• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    孕酮對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型腦白質(zhì)少突細胞標記物O1和O4表達的影響

    2017-05-25 00:37:25雷賢明曹云濤
    臨床兒科雜志 2017年4期
    關鍵詞:白質(zhì)腦室孕酮

    雷賢明 楊 潔 曹云濤

    遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院新生兒科(貴州遵義 563000)

    孕酮對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型腦白質(zhì)少突細胞標記物O1和O4表達的影響

    雷賢明 楊 潔 曹云濤

    遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院新生兒科(貴州遵義 563000)

    目的探討孕酮對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化(PVL)動物模型腦室周圍白質(zhì)O1和O4表達的影響。方法2日齡新生SD大鼠隨機分為模型組、實驗組、假手術組。模型組和實驗組結扎左側頸總動脈并吸入低氧氣源(8%O2+92%N2)0.5 h制備PVL動物模型,實驗組腦缺氧缺血后立即腹腔注射孕酮 10 mg/(kg·d);假手術組只分離左側頸總動脈不結扎、不缺氧。術后1、4、7、14天比較三組腦組織病理改變,免疫組織化學染色方法檢測三組大鼠各個時點腦室旁白質(zhì)區(qū)O1、O4表達。結果

    孕酮; 腦室周圍白質(zhì)軟化; 少突細胞標記物O4; 少突細胞標記物O1; 新生大鼠

    隨著新生兒重癥監(jiān)護病房(NICU)救治水平的提升,極低出生體質(zhì)量兒、超低出生體質(zhì)量兒的存活率提高,早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病率也逐漸增加。腦室周圍白質(zhì)軟化(periventricular leukomalacia,PVL)是早產(chǎn)兒腦損傷的主要形式,是導致早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育、行為障礙及腦癱的主要原因[1]。PVL發(fā)病與腦缺氧缺血關系密切。本實驗通過腦缺氧缺血制備新生大鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型,早期給予孕酮干預,觀察新生大鼠腦室周圍白質(zhì)病理改變及晚期少突膠質(zhì)細胞前體標記物O1(oligodendrocyte marker O1)和O4的表達變化,探討孕酮對新生大鼠腦室周圍白質(zhì)軟化動物模型的神經(jīng)保護作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及分組

    2日齡清潔級SD大鼠,體質(zhì)量(7.65±0.12)g,雌雄不拘。親代雌鼠及雄鼠購買于第三軍醫(yī)大學醫(yī)學實驗動物中心,編號:scxk(渝)2012-0005。納入實驗動物120只,每組40只,保證各時點有8只大鼠成功造模。實驗中共死亡大鼠25只,死亡大鼠另行補充。

    將新生SD大鼠隨機分為模型組、實驗組及假手術組。模型制備參照Taniguchi等[2,3]大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,分離并結扎左側頸總動脈,術后室溫中恢復1 小時,隨后吸入8%O2+92%N2低氧混合氣體0.5小時。假手術組只分離左側頸總動脈,不結扎、不缺氧;給藥參照Li等[4]模型組及假手術組腹腔注射芝麻油0.1 mL,實驗組腹腔注射0.5 g/L的孕酮溶液10 mg/kg,間隔24小時1次,連續(xù)3次,用藥完畢后送回母鼠身邊喂養(yǎng)。

    1.2 方法

    1.2.1 腦組織病理切片制備 三組大鼠于術后1、4、7、14天各取8只,4%多聚甲醛穿心注射處死,制作腦組織標本,進行石蠟包埋切片和蘇木精-伊紅(HE) 染色。腦組織自丘腦中1/3平面開始連續(xù)冠狀切片,片厚4μm,切面包括腦室、胼胝體、腦室周圍白質(zhì)等部位,常規(guī)HE染色觀察三組腦室周圍白質(zhì)病理改變。

