白芍總苷對糖尿病腎病大鼠的治療作用及對腎組織TGF-β1、CTGF表達的影響

宋菲，楊發(fā)奮

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000)

白芍總苷對糖尿病腎病大鼠的治療作用及對腎組織TGF-β1、CTGF表達的影響

宋菲，楊發(fā)奮

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000)

目的 觀察白芍總苷(TGP)對糖尿病腎病(DN)大鼠的治療作用，及其對腎組織TGF-β1、CTGF表達的影響，探討其腎臟保護機制。方法 采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立DN模型，隨機分成正常對照組、DN組及TGP低、中、高劑量組。正常對照組、DN組每天給予生理鹽水灌胃，TGP低、中、高劑量組分別給予50、100、200 mg/(kg·d)TGP灌胃。實驗8周末觀察各組體質(zhì)量、血糖、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24 h尿蛋白定量，并行免疫組化法檢測腎組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)與結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達。結(jié)論 與正常對照組相比，DN組血糖升高、體質(zhì)量下降、BUN和24 h尿蛋白定量明顯升高(P均<0.01)。與DN組相比，TGP各劑量組大鼠BUN水平均降低，TGP高劑量組24 h尿蛋白定量減少(P均<0.01)；TGP中、高劑量組腎組織CTGF、TGF-β1表達均降低(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 TGP灌胃對DN大鼠具有治療作用，可改善腎功能，下調(diào)TGF-β1、CTGF在腎組織中的表達，從而發(fā)揮保護腎臟、延緩DN進展的作用。

白芍總苷；糖尿病腎病；大鼠；轉(zhuǎn)化生長因子；結(jié)締組織生長因子；大鼠

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)并發(fā)微血管改變的最常見并發(fā)癥之一，是引起終末期腎病的主要原因，同時也是DM患者的主要死亡原因之一。DN進展可能與持續(xù)性的低濃度炎癥反應(yīng)和細胞外基質(zhì)(ECM)不斷累積有關(guān)[1]，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)與結(jié)締組織生長因子(CTGF)在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TGF-β1可刺激成纖維細胞生成ECM、降低多種ECM降解酶的活性、誘導(dǎo)腎小管上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，促使腎小球硬化的發(fā)生[2]；激活腎小管上皮細胞啟動自噬，促使腎小管變性，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[3]。在正常腎臟組織內(nèi)，CTGF表達很低或無表達；在病理狀態(tài)下，CTGF可促進成纖維細胞增生、移動、黏附，加快ECM增生及小管上皮細胞轉(zhuǎn)化[4]。在CTGF啟動子的激活過程中，TGF-β1是最重要的激活因子，可通過Smad3介導(dǎo)而誘導(dǎo)CTGF表達[5]。另一方面，CTGF作為TGF-β1的下游信號因子反作用于TGF-β1，加速其致纖維化進程[6]。白芍總苷(TGP)是從白芍干燥根中提取的混合物，具有抗炎、抗氧化、免疫活性調(diào)節(jié)等作用。2015年6～8月，我們對DN模型大鼠給予不同劑量TGP進行治療，觀察其對腎組織TGF-β1、CTGF表達的影響，探討TGP對DN大鼠的腎臟保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(230±10)g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物室提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。TGP(寧波立華制藥有限公司，用前溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中)，STZ(北京博愛港商貿(mào)有限公司)；尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)檢測試劑盒(上海科華生物工程有限公司)，尿白蛋白、尿蛋白檢測試劑盒(武漢博士德有限公司)；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠CTGF多克隆抗體(武漢博士德有限公司)。

1.2 模型制備與分組處理 隨機選取50只大鼠，給予STZ 60 mg/kg腹腔注射。其余10只作為正常對照組，腹腔注射等量生理鹽水。DN造模成功的標(biāo)準：STZ腹腔注射72 h后空腹血糖13.8～25 mmol/L，2周后24 h尿白蛋白排泄率高于對照組，且24 h尿蛋白定量大于造模前的50%。排除實驗過程中死亡的大鼠，將造模成功的大鼠隨機分成DN組及TGP低、中、高劑量組各9只。TGP低、中、高劑量組分別給予TGP 50、100、200 mg/kg灌胃，按大鼠體質(zhì)量計算TGP劑量后溶于2 mL的1%羧甲基纖維素鈉溶液中；正常對照組和DN組給予1%的羧甲基纖維素鈉溶液2 mL灌胃，均1次/d。

1.3 指標(biāo)觀察方法

1.3.1 體質(zhì)量、血糖及腎功能檢測 每周使用DT-2000型電子天平檢測大鼠體質(zhì)量，使用血糖儀監(jiān)測大鼠空腹血糖。實驗8周后，禁食不禁水，留取各組大鼠24 h尿液，使用日本Olympus AU-2700型全自動生化分儀檢測24 h尿蛋白定量;取尾靜脈血，檢測BUN、SCr。

1.3.2 腎組織TGF-β1、CTGF表達檢測 采用免疫組化方法。取大鼠腎組織置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋后，切4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化、組織抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10 min。依次加入一抗、二抗，37 ℃靜置30 min，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。每只大鼠制片3張，采用Image-Pro Plus 6.0彩色病理圖像分析軟件。計算每張片上每個腎小球陽性染色的積分光密度(IOD)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量、血糖及腎功能比較 與正常對照組相比，DN組體質(zhì)量降低、血糖升高、24 h尿蛋白定量升高、BUN升高(P均<0.01)。與DN組比較，TGP各劑量組血糖、體質(zhì)量、Scr均無統(tǒng)計學(xué)差異，TGP各劑量組BUN均降低(P均<0.01)；TGP高劑量組24 h尿蛋白定量較DN組降低(P<0.01)，低、中劑量組24 h尿蛋白定量與DN組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 各組體質(zhì)量、血糖及腎功能比較±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與DN組比較，△P<0.01。

