X-連鎖慢性肉芽腫病CYBB基因突變分析及產(chǎn)前診斷

李淑娟蔣利萍

1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨床免疫研究室（重慶 400014）；2.鄭州兒童醫(yī)院（河南鄭州 450000）

X-連鎖慢性肉芽腫病CYBB基因突變分析及產(chǎn)前診斷

李淑娟2蔣利萍1

1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨床免疫研究室（重慶 400014）；2.鄭州兒童醫(yī)院（河南鄭州 450000）

目的分析X連鎖慢性肉芽腫?。╔-CGD）的臨床特征及CYBB基因突變。方法回顧分析1例X-CGD患兒的臨床資料及其家系的CYBB基因檢測結(jié)果。結(jié)果男性患兒，新生兒期起病，以反復(fù)嚴(yán)重的肺部感染為主要表現(xiàn)。患兒無刺激組及脂多糖（LPS）刺激組四唑氮藍(lán)試驗(yàn)（NBT）均為0%，中性粒細(xì)胞氧化指數(shù)（NOI）為1.15。基因分析顯示，患兒CYBB基因第6外顯子出現(xiàn)缺失突變（579-582delATTA），由此引起編碼序列從189位異亮氨酸（I）發(fā)生移碼突變，于212位氨基酸提前出現(xiàn)終止密碼子（I189fsX212）。患兒母親及外祖母均為突變基因攜帶者。患兒母親下一胎羊水細(xì)胞的CYBB基因未發(fā)現(xiàn)相同缺失突變。結(jié)論基因診斷1例CYBB基因突變X-CGD患者及其家系，產(chǎn)前基因檢測可避免X-CGD患兒出生。

X連鎖慢性肉芽腫??； CYBB基因； 產(chǎn)前診斷

慢性肉芽腫（chronic granulomatous disease，CGD）是常見吞噬細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞）功能障礙的一種原發(fā)性免疫缺陷病，由于基因突變引起還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH，還原型輔酶Ⅱ）的某些成分缺失或減少，致使不能產(chǎn)生超氧根、單態(tài)氧和H2O2，其殺傷功能減弱，導(dǎo)致慢性化膿性感染，形成肉芽腫。X連鎖慢性肉芽腫?。╔-linked chronic granulomatous disease，X-CGD）為CYBB基因突變所致，約占總CGD的2/3[1]，少數(shù)為常染色體隱形遺傳（autosomal recessive chronic granulomatous disease，AR-CGD）。X-CGD病死率高，早期診斷、及時(shí)干預(yù)對(duì)避免此類患兒出生有重大意義?，F(xiàn)回顧分析1例X-CGD患兒的臨床特征、實(shí)驗(yàn)室資料，患兒和家系成員外周血白細(xì)胞及異?；驒z測結(jié)果，以及攜帶異?；虻幕純耗赣H下一胎羊水細(xì)胞CYBB基因檢測結(jié)果。