    1.2.2 腦室周圍白質(zhì)O4和O1表達檢測 經(jīng)丘腦中1/3平面開始連續(xù)冠狀切片,通過免疫組織化學法(SP染色)檢測腦室周圍白質(zhì)O1和O4的表達,操作按說明書進行。一抗(兔來源,O1稀釋度1:100,O4稀釋度1:100,均購買于R&D USA),二抗(羊抗兔抗體,均購買于上?;蚩萍加邢薰荆1、O4染色均以細胞膜著色呈黃色或棕色為陽性細胞。每只大鼠隨機選取3張切片,在400倍光鏡下隨機選取腦室周圍白質(zhì)3個檢測面積相同的陽性細胞區(qū)域由Image-Pro Plus 6.0細胞圖像分析軟件完成圖像采集并處理數(shù)據(jù)。1.3 統(tǒng)計學分析

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t法;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 三組新生鼠的一般情況

    模型組、實驗組新生大鼠結扎左側頸總動脈后出現(xiàn)不同程度的發(fā)紺、皮膚蒼白、呼吸減慢;在缺氧艙中缺氧期間,新生大鼠表現(xiàn)為煩躁不安,時有陣發(fā)性點頭狀、上肢屈曲及下肢伸直狀抖動,全身皮膚蒼白、青紫,缺氧結束后10~30 min,皮膚青紫逐漸好轉(zhuǎn),其他癥狀均于術后1天內(nèi)消失,實驗中模型組和實驗組大鼠共死亡25只。假手術組無青紫、皮膚蒼白、煩躁及四肢抖動等癥狀。

    2.2 三組新生鼠腦組織病理改變

    假手術組在術后各時間點腦室周圍白質(zhì)區(qū)細胞排列整齊,結構完整,雙側腦室對稱。術后1天模型組及實驗組大鼠均出現(xiàn)腦室周圍白質(zhì)神經(jīng)細胞稀疏、水腫、排列紊亂;術后4天模型組腦室周圍白質(zhì)區(qū)組織結構疏松明顯,出現(xiàn)細胞水腫、壞死、核固縮,小膠質(zhì)細胞較多;術后7天模型組腦室周圍白質(zhì)區(qū)有液化性壞死,有篩孔狀壞死灶及囊腔形成,左側側腦室稍擴大;術后14天模型組左側側腦室進一步擴大,腦室周圍出現(xiàn)軟化灶,白質(zhì)區(qū)出現(xiàn)新生血管、膠質(zhì)細胞增生;術后4、7、14天實驗組腦室周圍白質(zhì)病變與模型組病理改變相似,但較輕,新生血管、膠質(zhì)細胞增生明顯。見圖1。

    2.3 三組新生大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O4表達變化

    三組大鼠在術后不同時間點(1、4、7和14天)腦室旁白質(zhì)區(qū)O4陽性細胞的IOD值差異有統(tǒng)計學意義(F= 220.37~500.29,P均<0.001);術后1、4、7天腦室旁白質(zhì)區(qū)O4陽性細胞IOD值逐漸增加,術后7天達高峰,術后14天較7天明顯下降。在不同時間點,三組大鼠之間O4陽性細胞的IOD值差異有統(tǒng)計學意義(F=341.53~624.33,P均<0.001);在各個時間點,模型組與實驗組O4陽性細胞的積分光密度(IOD)值均較假手術組低,模型組更低于實驗組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1、圖2。

    2.4 三組新生大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O1表達變化

    三組大鼠在術后不同時間點(1、4、7和14天)腦室旁白質(zhì)區(qū)O1陽性細胞的IOD值差異有統(tǒng)計學意義(F=351.48~790.49,P均<0.001);腦室旁白質(zhì)區(qū)O1陽性細胞IOD值于術后1、4、7天逐漸上升,術后7天達最高值,術后14天陽性表達減少。在不同時間點,三組大鼠之間O1陽性細胞的IOD值差異有統(tǒng)計學意義(F=155.46~447.11,P均<0.001);在各個時間點,模型組與實驗組O1陽性細胞的IOD值均較假手術組低,模型組更低于實驗組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2、圖3。

    圖1 三組術后7天腦組織病理改變和14天腦室大小變化

    圖2 三組大鼠術后7天腦室周圍白質(zhì)區(qū)O4表達(SP×400)

    圖3 三組大鼠術后7天腦室周圍白質(zhì)區(qū)O1表達(SP×400)

    表1 不同時間三組大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O4陽性細胞IOD值比較 (n=8,±s)

