二次雙溶劑冷凍結(jié)晶法分離純化橡膠籽油中α—亞麻酸的研究

雍梁敏+劉石生

摘 要：以橡膠籽油為原材料，皂化得混合脂肪酸，經(jīng)冷凍結(jié)晶得脂肪酸Ⅰ，最佳條件是通過低溫結(jié)晶法從純雙橡膠溶劑中分離α-亞麻酸的響應(yīng)面方法建立的。基于單因素實(shí)驗(yàn)，乙腈和丙酮/脂肪酸Ⅰ（v/m），乙腈/丙酮（v/ v），冷凍時(shí)間三因素，運(yùn)用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了三因素之間相互作用。借助響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果表明：以乙腈和丙酮為混合溶劑，乙腈與丙酮/脂肪酸Ⅰ（v/m）為18：1，乙腈/丙酮（v/v）為1.5：1，冷凍時(shí)間為9h，固液分離方式為-18℃、7000r/min冷凍離心3min，橡膠籽油中α-亞麻酸含量最高達(dá)45.41%。與傳統(tǒng)方法相比，此法提純效率高，脂肪酸不易氧化，為α-亞麻酸的純化提供了一種新的方法。

關(guān)鍵詞：橡膠籽油；二次雙溶劑冷凍結(jié)晶法；α-亞麻酸；純化

α-亞麻酸（18：3n-3）屬ω-3系列多烯脂肪酸，是構(gòu)成人體組織細(xì)胞的主要成分，機(jī)體不能合成、代謝，經(jīng)轉(zhuǎn)化可得人體必需的活性物質(zhì)DHA和EPA[1]。α-亞麻酸不僅具有降低血脂、血壓、血糖，抑制癌癥發(fā)生與轉(zhuǎn)移，抑制過敏反應(yīng)，抑制衰老，抗炎，提高記憶力，還可用于治療和預(yù)防心腦血管病癡呆癥等疾病[2]。因此，開發(fā)利用天然的α-亞麻酸具有廣泛的醫(yī)療應(yīng)用前景。雖然改變?nèi)軇鋬鼋Y(jié)晶效果較明顯，但很少有人研究冷凍結(jié)晶次數(shù)對產(chǎn)物純度的影響，本文通過增加冷凍結(jié)晶次數(shù)分離橡膠籽油中α-亞麻酸，了解了α-亞麻酸（ALA）、亞油酸（LA）和油酸（OA）在冷凍結(jié)晶過程中變化，考察了乙腈/丙酮、乙腈與丙酮/脂肪酸Ⅰ、冷凍時(shí)間對二次分離效果的影響，通過響應(yīng)面分析得到最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橡膠籽油：采用有機(jī)溶劑提取法從橡膠籽中提?。恢舅幄瘢夯旌现舅峤?jīng)冷凍結(jié)晶預(yù)處理所得產(chǎn)物；脂肪酸Ⅱ：雙溶劑冷凍結(jié)晶法所得產(chǎn)物；脂肪酸Ⅲ：二次雙溶劑冷凍結(jié)晶法所得產(chǎn)物；丙酮、乙腈等試劑均為國產(chǎn)分析純。

電子天平：EL303（0.001g），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52系列，上海亞榮生化儀器廠；pH計(jì)：PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī)：設(shè)備型號為UNIVERSAL 32R，德國Hettich；超低溫冰箱：Thermo Electron Corporation；Agilent 7890A GC：美國Agilent公司。

1.2 混合脂肪酸的制備

采用皂化法制備混合脂肪酸（FFA）。

1.3 脂肪酸Ⅰ的制備

采用冷凍結(jié)晶法制備脂肪酸Ⅰ。

1.4 脂肪酸Ⅱ的制備

采用雙溶劑冷凍結(jié)晶法制備脂肪酸Ⅱ。

2 實(shí)驗(yàn)分析與結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

選取乙腈與丙酮溶劑/脂肪酸Ⅰ（v/m）、乙腈/丙酮（v/v）、冷凍時(shí)間三個因素對α-亞麻酸提純率的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定最佳提取條件。

亞油酸和油酸含量隨著溶劑量的增加而降低，α-亞麻酸含量隨著溶劑量的增加而增加。當(dāng)乙腈和丙酮溶劑/脂肪酸Ⅰ（v/m）為20：1時(shí)，達(dá)到最大，亞油酸含量和油酸含量最小。當(dāng)乙腈和丙酮溶劑的量不斷增加時(shí)，由于乙腈在-75℃會凝固，晶體逐漸升高，母液容易包裹在晶體孔結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)致母液和晶體難以完全分離，α-亞麻酸含量也隨之下降。因此，乙腈與丙酮溶劑/脂肪酸I（v/m）的最佳比例為20：1。設(shè)定乙腈/丙酮（v/v）為1.5：1，冷凍時(shí)間為10h，考察不同乙腈與丙酮溶劑/脂肪酸Ⅰ（v/m）對分離效果的影響，亞油酸和油酸含量逐漸降低，α-亞麻酸含量隨溶劑用量的增加而增加。當(dāng)乙腈和丙酮溶劑/脂肪酸Ⅰ（v/m）為20：1時(shí)，亞油酸純度達(dá)到最大，亞油酸含量和油酸含量降至最低。當(dāng)乙腈和丙酮溶劑的量增加時(shí)，由于乙腈在-75℃會凝固，晶體逐漸升高，母液容易包裹在晶體孔結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)致母液和晶體難以完全分離，α-亞麻酸含量則有所下降。

