香葉醇對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響

江金垚，陳亞麗

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院)

香葉醇對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響

江金垚1，陳亞麗2

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院)

目的 研究香葉醇對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖和遷移的影響，并探討其分子機(jī)制。方法 取雄性SD大鼠的胸腹主動(dòng)脈血管，采用貼塊法分離、培養(yǎng)VSMCs。將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、對(duì)照組、低濃度組及高濃度組，陰性對(duì)照組加入無FBS的DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，低濃度組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液及香葉醇50 μmol/L，高濃度組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液及香葉醇400 μmol/L。采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力，Western blot法檢測Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路的表達(dá)。結(jié)果 對(duì)照組細(xì)胞增殖的OD值較陰性對(duì)照組升高；低、高濃度組OD值低于對(duì)照組，且高濃度組低于低濃度組(P均<0.05)；對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組增加，低、高濃度組遷移細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組，且高濃度組少于低濃度組(P均<0.05)；對(duì)照組Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路激活較陰性對(duì)照組明顯；低、高濃度組與對(duì)照組相比Ras-MEK1/2- ERK1/2信號(hào)通路激活受抑制，且高濃度組較低濃度組抑制效應(yīng)更明顯(P均<0.05)。結(jié)論 香葉醇可抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，其機(jī)制之一可能是抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的激活。

香葉醇；血管平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路；絲裂原活化蛋白激酶

冠心病患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)術(shù)后易發(fā)生支架內(nèi)再狹窄(ISR)。PCI術(shù)后血管平滑肌的增殖與遷移形成新生內(nèi)膜，加上各種炎性細(xì)胞募集，細(xì)胞外基質(zhì)合成，最終導(dǎo)致ISR發(fā)生。盡管藥物洗脫支架的應(yīng)用已大幅減少ISR風(fēng)險(xiǎn)，但其發(fā)生率仍超過10%[1]。香葉醇是一種植物單萜醇，具有抗細(xì)胞增殖[2]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]、阻滯細(xì)胞周期[4]、抗氧化應(yīng)激[5]、降低血漿TG和TC[6]及抑制脂肪代謝相關(guān)酶表達(dá)[7]等作用，可發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的心血管保護(hù)作用。Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的經(jīng)典通路之一，對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖和遷移起重要作用。2016年，我們觀察了香葉醇對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖及遷移的影響，并檢測Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路，以Ras表達(dá)增加及MEK1/2、ERK1/2磷酸化程度增加達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為激活狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，觀察其激活情況，探討其可能的分子機(jī)制，為預(yù)防和治療ISR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量80～100 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。香葉醇(Sigma公司，美國)；胎牛血清(FBS)；DMEM培養(yǎng)基；0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美國)；MTT試劑盒(Millipore，美國)；抗Ras、MEK1/2、P-MEK1/2、ERK1/2、P-ERK1/2、β-actin抗體(Cell Signaling Technology，美國)，抗兔第二抗體(Rockland公司，美國)。

1.2 VSMCs的分離和培養(yǎng) 將大鼠常規(guī)處死，取胸腹主動(dòng)脈血管，分離血管周圍組織，縱向剖開血管，剪成表面積0.5～1 mm2的組織塊，平鋪于含F(xiàn)BS的無菌培養(yǎng)瓶底部，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育7 d，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組與處理 細(xì)胞生長至80%融合后，換用無FBS的DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)16 h，使細(xì)胞處于靜止期。將細(xì)胞分為4組，陰性對(duì)照組繼續(xù)用無FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，對(duì)照組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，低濃度組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液+香葉醇50 μmol/L，高濃度組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液+香葉醇400 μmol/L。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。四組細(xì)胞處理24、48 h后，每孔加入MTT 5 mg/mL 40 μL，37 ℃、5% CO2孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜100 μL，振蕩10 min，置酶標(biāo)儀上，于490 nm波長處測各孔吸光度OD值。