1 臨床資料

先證者，男性，7個(gè)月10 d，以發(fā)熱半月入院。入院前半月，患兒出現(xiàn)發(fā)熱，體溫38℃左右，伴咳嗽、流涕、噴嚏，黃色蛋花樣便3、4次/d，量中等，無黏液膿血，無寒戰(zhàn)、抽搐。予口服蒙脫石，腹瀉好轉(zhuǎn)，仍發(fā)熱，熱峰39.5℃，遂予萬古霉素治療（具體不詳），療效差，且咳嗽加重，陣咳伴嗆奶，以“敗血癥”收入重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院?；純合礕2P1，出生體質(zhì)量4.25 kg，足月順產(chǎn)，無窒息。患兒母親曾有一次人工流產(chǎn)史?；純荷蠡旌衔桂B(yǎng)，生長發(fā)育可。已接種卡介苗及乙肝疫苗。出生后16 天，因“新生兒肺炎，敗血癥，鼻尖疥腫，右側(cè)胸腔積液，室間隔缺損，房間隔缺損”住院治療。治療期間血培養(yǎng)示葡萄球菌、真菌、綠膿桿菌陽性，痰培養(yǎng)示真菌、綠膿桿菌陽性，纖維支氣管鏡檢查肺泡灌洗液發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯桿菌。無藥物過敏史，無手術(shù)外傷史?；純耗赣H有5位兄弟均于1歲內(nèi)以“發(fā)熱”為主要癥狀夭折（具體不詳），1妹體?。▓D1）。否認(rèn)有其他家族遺傳性疾病。入院體格檢查：體溫37.5℃，心率130次/min，呼吸58次/min，體質(zhì)量8 kg，神清，反應(yīng)可，面色稍蒼白；頸及腹股溝可捫及數(shù)枚0.8 cm×1.5 cm大小淋巴結(jié)，質(zhì)軟，可活動(dòng)；皮膚無皮疹及瘀斑，彈性可；無鼻翼煽動(dòng)，三凹征陰性；咽充血，雙肺呼吸音粗，可聞及少許中細(xì)濕啰音；心音有力，律齊，心前區(qū)未聞及雜音；腹軟，肝肋下3 cm，脾肋下2 cm，質(zhì)軟、緣銳；四肢暖。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)白細(xì)胞11.40×109/L，淋巴細(xì)胞0.38，紅細(xì)胞3.63×1012/L，血紅蛋白80 g/L，中性細(xì)胞0.60，血小板262×109/L，C反應(yīng)蛋白219 g/L；血沉52 mm/ h；血培養(yǎng)及痰培養(yǎng)均陰性，抗酸桿菌+新隱球菌陰性；IgG 8.65 g/L，IgA 0.53 g/L，IgM 1.56 g/L，C3 0.92 g/L，C4 0.24 g/L，IgE 60.0 IU/mL；CD3 68%，CD4 27%，CD8 38%，CD19 22%，CD16+56 8%，CD4:CD8 0.71；四唑氮藍(lán)試驗(yàn)（NBT）示無刺激組及脂多糖（LPS）刺激組均為0。胸片示雙肺病變，以右下肺為著，性質(zhì)待定；右側(cè)少許胸膜病變可能。胸部增強(qiáng)CT示雙肺感染性病變，縱隔多發(fā)淋巴結(jié)腫大，雙肺胸膜輕度增厚顯影。心臟彩色超聲示室間隔缺損（膜周流入道），房間隔缺損（2型），肺動(dòng)脈高壓（輕度）。

圖1 家系圖譜

因患兒有反復(fù)感染病史，NBT為0，為進(jìn)一步明確診斷，行中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)實(shí)驗(yàn)。取患兒及其家族成員、健康對(duì)照（志愿者）新鮮靜脈血100 μL（肝素鈉抗凝），標(biāo)記為對(duì)照管和刺激管，每管中加全血50 μL在管底。靜置對(duì)照管中加入5 μL二氫羅丹明（DHR123，20 μmol/L），刺激管中加入10 μL佛波酯（PMA，200 ng/mL）及5 μL DHR123，混勻，37℃水浴箱中孵育20 min。每管中加2 mL溶血?jiǎng)?，室溫避?0 min。2 500 r/min，離心半徑8cm，離心5 min，棄上清，加入2 mL PBS洗滌2次，相同方法離心，棄上清，加200 μL PBS用流式細(xì)胞儀測定各管中性粒細(xì)胞熒光強(qiáng)度，患兒中性粒細(xì)胞氧化指數(shù)（Neutrophil oxidative index，NOI，NOI=PMA刺激細(xì)胞熒光強(qiáng)度/靜止對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度）為1.15，母親20.4，正常對(duì)照 102，見圖2。

圖 2 中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)流式圖

經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，家長知情同意后進(jìn)行基因檢測。取患兒、患兒母親、姨媽及外祖母等家系成員外周抗凝血（肝素鈉抗凝）各2 mL，用基因組DNA提取試劑盒（天根公司）提取血細(xì)胞和羊水脫落細(xì)胞基因組DNA。根據(jù)人類基因組數(shù)據(jù)庫（HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC）獲得CYBB基因組序列（NC_000023.9）及mRNA序列（NM_000397），應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件primer5自行設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程有限公司合成。在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR，10×PCR buffer（Mg2+plus）2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μl，10 μg/L 正、反向引物各 0.3 μL，5 U/μL HS Taq DNA聚合酶 0.3 μL（大連寶生物有限公司TaKaRa產(chǎn)品），70～90 μg/L DNA 2 μL，加雙蒸水至 20 μL體積。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；后按94℃變性30 s，55～63℃退火30 s，72℃ 延伸50 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃終末延伸5 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。瓊脂糖電泳，在紫外透射儀下鑒定擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送至測序中心測序。將測序結(jié)果用Bioedit軟件與正常序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)發(fā)現(xiàn)突變的片段重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，雙向測序，以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。先證者CYBB基因第6外顯子出現(xiàn)缺失突變（579-582delATTA），引起編碼序列從189位異亮氨酸（I）發(fā)生移碼突變，于212位氨基酸提前出現(xiàn)終止密碼子（I189fsX212）；患兒母親外祖母均為突變基因攜帶者（圖3，攜帶者測序圖均為反向測序）。