    表1 不同時間三組大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O4陽性細胞IOD值比較 (n=8,±s)

    注:1)與假手術組比較,P<0.01;2)與模型組比較,P<0.01

    組 別 術后1 天 術后4 天 術后7天 術后14 天 F值 P假手術組 30 718.23±1 369.60 34 572.70±1 338.35 41 599.70±1 805.57 35 618.67±1 383.31 220.37 <0.001模型組 18 689.76±959.211) 25 495.60±1 132.271)29 894.43±1 107.931)24 722.16±949.431) 500.29 <0.001實驗組 24 939.86±1 173.741)2)29 730.60±1 129.481)2)38 855.97±1 048.041)2)33 581.87±1 708.761)2) 470.93 <0.001 F值 624.33 341.53 483.03 421.38 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001

    表2 不同時間三組大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O1陽性細胞IOD值比較 (n=8,x±s)

    3 討論

    早產(chǎn)兒腦損傷主要是腦白質(zhì)損傷和腦室周圍-腦室內(nèi)出血,腦白質(zhì)損傷包括PVL和彌漫性腦白質(zhì)損傷,是導致早產(chǎn)兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的主要原因[5],其發(fā)生與早產(chǎn)兒腦血管解剖的特殊性、壓力被動性腦血流、晚期少突膠質(zhì)細胞前體對缺氧缺血高度敏感及宮內(nèi)感染有關。生后1~5天新生SD大鼠少突膠質(zhì)細胞以晚期少突膠質(zhì)細胞前體細胞為主,主要分布于腦室周圍白質(zhì)、胼胝體和皮質(zhì)下白質(zhì),2日齡SD大鼠的晚期少突膠質(zhì)細胞前體數(shù)量最多,易受缺氧缺血或感染損傷。本研究實驗動物選用2日齡SD大鼠,與人類24~32周早產(chǎn)兒發(fā)生PVL的時間窗一致[6]。經(jīng)腦組織HE染色病理檢查證實,本研究中新生2日齡鼠腦缺氧缺血后腦室周圍白質(zhì)區(qū)、皮質(zhì)下白質(zhì)神經(jīng)細胞出現(xiàn)水腫,細胞間隙增寬;隨著日齡增加,可見液化性壞死灶,有篩孔狀壞死灶及囊腔形成,左側側腦室稍擴大,到術后14天時PVL模型組左側腦室進一步擴大,腦室周圍出現(xiàn)軟化灶,與早產(chǎn)兒PVL的病理改變相符,說明選擇2日齡新生SD大鼠經(jīng)腦缺血缺氧后成功制作PVL模型。

    研究表明,晚期少突膠質(zhì)細胞前體的特異性標記抗原O4(+),未成熟的少突膠質(zhì)細胞O4(+)、O1(+),晚期少突膠質(zhì)細胞前體受損后發(fā)育成為未成熟少突膠質(zhì)細胞的數(shù)量減少,從而使O4、O1陽性細胞的表達減少[7]。因此檢測腦室周圍白質(zhì)中O4、O1陽性細胞的表達情況可反映少突膠質(zhì)細胞的受損以及發(fā)育成熟程度。本研究三組新生大鼠術后4天開始O1陽性細胞逐漸增多、7天達高峰、14天開始下降,符合新生鼠出生少突膠質(zhì)細胞分化成熟過程和特點。各個時點O1和O4的表達均以假手術組最多、實驗組次之、模型組最少,提示2日齡新生鼠腦缺氧缺血導致晚期少突膠質(zhì)細胞前體受損,使未成熟的少突膠質(zhì)細胞減少,導致O1陽性和O4陽性細胞減少;外源性應用孕酮后可減輕新生鼠腦缺氧缺血所致腦室周圍白質(zhì)病理損害,提示外源性孕酮可促進腦室周圍白質(zhì)O1和O4的表達,使晚期少突膠質(zhì)細胞前體向未成熟少突膠質(zhì)細胞發(fā)育和分化,促進髓鞘形成,對腦白質(zhì)損傷起到保護作用[8]。

