非小細(xì)胞肺癌組織中Slitrk5的表達(dá)及意義

孫金鵬，田濤，陳玲，劉燕春，孔繼昌

(1滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北滄州061000；2華北石油管理局總醫(yī)院；3滄州市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

非小細(xì)胞肺癌組織中Slitrk5的表達(dá)及意義

孫金鵬1，田濤2，陳玲3，劉燕春2，孔繼昌2

(1滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北滄州061000；2華北石油管理局總醫(yī)院；3滄州市醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校)

目的 觀察非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中Slitrk5的表達(dá)情況，探討其與患者臨床病理特征的關(guān)系。方法 收集69例NSCLC患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織，采用qRT-PCR法檢測(cè)Slitrk5 mRNA表達(dá)，免疫組化染色法觀察Slitrk5蛋白表達(dá)情況，Western blot法檢測(cè)Slitrk5蛋白表達(dá)量，并分析Slitrk5蛋白高表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 癌組織中Slitrk5 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于癌旁組織(P均<0.05)。Slitrk5蛋白高表達(dá)在NSCLC患者不同性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 Slitrk5在NSCLC肺癌組織中高表達(dá)，可能與NSCLC的發(fā)生相關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；神經(jīng)跨膜蛋白；Slitrk5；腫瘤分化程度

Slitrk蛋白家族是一類調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞突起生長的因子，能夠控制軸突生長、調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長發(fā)育，在神經(jīng)元細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致軸突生長受到抑制。近年研究發(fā)現(xiàn)，Slitrk蛋白家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Slitrk3和Slitrk4在腦腫瘤中高度表達(dá)，尤其是在惡性程度高的腫瘤中，Slitrk4高表達(dá)更為明顯[1]；Slitrk3在淋巴瘤組織中表達(dá)上調(diào)[2]，在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)上調(diào)，且與胃腸道間質(zhì)瘤的分級(jí)和預(yù)后相關(guān)[3]；Slitrk6在膀胱癌、肺原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移性癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈陽性表達(dá)[4]，可作為晚期胃腸腫瘤一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[5]，同時(shí)也是尿路上皮癌生物標(biāo)志物ASG-15ME的靶基因[6]。然而有關(guān)Slitrk5在實(shí)體瘤中作用的研究較少。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理類型，患者一經(jīng)確診多為晚期，預(yù)后極差[7]。分子靶向治療對(duì)NSCLC的診療具有重要意義。本研究觀察了Slitrk5在NSCLC組織中的表達(dá)，并探討其與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系，旨在為NSCLC的分子靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2016年1月滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院住院手術(shù)的69例NSCLC患者，男45例、女24例，年齡35～81歲、中位年齡60歲。均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診，術(shù)前未進(jìn)行化放療。根據(jù)2004版WHO肺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，鱗癌30例、腺癌30例、腺鱗癌6例、大細(xì)胞肺癌3例；伴周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例；TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ～Ⅲ期62例。取手術(shù)切除的癌組織和相應(yīng)的癌旁正常組織(距癌組織邊緣≥2 cm)，4%甲醛中性緩沖液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2 Slitrk5 mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法。取組織標(biāo)本，用TRIzol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以各組cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。Slitrk5上游引物：5′-TATTTACACACCACCCCGGC-3′，下游引物：5′-TGGGACACTCCAAAGGCAC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。反應(yīng)體系：模板2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，72 ℃后延伸7 min，共40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以目的基因與內(nèi)參基因表達(dá)比值表示目的基因表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 Slitrk5蛋白定性檢測(cè) 石蠟標(biāo)本60 ℃烘烤2 h，采用EnVision二步法進(jìn)行免疫組化染色。雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，90 ℃微波抗原修復(fù)8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h；Slitrk5鼠抗人一抗(1∶200)室溫孵育1 h后4 ℃過夜；聚合物增強(qiáng)劑室溫孵育20 min，酶標(biāo)抗鼠聚合物室溫孵育25 min，常規(guī)DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽性片作陽性對(duì)照。以細(xì)胞膜呈棕色染色為陽性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡×400視野下，每個(gè)樣本選取5個(gè)視野，觀察陽性細(xì)胞所占比例，無陽性細(xì)胞計(jì)0分，1%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～80%計(jì)3分，>80%計(jì)4分。以≥3分為高表達(dá)，<3分為低表達(dá)。

1.4 Slitrk5蛋白定量檢測(cè) 采用Western blot法。取新鮮冰凍肺癌組織和癌旁組織，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定濃度，取50 μg蛋白進(jìn)行電泳，SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗鼠抗人Slitrk5抗體/鼠抗人β-Tubulin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加二抗HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體(1∶5 000)孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。采用Image J分析圖像，以Slitrk5/β-Tubulin灰度比值表示Slitrk5蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Slitrk5 mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較 Slitrk5 mRNA在癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為5.32±0.57、1.26±0.37，二者比較P<0.05。其中55例(79.7%)癌組織中Slitrk5 mRNA表達(dá)高于癌旁組織。

2.2 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況比較 Slitrk5蛋白在癌組織中的高表達(dá)率為72.5%(50/69)，在癌旁組織中的高表達(dá)率為15.9%(11/69)，二者比較P<0.05。

2.3 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)量比較 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.768 3±0.265 0、0.218 9±0.072 2，二者比較P<0.05。

2.4 Slitrk5蛋白高表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Slitrk5蛋白高表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

