，說明在生根分化中1/2MS培養(yǎng)基配方優(yōu)于MS培養(yǎng)基，且適當(dāng)降低蔗糖含量更有利于幼苗的生根。

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