    孕酮除在卵巢和胎盤可合成外,在神經(jīng)系統(tǒng)的星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞中也能合成,其受體主要位于海馬、大腦皮質(zhì)、小腦、下丘腦、嗅球等部位[9],孕酮與少突膠質(zhì)細胞的分化成熟、髓鞘形成,以及神經(jīng)發(fā)育有關[10]。生理水平的孕激素在體內(nèi)和體外均有神經(jīng)保護作用,腦損傷后其血中水平迅速增加,與受損神經(jīng)修復有關,對神經(jīng)損傷有明顯的保護作用。動物實驗表明,孕酮可通過減輕腦細胞水腫、調(diào)節(jié)炎癥反應、抑制凋亡、改善神經(jīng)元存活等途徑,發(fā)揮對創(chuàng)傷性腦損傷、缺血性腦損傷、脊髓病變、周圍神經(jīng)病變、脫髓鞘病變等的神經(jīng)保護作用[11]。臨床上已開始應用孕酮治療腦損傷并取得了一定療效[12]。本研究觀察腦組織病理改變和腦白質(zhì)O1、O4表達,結果提示孕酮對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化有神經(jīng)保護作用,為臨床上應用孕酮防治早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷提供了新的思路。

    [1]Serenius F, K?llén K, Blennow M, et al. Neurodevelopmental outcome in extremely preterm infants at 2.5 years after active perinatal care in Sweden [J]. JAMA, 2013, 309(17):1810-1820.

    [2]Taniguchi H, Andreasson K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia [J]. J Vis Exp, 2008, (21). pii: 955. doi: 10.3791/955.

    [3]Choi EK, Park D, Kim TK, et al. Animal models of periventricular leukomalacia [J]. Lab Anim Res, 2011, 27(2): 77-84.

    [4]Li X, Zhang J , Zhu X, et al. Progesterone reduces inflammation and apoptosis in neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage through the PI3K/Akt pathway [J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(5):8197-8203.

    [5]陳惠金,范秀芳,高喜容,等. 6家醫(yī)院147例腦損傷早產(chǎn)兒的多中心隨訪報告 [J]. 中國當代兒科雜志, 2009, 11(3):166-172.

    [6]Craig A, Ling Luo N, Beardsley DJ, et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human [J]. Exp Neurol, 2003, 181(2):231-240.

    [7]Yang Y, Lewis R, Miller RH. Interactions between oligodendrocyte precursors control the onset of CNS myelination [J]. Dev Biol, 2011, 350(1): 127-138.

    [8]Kaur P, Jodhka PK, Underwood WA, et al. Progesterone increases brain-derived neuroptrophic factor expression and protects against glutamate toxicity in a mitogen-activated protein kinase- and phosphoinositide-3 kinase-dependent manner in cerebral cortical explants [J]. J Neurosci Res, 2007, 85(11):2441-2449.

    [9]Meffre D, Labombarda F, Delespierre B, et al. Distribution of membrane progesterone receptor alpha in the male mouse and rat brain and its regulation after traumatic brain injury [J]. Neuroscience, 2013, 231:111-124.

    [10]Kelleher MA, Palliser HK, Walker DW, et al. Sex-dependent effect of a low neurosteroid environment and intrauterine growth restriction on foetal guinea pig brain development [J]. J Endocrinol, 2011, 208(3):301-309.

    [11]Deutsch ER, Espinoza TR, Atif F, et al. Progesterone's role in neuroprotection, a review of the evidence [J]. Brain Res, 2013, 1530:82-105.

    [12]Robertson CL, Fidan E, Stanley RM, et al. Progesterone for neuroprotection in pediatric traumatic brain injury [J]. Pediatr Crit Care Med, 2015, 16(3):236-244.

