表皮生長因子受體基因表達(dá)對胃癌分期的影響及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制

彭 力 馬 琛 熊小明

(重慶市急救醫(yī)療中心病理科，重慶 400014)

表皮生長因子受體基因表達(dá)對胃癌分期的影響及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制

彭 力 馬 琛 熊小明1

(重慶市急救醫(yī)療中心病理科，重慶 400014)

目的 探討表皮生長因子受體(EGFR)基因表達(dá)對胃癌分期的影響及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測100例胃癌組織中EGFR基因的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株SGC-7901，實驗分為空白對照組、空載體組、EGFR-siRNA組，3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h后，CCK8檢測EGFR基因?qū)?xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測EGFR基因?qū)?xì)胞凋亡的影響；Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 100例胃癌組織中，EGFR表達(dá)陽性41例，對照組無陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；胃癌分化程度、浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移中EGFR的表達(dá)差異顯著(P<0.05)，TNM分期與EGFR的表達(dá)差異極顯著(P<0.01)；隨著時間的延長，3組細(xì)胞的增殖率均上升，EGFR-siRNA組增殖較緩慢，24 h的增殖率與空白對照組和空載體組比較顯著降低(P<0.05)，48 h和72 h的增殖率與空白對照組和空載體組比較顯著降低(P<0.01)；3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，EGFR-siRNA組細(xì)胞的凋亡率顯著低于空白對照組和空載體組(P<0.01)；空白對照組和空載體組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、酶切Caspase3 3個蛋白表達(dá)均無顯著差異(P>0.05)，EGFR-siRNA組細(xì)胞中Bax、酶切Caspase3蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組和空載體組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組和空載體組(P<0.01)。結(jié)論 EGFR基因的表達(dá)參與胃癌生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和分化過程，下調(diào)EGFR基因的表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，凋亡可能與Bcl-2、Bax、Caspase3的調(diào)控有關(guān)。

表皮生長因子；胃癌；增殖；凋亡

胃癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜〔1〕。表皮生長因子(EGF)是erbB家族成員之一。研究顯示，EGF受體(EGFR)在胃癌及多種上皮源性癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的惡性程度、浸潤、轉(zhuǎn)移等有關(guān)，許多下調(diào)和阻滯EGFR基因表達(dá)的途徑被用于抑制腫瘤的增殖〔2～4〕。本研究旨在探討EGFR基因表達(dá)對胃癌分期的影響及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2011年10至2015年10月重慶市急救醫(yī)療中心手術(shù)的100例胃癌患者的胃癌組織臘塊標(biāo)本，術(shù)前未行放化療及免疫治療。其中男65例，女35例，平均年齡(60.82±11.51)歲。病例類型均為腺癌，G1、G2、G3、G4期分化分別為18例、29例、20例、33例。根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期20例，Ⅱ期52例，Ⅲ期20例，Ⅳ期8例；T1、T2、T3、T4期浸潤程度分別為8例、12例、20例、60例；無淋巴轉(zhuǎn)移40例，有淋巴轉(zhuǎn)移60例。從100例胃癌組織臘塊標(biāo)本中隨機(jī)抽取40例，取癌旁組織作為對照組(距離胃癌組織5 cm以上)，其中男25例，女15例，平均(61.42±10.78)歲。

1.2 細(xì)胞及主要試劑和儀器 胃癌細(xì)胞株SGC-7901由西南科技大學(xué)提供。鼠抗人EGFR單克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體均購自丹麥DAKO公司；兔抗人Caspase3多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；膽囊收縮素(CCK)8細(xì)胞增殖試劑盒購自北京莊盟有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國西盟公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon，Annexin V-FITC凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購自美國Becton Dickinson公司；酶標(biāo)儀購于美國Bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化及結(jié)果判定 按照常規(guī)方法將切片脫蠟至水，用胃酶進(jìn)行酶消化抗原修復(fù)。過氧化氫(30 ml/L)孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，滴加工作濃度的山羊血清孵育20 min，37℃條件下，一抗二抗各孵育1 h，PBS各洗滌3次，3 min/次。DAB顯色，PBS洗滌，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。PBS作為陰性對照，相應(yīng)抗體的陽性切片作為陽性對照。以O(shè)lympus數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行采集、分析。隨機(jī)選擇5個視野，200倍觀察，計數(shù)每個視野中腫瘤上皮細(xì)胞的染色情況，取其均值。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)所占的比例評分。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出裝有胃癌細(xì)胞株SGC-7901的凍存管，立即放凍存管于37℃的水浴鍋中溶解，1 min內(nèi)輕搖溶解。細(xì)胞溶解后加入含有10%胎牛血清(FBS)、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清，培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)觀察到細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時，胰酶消化細(xì)胞，消化完全后用完全培養(yǎng)基終止消化，離心懸浮細(xì)胞，懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中，800～1 000 r/min離心5 min，倒掉培養(yǎng)基，換3組，成完全培養(yǎng)基，傳代。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實驗分為空白對照組：細(xì)胞中加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)基；空載體組：細(xì)胞中加入Lipofectamine 2000稀釋液及無血清的RPMI1640培養(yǎng)基；EGFR-siRNA組：細(xì)胞中加入Lipofectamine 2000稀釋液和EGFR-siRNA。取生長至對數(shù)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/孔，接種于24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。將各組細(xì)胞與培養(yǎng)基充分混合后加入到胃癌細(xì)胞SGC-7901中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，更換成含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 CCK8實驗檢測細(xì)胞增殖 取各組生長至對數(shù)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，胰酶消化后離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有5×103個細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，接種于96孔板中，37℃，5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，酶標(biāo)儀在波長為490 nm處測定并記錄OD值，計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率(%)=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin V/PI雙染法。 取各組胃癌細(xì)胞SGC-7901轉(zhuǎn)染48 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含細(xì)胞為3×105個，取出1 ml細(xì)胞懸浮液，1 000 r/min，4℃離心8 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞3次，向細(xì)胞中加入 200 μl緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μl PI和 Annexin-V，室溫避光靜置20 min，加300 μl緩沖液，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6 Western印跡檢測蛋白的表達(dá) 取各組生長至對數(shù)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，PBS洗滌細(xì)胞3次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，加入適量的裂解液冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r/min，離心10 min，取上清。按照試劑盒說明提取蛋白和測定蛋白濃度。充分混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，100℃煮沸變性5 min，每孔中加50 μl樣品。電泳分離后，4℃轉(zhuǎn)膜過夜。取膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗二抗孵育。TBST洗膜3次，顯影，通過Odyssey掃描系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá) EGFR表達(dá)陽性41例，對照組無陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 EGFR表達(dá)與胃癌臨床病理特征參數(shù)之間的關(guān)系 不同胃癌分化程度、浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移患者EGFR的表達(dá)差異顯著(P<0.05)，TNM分期與EGFR的表達(dá)差異極顯著(P<0.01)。見表1。