1.5 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。四組細(xì)胞處理24、48 h后，用無菌吸頭在細(xì)胞生長至80%融合的6孔板上劃一細(xì)痕。PBS洗去被刮下的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，低倍鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。任取3個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.6 Ras-MEK1/2-ERK1/2相關(guān)通路蛋白檢測 采用Western blot法。四組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌，刮取細(xì)胞，加入PBS，離心棄上清。加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，再以超聲波粉碎細(xì)胞，離心收集上清。加入蛋白酶抑制劑，按照BCA試劑盒說明測定上清液中的蛋白濃度，收集上清蛋白樣品-80 ℃保存待用。配制12% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，蛋白樣品與2×上樣緩沖液1∶1混合，沸水浴10 min，上樣至凝膠孔，進(jìn)行SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳，5%脫脂奶粉封閉2 h，依次加入一抗(1∶200)、二抗(1∶2 000)，室溫孵育，TBST洗膜，加發(fā)光劑顯色，Bio-Rad Geldoc 2000圖像分析儀進(jìn)行掃描分析。以Ras蛋白與內(nèi)參β-actin的比值表示Ras的相對(duì)表達(dá)量，以磷酸化MEK通路(P-MEK)蛋白與總的MEK通路(T-MEK)蛋白的比值表示MEK的磷酸化程度，以磷酸化ERK通路(P-ERK)蛋白與總的ERK通路(T-ERK)蛋白的比值表示ERK的磷酸化程度。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 與陰性對(duì)照組比較，對(duì)照組OD值較陰性對(duì)照組升高；低濃度組和高濃度組OD值低于對(duì)照組，且高濃度組低于低濃度組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較±s)

注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05。

2.2 各組細(xì)胞遷移數(shù)比較 陰性對(duì)照組、對(duì)照組、低濃度組、高濃度組細(xì)胞遷移數(shù)分別為(6.28±1.18)、(57.39±4.81)、(36.11±4.20)、(12.83±2.41)個(gè)。對(duì)照組較陰性對(duì)照組增加，低、高濃度組較對(duì)照組減少，高濃度組少于低濃度組(P均<0.05)。

2.3 各組Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路激活水平比較 與陰性對(duì)照組比較，對(duì)照組Ras信號(hào)通路激活明顯，高濃度組和低濃度組Ras信號(hào)通路與對(duì)照組相比激活受抑制，且高濃度組較低濃度組抑制效應(yīng)更明顯(P均<0.05)。同樣，對(duì)于Ras信號(hào)通路下游的MEK1/2和ERK1/2信號(hào)通路，對(duì)照組發(fā)生明顯磷酸化，低、高濃度組磷酸化受抑制，且高濃度組較低濃度組抑制效應(yīng)更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組Ras信號(hào)通路表達(dá)及MEK1/2、ERK1/2信號(hào)通路磷酸化程度比較±s)

注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05。

3 討論

PCI術(shù)后ISR的發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，目前一般認(rèn)為是由于球囊擴(kuò)張破壞粥樣硬化斑塊，致血小板黏附、聚集和激活，活化的血小板釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，引發(fā)平滑肌細(xì)胞增生、白細(xì)胞募集和凝血瀑布激活，平滑肌細(xì)胞由收縮狀態(tài) 轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣蔂顟B(tài)，在血管中膜開始增殖，并逐漸由中膜遷移到內(nèi)膜，隨后形成新生內(nèi)膜，各種炎性細(xì)胞如單核細(xì)胞、T細(xì)胞和少量B細(xì)胞在這一過程中被募集，再加上透明質(zhì)酸、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致ISR的發(fā)生[8,9]。ISR實(shí)際上是局部血管損傷后的再修復(fù)過程，這個(gè)過程涉及血管彈性回縮、血栓形成、炎癥因子活化以及血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡[10]。