    Effect of progesterone on the expression of O4 and O1 in the white matter of neonatal rat model with periventricular leukomalacia

    LEI Xianming, YANG Jie, CAO Yuntao
    (Department of Neonatology, Af fi lated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563000, Guizhou, China)

    ObjectiveTo explore the effect of progesterone on the expression of O4 and O1 in the white matter of neonatal rat model with periventricular leukomalacia (PVL).Methods2-day-old neonatal SD rats were randomly divided into model group, experimental group, and sham operation group. Rats' left common carotid artery was ligated and exposed to hypoxia (8%O2+92%N2) for 0.5 h in both the model group and experimental group to build the PVL animal model. The rats in experimental group was injected intraperitoneally with progesterone 10 mg/(kg·d) immediately after cerebral hypoxia ischemia. In sham operation group, rats' left common carotid artery was only isolated without ligation and hypoxia. 1, 4, 7, and 14 days after operation, the pathological changes of brain tissue were compared among three groups. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of O1 and O4 in the cerebral cortex of rats in three groups at different time points.ResultsThere were no abnormal pathological changes in the white matter in the sham operation group at each time point. The left ventricular enlargement and periventricular leukomalacia were found in both model and experimental groups, while the pathological damages of white matter in experimental group were signi fi cantly lighter than those in model group at each time point. The integral optical density (IOD) of O1 and O4 positive cells in the cerebral cortex of the three groups was gradually increased at day 1, day 4, and day 7 after operation and reached the peak level at day 7 , then was decreased at day 14 after operation. There was statistically signi fi cant difference (P<0.01). At day 1, day 4, day 7, and day 14, the integral optical density (IOD) of O1 and O4 positive cells in the cerebral cortex of sham operation group was highest, followed by experimental group and model group, and there was signi fi cant difference (P<0.01).ConclusionProgesterone can reduce the pathological damage in the cerebral cortex in neonatal rats with PVL, and promote the expression of O1 and O4 in the periventricular white matter, which can promote the differentiation and maturation of oligodendrocytes.

    progesterone; periventricular leukomalacia; oligodendrocyte marker O4; oligodendrocyte marker O1; neonatal rat

    10.3969/j.issn.1000-3606.2017.04.018

    2016-09-23)

    (本文編輯:蔡虹蔚)

    貴州省衛(wèi)計委資助課題(No.gzwjkj2014-1-072);遵義醫(yī)學院碩士點基金資助課題(No.2C2201603186)

    曹云濤 電子信箱:cyto827@aliyun.com

    假手術組各時點腦白質(zhì)區(qū)未見異常病理改變;模型組和實驗組均出現(xiàn)左側腦室擴大和腦室周圍白質(zhì)軟化灶等病理改變,但實驗組各時點腦白質(zhì)病理改變均明顯輕于模型組。三組大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O1、O4陽性細胞的積分光密度(IOD)在術后1、4、7天的表達逐漸增加,第7天達高峰,第14天下降,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。在術后1、4、7、14天,三組腦室旁白質(zhì)區(qū)O1、O4陽性細胞IOD在同一時間點均以假手術組最多,實驗組其次,模型組最少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論孕酮可減輕新生大鼠PVL模型動物腦室旁白質(zhì)區(qū)病理損傷,促進腦室周圍白質(zhì)O1、O4表達,促進少突膠質(zhì)細胞分化成熟。