2.3 EGFR對細(xì)胞增殖的影響 隨著時間的延長，3組細(xì)胞的增殖率均上升，EGFR-siRNA組增殖較緩慢，24、48、72 h的增殖率與空白對照組和空載體組組比較顯著降低(P<0.05)(P<0.01)。見圖1。

表1 EGFR表達(dá)與胃癌臨床病理特征參數(shù)之間的關(guān)系〔n(%)〕

2.4 EGFR對細(xì)胞凋亡的影響 空白對照組、空載體組和EGFR-siRNA組細(xì)胞的凋亡率分別為(3.47±0.19)%、(3.56±0.21)%、(15.83±0.34)%，EGFR-siRNA組細(xì)胞的凋亡率顯著低于空白對照組和空載體組(P<0.01)。

2.5 Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 空白對照組和空載體組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、酶切Caspase3 3個蛋白表達(dá)均無顯著差異(P>0.05)，EGFR-siRNA組細(xì)胞中Bax、酶切Caspase3蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組和空載體組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組和空載體組(P<0.01)。見表2，圖2。

與空白對照組比較：1)P<0.05；與空載體組比較:2)P<0.01 圖1 EGFR對細(xì)胞增殖的影響

組別Bcl?2Bax酶切Caspase3空白對照組0471±00131)0113±00081)0143±00081)空載體組0482±00121)0124±00071)0159±00091)EGFR?siRNA組0154±00090386±01120492±0011

與EGFR-siRNA組比較：1)P<0.01

圖2 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

EGFR是酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族，具有酪氨酸激酶的活性，通過與EGF或轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)α配體結(jié)合激活酪氨酸蛋白激酶途徑，促進(jìn)DNA的合成、癌基因的表達(dá)以及細(xì)胞的生長〔5〕。研究顯示，高表達(dá)的EGFR能夠促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖，并使腫瘤細(xì)胞的凋亡受到抑制〔6〕。已發(fā)現(xiàn)人類的肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等有 EGFR的高表達(dá)，EGFR的高表達(dá)使腫瘤有較強(qiáng)浸潤遷移能力，預(yù)后的效果不佳〔7〕。研究指出，結(jié)腸癌中EGFR的陽性表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，與組織分化程度無關(guān)，提示EGFR表達(dá)的上調(diào)與腫瘤的進(jìn)展存在密切的關(guān)系〔8〕。本研究說明EGFR基因參與了胃癌的侵襲、遷移、增殖等過程。

正常情況下，機(jī)體細(xì)胞的增殖和凋亡維持一種動態(tài)的平衡，當(dāng)機(jī)體內(nèi)突變的細(xì)胞異常增多時，就會引起腫瘤的發(fā)生〔9〕。對于腫瘤的治療，引起腫瘤細(xì)胞的凋亡是治療疾病的一種方法，因此，許多研究者提出用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方法抗腫瘤，如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑得到研究者廣泛的關(guān)注〔10〕。RNA干擾(RNAi)是一種能引起內(nèi)源性靶基因沉默的機(jī)制，具有較高的特異性。RNAi作為一種沉默基因表達(dá)和抑制基因功能的機(jī)制，對研究基因的功能發(fā)揮重要作用〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR在胃癌中呈陽性表達(dá)，因此，通過RNAi沉默EGFR表達(dá)后檢測對胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響，結(jié)果表明沉默EGFR表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，Bax和Bcl-2可以通過形成同源二聚體或異源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，反之則抑制細(xì)胞的凋亡〔12〕。Bcl-2/Bax形成的二聚體能夠作用于線粒體外膜，影響線粒體膜Caspase的釋放，Caspase能夠激活凋亡信號通路，使細(xì)胞發(fā)生皺縮，發(fā)生DNA片段凋亡

等現(xiàn)象，Caspase3處于Caspase級聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者〔13〕。本研究結(jié)果說明EGFR引起胃癌細(xì)胞株SGC-7901的凋亡可能與Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白調(diào)控有關(guān)。

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〔2016-07-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

瀘州醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金青年基金項目(No.2013ZRQN031)

馬 琛(1972-)，女，主管技師，主要從事病理技術(shù)研究。

彭 力(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤病理診斷研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2134-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.022

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科