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立

利用Design-Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到相應(yīng)的模型為：

Y=45.20-1.55X1-1.17X2-0.086X3-1.67X1X2- 1.05X1X3+2.43X2X3-1.68X12-5.75X22-3.61X32

Y為α-亞麻酸的含量，%；

X1為乙腈與丙酮/脂肪酸Ⅰ；

X2為乙腈/丙酮；

X3為冷凍時(shí)間，h。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

α-亞麻酸的最佳分離條件如下：乙腈和丙酮/脂肪酸Ⅰ分別為17.68：1（v/m），乙腈/丙酮為1.49（v/v），冷凍時(shí)間為9.05h，α-亞麻酸含量為45.57%。丙酮和丙酮/脂肪酸Ⅰ分離α-亞麻酸與橡膠籽油的最佳條件為18：1（v/m），乙腈/丙酮為1.5：1（v/v），冷凍時(shí)間為9小時(shí)

在此工藝條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得到α-亞麻酸含量平均值為45.41%，與理論值相差0.16%.因此，本模型可以較好地反映二次冷凍結(jié)晶分離橡膠籽油的最佳工藝條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 經(jīng)不同分離純化技術(shù)分離純化前后橡膠籽油中脂肪酸相對含量變化

分析不同脂肪酸產(chǎn)品中脂肪酸相對含量，比較不同分離純化工藝分離橡膠籽油中α-亞麻酸的效果。實(shí)驗(yàn)可知，混合脂肪酸油經(jīng)冷凍結(jié)晶，飽和脂肪酸基本去除，脂肪酸Ⅰ中總不飽和脂肪酸含量達(dá)98.67 %，達(dá)到了預(yù)濃縮的目的。經(jīng)不同分離方法處理所得的脂肪酸產(chǎn)品，分離純化效果各不相同。從α-亞麻酸含量的角度分析，采用二次雙溶劑冷凍結(jié)晶法效果最好，雙溶劑冷凍結(jié)晶法次之，冷凍結(jié)晶法的分析效果最差。由此可知，冷凍結(jié)晶的原材料、溶劑的種類與數(shù)量和結(jié)晶次數(shù)對冷凍結(jié)晶分離α-亞麻酸效果影響較大。

3.2 經(jīng)過處理的橡膠籽油中α-亞麻酸樣品的得率

橡膠籽油經(jīng)雙溶劑冷凍結(jié)晶法、二次雙溶劑冷凍結(jié)晶法提純后，雖然產(chǎn)物中α-亞麻酸純度都在31.52%～45.41%，但α-亞麻酸樣品得率較低，只有10%～20%左右，說明橡膠籽油中α-亞麻酸在分離純化過程中損失較多。為了提高α-亞麻酸樣品得率，生產(chǎn)過程中建議對冷凍分離殘?jiān)M(jìn)行二次分離純化。由于采用雙溶劑冷凍結(jié)晶法所得產(chǎn)品得率低，而經(jīng)冷凍結(jié)晶法處理脂肪酸Ⅰ得率達(dá)68.49%[18]。所以本文采用經(jīng)冷凍結(jié)晶法提純的原材料作為二次雙溶劑冷凍結(jié)晶的原材料。

4 結(jié)論

采用二次雙溶劑冷凍結(jié)晶法分離純化橡膠籽油中α-亞麻酸，通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝條件為：以乙腈和丙酮為混合溶劑，乙腈與丙酮/脂肪酸Ⅰ（v/m）為18：1，乙腈/丙酮（v/v）為1.5：1，冷凍時(shí)間為9h，固液分離方式為-18℃、7000r/min冷凍離心3min。在該條件下，橡膠籽油中α-亞麻酸含量達(dá)45.41%。

對不同冷凍結(jié)晶分離純化橡膠籽油中α-亞麻酸的分離效果進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：所得脂肪酸產(chǎn)品中α-亞麻酸含量次序?yàn)橹舅幄?gt;脂肪酸Ⅱ>脂肪酸Ⅰ，說明二次冷凍結(jié)晶分離橡膠籽油中效果最好。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（20866003）；海南大學(xué)中西部高等教育振興計(jì)劃資助。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊靜，常蕊.α-亞麻酸的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)工程，2011，1（1）：72-75.

[2] 李冀新，張超，羅小玲.α-亞麻酸研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2006，（2）：10-12.

作者簡介

雍梁敏（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镉椭?/p>

通訊作者：劉石生（1977-），男，教授，博士研究生，研究方向：熱帶農(nóng)產(chǎn)品研究