    猜你喜歡
    白質(zhì)腦室孕酮
    裂隙腦室綜合征的診斷治療新進展
    經(jīng)前煩躁障礙癥發(fā)病與四氫孕酮敏感性中西醫(yī)研究進展
    顱腦超聲在診斷新生兒腦室周圍-腦室內(nèi)出血的臨床應用價值
    血脂與腦小腔隙灶及白質(zhì)疏松的相關性研究
    腦白質(zhì)改變發(fā)病機制的研究進展
    ADMA/DDAH系統(tǒng)與腦白質(zhì)疏松癥的關系
    腹腔血與靜脈血β-HCG與孕酮比值在診斷異位妊娠中的價值
    早期同期顱骨修補及腦室分流對顱骨缺損并腦積水的治療效果觀察
    腦室-腹腔分流術后常見并發(fā)癥的觀察及護理分析
    孕酮調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的容受性
    亚洲黑人精品在线| 听说在线观看完整版免费高清| 一个人观看的视频www高清免费观看| www日本在线高清视频| 亚洲在线自拍视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 99久久精品一区二区三区| 在线观看舔阴道视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产爱豆传媒在线观看| 国产不卡一卡二| 免费高清视频大片| 性色av乱码一区二区三区2| 免费观看的影片在线观看| 久久久久性生活片| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 精品无人区乱码1区二区| 色av中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲人成网站高清观看| 无限看片的www在线观看| 欧美日韩精品网址| 免费看a级黄色片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 深爱激情五月婷婷| 午夜福利视频1000在线观看| 女人被狂操c到高潮| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清| 国产精品综合久久久久久久免费| 嫩草影视91久久| www.色视频.com| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 俄罗斯特黄特色一大片| 久久性视频一级片| 成年女人毛片免费观看观看9| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美精品啪啪一区二区三区| 不卡一级毛片| av欧美777| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美成狂野欧美在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 免费av观看视频| 在线a可以看的网站| 日韩精品青青久久久久久| 黄色女人牲交| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 男人的好看免费观看在线视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 天天一区二区日本电影三级| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产私拍福利视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| tocl精华| 一本精品99久久精品77| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲成人久久性| 欧美bdsm另类| 日韩欧美免费精品| 久久久国产成人免费| 日韩欧美在线二视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产高清在线一区二区三| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 免费高清视频大片| 日韩欧美精品免费久久 | 精品久久久久久久久久免费视频| 级片在线观看| 无限看片的www在线观看| 成人欧美大片| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲久久久久久中文字幕| 色综合婷婷激情| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 免费观看精品视频网站| 成人国产综合亚洲| 91字幕亚洲| 久久精品国产清高在天天线| 岛国在线免费视频观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲人成网站在线播| 9191精品国产免费久久| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美午夜高清在线| 成人午夜高清在线视频| 欧美中文日本在线观看视频| 真人做人爱边吃奶动态| 国产午夜福利久久久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| av在线天堂中文字幕| 少妇人妻精品综合一区二区 | av视频在线观看入口| 熟女人妻精品中文字幕| xxx96com| 九九在线视频观看精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美zozozo另类| 在线看三级毛片| 日韩欧美在线乱码| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产成年人精品一区二区| 国产精品久久视频播放| 国产av一区在线观看免费| 精品福利观看| 成人三级黄色视频| 麻豆成人av在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲 国产 在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 中文亚洲av片在线观看爽| 好男人电影高清在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久久久久久久大av| 99国产综合亚洲精品| 黄色片一级片一级黄色片| 国产在线精品亚洲第一网站| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩欧美精品v在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精华一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久香蕉精品热| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成年女人毛片免费观看观看9| 真实男女啪啪啪动态图| www日本在线高清视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一区二区三区国产精品乱码| 激情在线观看视频在线高清| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲熟妇熟女久久| 免费观看的影片在线观看| svipshipincom国产片| 国产老妇女一区| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲欧美激情综合另类| 手机成人av网站| 男女床上黄色一级片免费看| 国产亚洲欧美98| 亚洲av二区三区四区| 亚洲av美国av| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品色激情综合| 99热6这里只有精品| 国产毛片a区久久久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲av免费在线观看| 午夜激情欧美在线| 国产黄片美女视频| 嫩草影院精品99| 亚洲人成伊人成综合网2020| 搡老熟女国产l中国老女人| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产真实伦视频高清在线观看 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 色在线成人网| 欧美日韩乱码在线| 精品日产1卡2卡| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线播放国产精品三级| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品久久视频播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美日韩综合久久久久久 | 黄片小视频在线播放| or卡值多少钱| 国产成人福利小说| 免费人成视频x8x8入口观看| 