天然香葉醇能夠通過抑制細(xì)胞遷移、下調(diào)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)、抑制Ras-ERK信號(hào)通路磷酸化、抑制活性氧生成等途徑抑制細(xì)胞增殖以及抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)基因家族蛋白等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2，11]，抑制腫瘤細(xì)胞生長。最新研究顯示，香葉醇可通過減少血漿TG、TC及抑制脂肪代謝相關(guān)酶表達(dá)發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[6，7]。本研究發(fā)現(xiàn)，香葉醇能顯著抑制大鼠VSMCs增殖和遷移，且隨著濃度增高，抑制效應(yīng)更趨明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，香葉醇能抑制增殖相關(guān)Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的激活，且隨濃度增高，抑制效應(yīng)更明顯。Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路是MAPK的經(jīng)典通路，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用[12]。在這一通路中，Ras是上游信號(hào)蛋白，引導(dǎo)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，而ERK1/2對(duì)細(xì)胞增殖和遷移至關(guān)重要[13]。多種細(xì)胞因子、生長因子、炎癥因子等刺激信號(hào)，激活Ras原癌基因所介導(dǎo)的Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起ERK1/2發(fā)生磷酸化激活，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白Cyclin D等合成增加，引起蛋白合成和細(xì)胞增殖[14]。

綜上所述，香葉醇具有抑制大鼠VSMCs增殖和遷移的作用，其機(jī)制與抑制增殖相關(guān)Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路激活有關(guān),為香葉醇用于預(yù)防ISR提供了理論依據(jù)。

[1] Giacoppo D, Gargiulo G, Aruta PT, et al. Treatment strategies for coronary in-stent restenosis: systematic review and hierarchical Bayesian network meta-analysis of 24 randomised trials and 4880 patients[J]. BMJ, 2015,351(6364):1-18.

[2] Wittig C, Scheuer C, Parakenings J, et al. Geraniol suppresses angiogenesis by downregulating vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGFR-2 signaling[J]. PLoS One, 2015,10(7):e0131946.

[3] Galle M, Crespo R, Kladniew BR, et al. Suppression by geraniol of the growth of A549 human lung adenocarcinoma cells and inhibition of the mevalonate pathway in culture and in vivo: potential use in cancer chemotherapy[J]. Nutr Cancer, 2014,66(5):888-895.

[4] Kim SH, Bae HC, Park EJ, et al. Geraniol inhibits prostate cancer growth by targeting cell cycle and apoptosis pathways[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,407(1):129-134.

[5] Jayachandran M, Chandrasekaran B, Namasivayam N. Geraniol attenuates oxidative stress by Nrf2 activation in diet-induced experimental atherosclerosis[J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol, 2015,26(4):335-346.

[6] Galle M, Kladniew BR, Castro MA, et al. Modulation by geraniol of gene expression involved in lipid metabolism leading to a reduction of serum-cholesterol and triglyceride levels[J]. Phytomedicine, 2015,22(7/8):696-704.

[7] Jayachandran M, Chandrasekaran B, Namasivayam N. Effect of geraniol，a plant derived monoterpene on lipids and lipid metabolizing enzymes in experimental hyperlipidemic hamsters[J]. Mol Cell Biochem, 2015,398(1/2):39-53.

[8] Jolly K, Gill P. Ethnicity and cardiovascular disease prevention: practical clinical considerations[J]. Curr Opin Cardiol, 2008,23(5):465-470.

[9] Yin RX, Yang DZ, Wu JZ. Nanoparticle drug- and gene-eluting stents for the prevention and treatment of coronary restenosis[J]. Theranostics, 2014,4(2):175-200.

[10] Guildford AL, Stewart HJ, Morris C, et al. Substrate-induced phenotypic switches of human smooth muscle cells: an in vitro study of in-stent restenosis activation pathways[J]. J R Soc Interface, 2011,8(58):641-649.

[11] Chaudhary SC, Siddiqui MS, Athar M, et al. Geraniol inhibits murine skin tumorigenesis by modulating COX-2 expression，Ras-ERK1/2 signaling pathway and apoptosis[J]. J Appl Toxicol, 2013,33(8):828-837.

[12] Raman M, Chen W, Cobb MH. Differential regulation and properties of MAPKs[J]. Oncogene， 2007,26(22):3100-3112.

[13] Roberts PJ, Der CJ. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer[J]. Oncogene, 2007,26(22):3291-3310.

[14] Roovers K, Davey G, Zhu X, et al. Alpha5beta1 integrin controls cyclin D1 expression by sustaining mitogen-activated protein kinase activity in growth factor-treated cells[J]. Mol Biol Cell, 1999,10(10):3197-3204.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.009

R541.4

A

1002-266X(2017)06-0029-03

2016-06-15)