2.2 各組腎組織TGF-β1、CTGF表達比較 與正常對照組相比，DN組腎組織TGF-β1、CTGF表達升高(P均<0.01)，TGP中、高劑量組TGF-β1、CTGF表達降低(P均<0.01)；與DN組比較，TGP中、高劑量組CTGF、TGF-β1表達降低(P<0.05或<0.01)；TGP低劑量組TGF-β1、CTGF表達降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組腎組織TGF-β1、CTGF表達比較

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與DN組比較，*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

DN早期主要表現(xiàn)為持續(xù)微量白蛋白尿、腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多，繼而導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，腎小球纖維化和腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病進展成為終末期腎病的共同通路[7]。DM患者體內(nèi)炎癥因子、黏附因子及趨化因子表達增加，巨噬細胞在以上因子的誘導(dǎo)下活化，繼而產(chǎn)生多種炎癥因子和細胞因子，造成腎小球的血管內(nèi)皮細胞損傷、基底膜受損、系膜細胞增生、系膜基質(zhì)增多，使腎損傷不斷進展，最終導(dǎo)致腎小球纖維化。在促纖維化細胞因子的作用下，腎小球系膜區(qū)的ECM增多，腎小球硬化隨之產(chǎn)生，腎臟逐漸失去正常的生理功能。TGF-β1在成纖維細胞增殖、上皮細胞分化及ECM合成等環(huán)節(jié)中起重要作用，能夠促進膠原與基質(zhì)形成并抑制其降解。細胞因子CTGF是重要的促組織纖維化蛋白，在結(jié)締組織的合成與降解、成纖維細胞的增殖、遷移、黏附以及ECM表達均起重要作用[8]。Gore-Hyer等[9]發(fā)現(xiàn)，CTGF可通過介導(dǎo)人系膜細胞表達膠原蛋白使ECM沉積，誘導(dǎo)糖蛋白表達使上皮細胞轉(zhuǎn)化為間皮細胞，在DN腎纖維化進程中發(fā)揮重要作用。CTGF是介導(dǎo)TGF-β1的早期即刻基因[10]，CTGF作為其下游信號因子發(fā)揮促纖維化作用，TGF-β1和CTGF在許多纖維化疾病中表達同步增高。近期研究表明，通過抑制TGF-β1/Smads信號通路及其下游CTGF因子的表達，可能改善DM大鼠癥狀并保護其腎組織[11]。本研究顯示，與正常對照組相比，DN組腎組織中TGF-β1、CTGF表達增加，提示二者在腎組織中的表達與DN的腎臟病理改變密切相關(guān)。

TGP為毛莨科植物白芍內(nèi)提取成分，其主要成分為芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗炎、保肝以及多途徑抑制自身免疫反應(yīng)等多種藥理作用。動物實驗表明，TGP能抑制DM大鼠腎組織中炎癥因子及細胞因子的表達，起到保護腎臟的作用[12，13]。Wu等[14]認為，TGP可減少DM大鼠AER、抑制腎組織ECM蛋白Ⅳ型膠原的產(chǎn)生，對DM大鼠的腎小管間質(zhì)損傷起到明顯的治療作用。袁亮等[15]研究表明，TGP可降低DM大鼠的24 h尿白蛋白排泄率，抑制腎組織ECM蛋白Ⅳ型膠原產(chǎn)生；其機制可能是通過抑制TGF-β1表達來抑制腎小管間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化過程，從而延緩DN的纖維化進程。鄒曉榮等[16]報道，DN患者在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用TGP膠囊治療6個月后，患者24 h尿蛋白定量減少，肌酐清除率上升，生活質(zhì)量明顯改善。

本研究顯示，對DN大鼠采用不同劑量TGP干預(yù)治療后；BUN均下降,高劑量組24 h尿蛋白定量減少。推測TGP可能通過減輕炎癥反應(yīng)、減輕足細胞的損傷，從而減少蛋白尿的排泄，改善DN大鼠的腎功能。與正常對照組相比，DN組Scr雖有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與檢測前大鼠長時間禁食導(dǎo)致代謝減少有關(guān)，也可能是實驗觀察時間較短，大鼠腎功能的喪失尚不足以導(dǎo)致Scr明顯降低。免疫組化結(jié)果提示，中、高劑量組腎組織TGF-β1、CTGF較DN組下降，提示TGP可下調(diào)TGF-β1、CTGF表達，從而起到保護腎臟的作用。表明TGP可以減少尿蛋白，降低血清BUN，達到改善腎功能、保護腎臟的作用，其機制可能與下調(diào)TGF-β1、CTGF表達有關(guān)。

綜上所述，TGP對DN大鼠具有治療作用，可改善腎功能，下調(diào)TGF-β1、CTGF在腎組織中的表達，起到保護腎臟、延緩DN進展的作用

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楊發(fā)奮(E-mail: wotanlong@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.011

R587.2

A

1002-266X(2017)06-0035-03

2016-10-12)