患兒治療無效夭折。約2年后母親再次妊娠，經(jīng)知情同意后，孕20周時(shí)在超聲引導(dǎo)下完成羊膜腔穿刺，抽取羊水30 mL至無菌培養(yǎng)管，檢測胎兒（先證者弟弟）羊水細(xì)胞的CYBB基因，在其外顯子6未發(fā)現(xiàn)相同缺失突變。胎兒出生后5個(gè)月時(shí)行呼吸爆發(fā)試驗(yàn)，檢測NOI為200，示正常。

圖3 患兒及家系成員CYBB第6外顯子基因測序圖

2 討論

CGD是一種少見的原發(fā)性吞噬細(xì)胞功能缺陷病[2]。X-CGD由于CYBB基因突變導(dǎo)致NADPH氧化酶的β亞單位gp91phox缺陷，不能產(chǎn)生超氧化物，使吞噬細(xì)胞殺菌能力減弱或喪失，導(dǎo)致反復(fù)嚴(yán)重的細(xì)菌和/或真菌感染，以及過度炎癥反應(yīng)形成肉芽腫。美國發(fā)病率約為l/（20～25）萬[3]，我國發(fā)病率尚不清楚。

X-CGD為男性患病，女性攜帶者一般無臨床癥狀，偶見由于X染色體失活所致女性患病報(bào)道[4]。反復(fù)嚴(yán)重感染是本病的突出表現(xiàn)，肺部病變多見，易感染的病原體分別為曲霉菌、金黃色葡萄球菌及結(jié)核分枝桿菌等[5]。在原發(fā)性免疫缺陷疾病中，CGD患兒肺部最易合并曲霉菌感染，也是引起患兒死亡的主要原因，患兒可無明顯發(fā)熱、咳嗽等癥狀，病情惡化時(shí)出現(xiàn)高熱、咳嗽，甚至咯血，影像學(xué)特點(diǎn)是多發(fā)結(jié)節(jié)影及團(tuán)塊影，多為慢性感染，因而空洞及暈輪征較急性感染少見[6，7]。過度活躍的炎癥反應(yīng)形成的肉芽腫為其典型特征，可見于皮膚、胃腸道及泌尿道等，臨床上因“胃腸道肉芽腫”引起的頑固性嘔吐，易被誤診為“肥厚性幽門狹窄、食物過敏” 等腸道疾病[8]，泌尿系肉芽腫引起的血尿也需與急性腎炎、IgA腎病等腎臟疾病相鑒別。本例先證者在新生兒期起病，診斷年齡為7個(gè)月左右，首發(fā)癥狀發(fā)熱，咳嗽，無明顯特異性，感染部位以肺部為主，合并癥少，無真菌感染的典型肺部影像學(xué)表現(xiàn)及明確的病原學(xué)支持，白細(xì)胞升高不明顯，C反應(yīng)蛋白明顯升高；患兒有明顯家族史，即母輩中男孩無一存活，盡管免疫缺陷的患兒家族史陽性率不高，但對(duì)于反復(fù)嚴(yán)重感染的患兒，家族史陽性對(duì)于此類疾病的診斷具有提示性。

本例患兒的免疫球蛋白檢查及淋巴細(xì)胞分類未見明顯異常，臨床可通過此類檢查與嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病、X連鎖無丙種球蛋白血癥、高IgM綜合征及高IgE綜合征等其他原發(fā)性免疫缺陷病鑒別。