久9热在线精品视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 2021天堂中文幕一二区在线观| 中文字幕熟女人妻在线| 两人在一起打扑克的视频| 午夜日韩欧美国产| 国产黄片美女视频| 最好的美女福利视频网| 久久久久久大精品| 老司机午夜十八禁免费视频| a级一级毛片免费在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲无线观看免费| 亚洲av二区三区四区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本 欧美在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄色成人免费大全| 91av网一区二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 日韩精品中文字幕看吧| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲国产中文字幕在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 超碰av人人做人人爽久久 | 久久久久久久久中文| av国产免费在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲无线观看免费| 国产成人福利小说| xxx96com| eeuss影院久久| 在线观看日韩欧美| 黄色成人免费大全| 欧美成人性av电影在线观看| 色综合婷婷激情| 久久精品国产清高在天天线| 精品久久久久久成人av| 精品电影一区二区在线| 久久九九热精品免费| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产av不卡久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久午夜亚洲精品久久| 国产视频一区二区在线看| 免费观看人在逋| 久久久精品大字幕| 久久这里只有精品中国| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久精品91蜜桃| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产激情偷乱视频一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 特大巨黑吊av在线直播| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美乱妇无乱码| 免费看光身美女| 亚洲精品粉嫩美女一区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 最新中文字幕久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产 | 激情在线观看视频在线高清| 一个人免费在线观看电影| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精华霜和精华液先用哪个| 女警被强在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 禁无遮挡网站| 欧美最新免费一区二区三区 | 成人无遮挡网站| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲第一电影网av| 少妇丰满av| xxxwww97欧美| 中文字幕av成人在线电影| 天天躁日日操中文字幕| 色老头精品视频在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品一及| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美av亚洲av综合av国产av| av片东京热男人的天堂| 神马国产精品三级电影在线观看| 女警被强在线播放| 久久久久久人人人人人| 久久午夜亚洲精品久久| 国产99白浆流出| 18禁美女被吸乳视频| 老司机福利观看| av福利片在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 国产高清videossex| 精品电影一区二区在线| 天堂动漫精品| 亚洲成a人片在线一区二区| 波野结衣二区三区在线 | 中文字幕熟女人妻在线| 欧美极品一区二区三区四区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 黄片小视频在线播放| avwww免费| 久久九九热精品免费| 在线播放无遮挡| avwww免费| 国产麻豆成人av免费视频| 日本熟妇午夜| 他把我摸到了高潮在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 美女被艹到高潮喷水动态| 精品一区二区三区人妻视频| a级毛片a级免费在线| 色av中文字幕| 欧美三级亚洲精品| 90打野战视频偷拍视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 色哟哟哟哟哟哟| 色综合站精品国产| 99热这里只有精品一区| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲成av人片免费观看| 一本综合久久免费| 99国产综合亚洲精品| 中文字幕av在线有码专区| 一二三四社区在线视频社区8| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 97碰自拍视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 不卡一级毛片| 精品一区二区三区视频在线 | 国产日本99.免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美日本视频| 国产精品女同一区二区软件 | 日韩大尺度精品在线看网址| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲在线自拍视频| 长腿黑丝高跟| av专区在线播放| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 最近最新中文字幕大全电影3| 丰满的人妻完整版| 精品日产1卡2卡| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 亚洲精品亚洲一区二区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩人妻高清精品专区| x7x7x7水蜜桃| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国内精品久久久久久久电影| 免费看a级黄色片| 热99re8久久精品国产| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精华一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 国产麻豆成人av免费视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产中年淑女户外野战色| 国产三级中文精品| 99热6这里只有精品| 男人舔奶头视频| bbb黄色大片| 久久久久久九九精品二区国产| 在线观看日韩欧美| 神马国产精品三级电影在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美+日韩+精品| 免费看美女性在线毛片视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲av五月六月丁香网| 精品久久久久久久末码| 熟女电影av网| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲美女视频黄频| 99久国产av精品| 最好的美女福利视频网| aaaaa片日本免费| 久久精品人妻少妇| 国产69精品久久久久777片| 亚洲美女黄片视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产高清激情床上av| 午夜福利成人在线免费观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 色在线成人网| 欧美中文日本在线观看视频| 一区福利在线观看| 欧美大码av| 国产成年人精品一区二区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 床上黄色一级片| 成人精品一区二区免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 免费无遮挡裸体视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 