3 討論

Slitrk蛋白家族在氨基酸鏈末端的跨膜結(jié)構(gòu)域有2個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，并與軸突導(dǎo)向因子Slit高度同源，其C末端結(jié)構(gòu)與神經(jīng)營養(yǎng)受體原肌球蛋白受體激酶(Trk)具有高度同源性[8，9]，Slitrk蛋白可以介導(dǎo)類似于Trk受體的一些生物功能，如神經(jīng)突向外生長和樹突細(xì)化，突出形成和神經(jīng)元存活[10，11]。人類Slitrk5蛋白是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包含958個(gè)氨基酸，定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸，介導(dǎo)突觸的形成[12，13]。Slitrk5主要在神經(jīng)組織表達(dá)，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)突活動(dòng)的作用。前人對(duì)Slitrk5的研究主要集中在精神疾病領(lǐng)域[14]。新近研究發(fā)現(xiàn)，Slitrk5作為TrkB信號(hào)共受體，可以通過調(diào)控TrkB的內(nèi)吞后回收，從而促進(jìn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。BDNF/TrkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其下游信號(hào)通路(PI3K/Akt、MAPK和PLC)與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。Slitrk5的同源蛋白Slitrk3、Slitrk5、Slitrk6均已證明在腫瘤組織中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但目前尚無有關(guān)Slitrk5在實(shí)體瘤中表達(dá)情況的報(bào)道。

表1 Slitrk5蛋白高表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

本研究顯示，Slitrk5蛋白在NSCLC組織中的高表達(dá)率為72.5%，顯著高于癌旁組織；qRT-PCR、免疫組化染色及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Slitrk5在癌組織中的mRNA及蛋白表達(dá)均高于癌旁組織，但Slitrk5蛋白高表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)。表明Slitrk5在NSCLC組織中表達(dá)升高，Slitrk5蛋白高表達(dá)可能與NSCLC的發(fā)生相關(guān)，但與NSCLC的發(fā)展及轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)。這種不相關(guān)性可能與基礎(chǔ)細(xì)胞的增殖、存活能力相關(guān)，但還需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。除此之外，Slitrk5蛋白在NSCLC惡性過程的分子機(jī)制和功能還尚不清楚，還需要深入研究。

綜上所述，NSCLC組織中Slitrk5高表達(dá)，可能與NSCLC的發(fā)生有關(guān)，Slitrk5可作為NSCLC的分子靶向治療的相關(guān)靶點(diǎn)，在NSCLC基因治療中具有一定的臨床應(yīng)用前景。

[1] 靳雁斌,范文紅,范明.Slitrk基因家族的研究進(jìn)展[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志,2006,26(2):159-161.

[2] Milde T, Shmelkov SV, Jensen KK, et al. A novel family of slitrk genes is expressed on hematopoietic stem cells and leukemias[J]. Leukemia, 2007,21:824-827.

[3] Wang CJ, Zhang ZZ, Jia X, et al. SLITRK3 expression correlation to gastrointestinal stromaltumor risk rating and prognosis[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(27):8398-8407.

[4] Yang P, Coleman J, Li Y, et al. Abstract 1274: SLITRK6, the target of a novel antibody drug conjugate AGS15E, is expressed in bladder and other cancers[J]. Cancer Res, 2013,73(Suppl 8):1274-1274.

[5] Sanford T, Porten S, Meng MV. Molecular analysis of upper tract and bladder urothelial carcinoma: results from a microarray comparison[J]. PLoS One, 2015,10(8):1-10.

[6] Morrison K, Challita-Eid PM, Raitano A, et al. Development of ASG-15ME, a novel antibody drug conjugate targeting SLITRK6, a new urothelial cancer biomarker[J]. Mol Cancer Ther, 2016,15(6):1301-1310.

[7] Jemal A, Forman D, Bray F, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[8] Aruga J, Yokota N, Mikoshiba K. Human SLITRK family genes: genomic organization and expression profiling in normal brain and brain tumor tissue[J]. Gene, 2003,315:87-94.

[9] Aruga J, Mikoshiba K. Identification and characterization of Slitrk, a novel neuronal transmembrane protein family controlling neurite outgrowth[J]. J Bacteriol, 2003,24(1):117-129.

[10] Proenca CC, Gao KP, Shmelkov SV, et al. Slitrks as emerging candidate genes involved in neuropsychiatric disorders[J]. Trends Neurosci, 2011,34(3):143-153.

[11] Ko J. The leucine-rich repeat superfamily of synaptic adhesion molecules: LRRTMs and Slitrks[J]. Mol Cells, 2012,34(4):335-340.

[12] Yim YS, Kwon Y, Nam J, et al. Slitrks control excitatory and inhibitory synapse formation with LAR receptor protein tyrosine phosphatases[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(10):4057-4062.

[13] Takahashi H, Katayama K, Sohya K, et al. Selective control of inhibitory synapse development by Slitrk3-PTPδ trans-synaptic interaction[J]. Nat Neurosci, 2012,15(3):389-398.

[14] Zhang K, Feng Y, Wigg KG, et al. Association study of the SLITRK5 gene and Tourette syndrome[J]. Psychiatr Genet, 2015,25(1):31-34.

[15] Song M, Giza J, Proenca C, et al. Slitrk5 Mediates BDNF-Dependent TrkB Receptor Trafficking and Signaling[J]. Dev Cell, 2015,33(6):690-702.

[16] 莫賽軍,鄭乃剛,曹文波,等.BDNF/TrkB信號(hào)途徑與抗腫瘤治療[J].癌變·畸變·突變,2014,26(6):476-478.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.014

R734.2

B

1002-266X(2017)06-0043-03

2016-06-28)