對(duì)于反復(fù)嚴(yán)重細(xì)菌和/或真菌感染并懷疑此病的患兒，中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)比NBT更快速準(zhǔn)確地診斷CGD并發(fā)現(xiàn)攜帶者[9，10]，也有檢測CYBB基因編碼的gp91phox蛋白確診本病的報(bào)道[11]。本例患兒NBT為0，NOI為1.15，其母親20.4，正常對(duì)照102，胎兒出生后5個(gè)月齡時(shí)的NOI為200，生后一般情況及生長發(fā)育均正常。

有報(bào)道71例CGD患兒（其中X-CGD53例），起病年齡在23.9個(gè)月，平均診斷年齡52.7個(gè)月，主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)肺部感染，其次為淋巴結(jié)炎、肉芽腫形成，其中30%的患兒存在播散性卡介苗（BCG）病[12]。本課題組此前的研究患兒中，起病年齡平均約在2個(gè)月，診斷年齡約2歲，50%的患兒有BCG或結(jié)核感染史[13]，由此可見CGD患兒易合并結(jié)核感染?？ń槊鐬閲矣?jì)劃免疫疫苗，出生即接種，接種卡介苗后發(fā)生結(jié)核感染，包括淋巴結(jié)、肺、胸膜、腸、腦膜等播散性感染，嚴(yán)重者可致死亡，被稱為卡介苗病。對(duì)于家族中有可疑免疫缺陷病的新生兒，應(yīng)加強(qiáng)遺傳學(xué)咨詢，避免接種卡介苗。隨著臨床醫(yī)師對(duì)本病認(rèn)識(shí)的提高，尤其是采用流式細(xì)胞術(shù)測中性粒細(xì)胞氧化功能后，X-CGD的診斷年齡有所提前，國內(nèi)曾有新生兒期起病并被確診為X-CGD的報(bào)道[14]。

我國X-CGD發(fā)病率尚不明確，如何早期診斷、及時(shí)干預(yù)，避免此類患兒出生，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育及提高人口質(zhì)量具有重要意義。本例患兒通過DNA-PCR直接測序法，發(fā)現(xiàn)CYBB基因第6外顯子存在缺失突變，使編碼序列從189位異亮氨酸（I）發(fā)生移碼突變，于212位氨基酸提前出現(xiàn)終止密碼子（I189fsX212），此突變?yōu)橐褕?bào)道突變類型，母親為突變基因攜帶者，在其下一胎兒胎齡約20周時(shí)，通過羊膜腔穿刺抽取羊水，分析羊水脫落細(xì)胞的CYBB基因，結(jié)果顯示正常男性胎兒，于生后5個(gè)月時(shí)行流式細(xì)胞術(shù)檢測其中性粒細(xì)胞氧化指數(shù)為200，提示正常，證實(shí)產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性。

綜上所述，明確先證者的基因突變類型為進(jìn)一步產(chǎn)前診斷打下基礎(chǔ)，而有出生缺陷的陽性家族史為產(chǎn)前診斷提供線索。對(duì)于先證者家族中的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，分析其胎兒羊水細(xì)胞相關(guān)致病基因cDNA，可有效避免CGD患兒出生；致病性基因突變及攜帶者不能確定而又高度懷疑時(shí)，可取高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的胎兒臍靜脈血行中性粒細(xì)胞DHR試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

目前X-CGD治療主要是預(yù)防性抗細(xì)菌及真菌感染，造血干細(xì)胞移植是治愈X-CGD的根本方法[15，16]。早期明確先證者的突變類型、對(duì)高危孕婦及時(shí)行產(chǎn)前診斷，對(duì)預(yù)防此類疾病的發(fā)生有重要意義。

[1]Ochs HD, Smith CIE, Puck JM. Primary Immunode fi ciency Diseases: A Molecular and Genetic Approach [M]. 2nd Edition. New York: Oxford University Press, 2007:525-545.

[2]Fischer A, Lisowska-Grospierre B, Anderson DC, et al. Leukocyte adhesion de fi ciency: molecular basis and functional consequences [J]. Immunode fi c Rev, 1988, 1(1): 39-54.

[3]Winkelstein JA, Marino MC, Johnston RB Jr, et al. Chronic granulomatous disease．Report on a national registry of 368 patients [J]. Medecine(Baltimore), 2000, 79(3): 155-169．

[4]Lewis EM, Singla M, Sergeant S, et al. X-linked chronic granulomatous disease secondary to skewed X chromosome inactivation in a female with a novel CYBB mutation and late presentation [J]. Clin Immunol, 2008, 129 (2): 372-380.