黄色成人免费大全| 18禁美女被吸乳视频| 国产激情欧美一区二区| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美在线黄色| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲真实伦在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 91九色精品人成在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 日韩欧美在线二视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜精品久久久久久毛片777| 又紧又爽又黄一区二区| 搡老妇女老女人老熟妇| av专区在线播放| 在线免费观看的www视频| 成人亚洲精品av一区二区| av中文乱码字幕在线| 成人av在线播放网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 狠狠狠狠99中文字幕| 人人妻人人看人人澡| 色吧在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 黄色女人牲交| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一本综合久久免费| 岛国在线免费视频观看| 全区人妻精品视频| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品一区av在线观看| www国产在线视频色| 草草在线视频免费看| 日本一本二区三区精品| 综合色av麻豆| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产99白浆流出| 一进一出抽搐动态| 91久久精品电影网| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产真实伦视频高清在线观看 | 又爽又黄无遮挡网站| 日本 av在线| 99热这里只有是精品50| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成人永久免费在线观看视频| 男女视频在线观看网站免费| 精品一区二区三区人妻视频| 日本黄色片子视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲专区中文字幕在线| 婷婷丁香在线五月| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日韩欧美在线乱码| 免费搜索国产男女视频| 两个人的视频大全免费| 女人被狂操c到高潮| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产黄片美女视频| 在线观看日韩欧美| 国产一区在线观看成人免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲av电影在线进入| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲最大成人中文| 久久精品91无色码中文字幕| 日韩人妻高清精品专区| 很黄的视频免费| 国产野战对白在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 色在线成人网| tocl精华| 午夜免费激情av| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品三级大全| 高清在线国产一区| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产久久久一区二区三区| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲人成网站高清观看| 变态另类丝袜制服| 午夜日韩欧美国产| 制服丝袜大香蕉在线| 白带黄色成豆腐渣| 欧美日韩乱码在线| 757午夜福利合集在线观看| 欧美一区二区亚洲| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 少妇的逼水好多| 九九热线精品视视频播放| 怎么达到女性高潮| 嫩草影院精品99| 亚洲欧美日韩东京热| 天天躁日日操中文字幕| 一区二区三区激情视频| 久久久国产成人免费| 欧美又色又爽又黄视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品久久久久久久电影 | 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费在线观看亚洲国产| av中文乱码字幕在线| 成年女人毛片免费观看观看9| www日本黄色视频网| 欧美中文综合在线视频| 国产高清激情床上av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 欧美一级毛片孕妇| 精品国产三级普通话版| 观看免费一级毛片| 亚洲熟妇熟女久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 一个人免费在线观看的高清视频| 9191精品国产免费久久| 国产一区二区激情短视频| 人人妻人人看人人澡| 久久久精品欧美日韩精品| 可以在线观看毛片的网站| 久久久国产精品麻豆| 久久精品国产综合久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美+日韩+精品| 岛国在线免费视频观看| 一个人看的www免费观看视频| 久久精品91无色码中文字幕| 全区人妻精品视频| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲 国产 在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 狂野欧美激情性xxxx| 日本熟妇午夜| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久精品国产欧美久久久| 草草在线视频免费看| 麻豆国产97在线/欧美| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产真人三级小视频在线观看| 免费看日本二区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 好男人电影高清在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99国产极品粉嫩在线观看| 少妇的丰满在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲激情在线av| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区二区激情短视频| 少妇的逼水好多| 一个人免费在线观看电影| 老司机在亚洲福利影院| 一本久久中文字幕| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久性生活片| 亚洲精品成人久久久久久| av黄色大香蕉| 波多野结衣高清作品| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av第一区精品v没综合| 婷婷精品国产亚洲av| 成年人黄色毛片网站| 嫩草影视91久久| 国产精品久久久久久久久免 | 日韩人妻高清精品专区| 亚洲一区高清亚洲精品| 丰满的人妻完整版| 99久久精品一区二区三区| 我要搜黄色片| 又紧又爽又黄一区二区| 99精品久久久久人妻精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | h日本视频在线播放| 最近在线观看免费完整版| 亚洲真实伦在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲18禁久久av| 亚洲中文日韩欧美视频| 制服丝袜大香蕉在线| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品欧美国产一区二区三| av天堂在线播放| 成人亚洲精品av一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产精品久久久久久久电影 | 日韩精品青青久久久久久| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99久久精品热视频| av专区在线播放| 岛国在线免费视频观看| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲人成伊人成综合网2020| 男女下面进入的视频免费午夜| 天堂网av新在线| 香蕉丝袜av| 99视频精品全部免费 在线|