[5]Mahdaviani SA, Mohajerani SA, Rezaei N, et al. Pulmonary manifestations of chronic granulomatous disease [J]. Expert Rev Clin Immunol, 2013, 9(2): 153-160．

[6]趙成松，趙順英，劉鋼，等．非血液腫瘤和兒科重癥監(jiān)護(hù)病房內(nèi)兒童侵襲性真菌病的高危因素分析[J]．中華兒科雜志, 2013, 51(8): 598-601．

[7]Khanna G, Kao SC, Kirby P, et a1. Imaging of chronic granulomatous disease in children [J]. Radiographics, 2005, 25(5): 1183-1195．

[8]Perdereau S, Touzot F, Robin L, et a1. Recurrent pyloric stenosis in a 7-year-old child with chronic granulomatous disease [J]. Arch Pediatr, 2013, 20 (12): 1337-1339.

[9]Ochs HD, Igo RP. The NBT slide test: a simple screening method for detecting chronic granulomatous disease and female carriers [J]. J Pediatr, 1973, 83(1): 77-82.

[10]Alvarez-Larrán A, Toll T, Rives S, et al. Assessment of neutrophil activation in whole blood by fl ow cytometry [J]. Clin Lab Haematol, 2005, 27(1): 41-46.

[11]Sun J, Wang Y, Liu D, et a1. Prenatal diagnosis of x-linkedchronic granulomatousdisease by percutaneous umbilical blood sampling [J]. Scand J Immunol, 2012 , 76 (5): 512-518.

[12]de Oliveira-Junior EB, Zurro NB, Prando C, et a1. Clinical and genotypic spectrum of chronic granulomatous disease in 71 Latin American patients: first report from the LASID Registry [J]. Pediatr Blood Cancer, 2015, 62 (12): 2101-2107.

[13]李淑娟，蔣利萍，劉瑋，等．X連鎖慢性肉芽腫病12例臨床分析[J]. 臨床兒科雜志, 2011, 29(1): 42-50．

[14]楊子馨，王亞娟，王帆寧. 新生兒期慢性肉芽腫病6例臨床特點(diǎn)及CYBB基因分析[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志, 2014, 29(20):1556-1559．

[15]Lin CJ, Wang SC, Ku CL, et a1. Successful unrelated cord blood stem cell transplantation in an X-linked chronic granulomatous disease patient with disseminated BCG-induced infection [J]. Pediatr Neonatol, 2015, 56 (5): 346-350.

[16]Siler U, Paruzynski A, Holtgreve-Grez H, et a1. Successful combination of sequential gene therapy and rescue allo-HSCT in two children with X-CGD - importance of Timing [J]. Curr Gene Ther, 2015, 15 (4): 416-427.

（本文編輯：梁 華）

The analysis CYBB gene mutation and prenatal diagnosis in X-linked chronic granulomatous disease

LI Shujuan2, JIANG Liping1
（1.Clinical Immunology Laboratory, Children's Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China;2.Children's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450000, Henan, China）

ObjectiveTo analyze the clinical feature of X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD) and gene mutation of CYBB.MethodThe clinical data of X-CGD in one child and the results of CYBB gene detection in his family were reviewed.ResultsThis boy had onset in the neonatal period and presented with recurrent severe pulmonary infection as his main manifestation.Resultsof nitroblue tetrazolium test (NBT) in both non-stimulation group and LPS stimulation group in the child were 0, and neutrophil oxidation index (NOI) was 1.15. Gene analysis showed a deletion mutation in exon 6 of CYBB gene in the child (579-582delATTA), which resulted in frameshift mutation started from coding sequence of 189—isoleucine (I) and stop codon occured in advance in the 212th amino acid (I189fsX212). Both the child's mother and grandmother were carriers of the mutated gene. The same deletion mutation was not found in the CYBB gene in the amniocyte from the mother's next child.ConclusionOne case of X-CGD patient with CYBB gene mutation and his families were diagnosed by gene detection. Prenatal diagnosis can avoid the birth of children with X-CGD.

X-linked chronic granulomatous disease; CYBB gene; prenatal diagnosis

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.04.015

2016-09-05）