• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PC12 細(xì)胞在缺氧條件下的自噬現(xiàn)象*

    2017-05-20 02:26:15胡中慧馬慧萍樊鵬程李加恒王俊麗賈正平
    關(guān)鍵詞:明顯增加培養(yǎng)箱存活率

    胡中慧, 馬慧萍, 樊鵬程, 李加恒, 王俊麗, 蒙 萍, 賈正平△

    (1. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科, 2. 蘭州軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所, 甘肅 蘭州 730050)

    PC12 細(xì)胞在缺氧條件下的自噬現(xiàn)象*

    胡中慧1,2, 馬慧萍1, 樊鵬程1, 李加恒2, 王俊麗2, 蒙 萍1, 賈正平1△

    (1. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科, 2. 蘭州軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所, 甘肅 蘭州 730050)

    目的:考察PC12細(xì)胞內(nèi)自噬發(fā)生與缺氧時(shí)間的關(guān)系,探討自噬對缺氧細(xì)胞的影響作用。方法:以PC12細(xì)胞為模型,將對數(shù)生長期的細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板,37℃、 5% CO2培養(yǎng)24 h后,放入0.5% O2、94.5% N2和5% CO2的培養(yǎng)箱缺氧1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h 和48 h,用MTT法檢測細(xì)胞存活率,透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體,Westen blot法檢測自噬相關(guān)蛋白(LC3B、 Atg5和Beclin1)的表達(dá),用試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)活性、活性氧自由基(ROS)和線粒體膜電位(MNP)水平,探究缺氧不同時(shí)間自噬對PC12細(xì)胞的作用。結(jié)果:在缺氧3~12 h, PC12細(xì)胞自噬明顯增加,自噬相關(guān)蛋白(LC3B、 Atg5和Beclin1)表達(dá)增加,尤其是缺氧9 h, PC12細(xì)胞存活明顯增加,表明短時(shí)間缺氧自噬對細(xì)胞起保護(hù)作用,而隨著缺氧時(shí)間的延長細(xì)胞存活明顯降低,自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平減少,細(xì)胞LHD和ROS水平明顯增加。MMP水平顯著下降,細(xì)胞凋亡明顯增加。結(jié)論:在缺氧早期自噬對PC12細(xì)胞起保護(hù)作用,但缺氧時(shí)間較長,超過了細(xì)胞自身調(diào)節(jié)能力導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

    自噬;PC12細(xì)胞;缺氧;自噬相關(guān)基因

    autophagy; PC12 cells; Hypoxia; autophagy-related genes(Atg)

    【DOI】 10.12047/j.cjap.5319.2017.016

    氧氣對所有真核細(xì)胞的正常發(fā)育、新陳代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。如果機(jī)體遭受氧供給不足或用氧障礙,各組織、器官和細(xì)胞均可出現(xiàn)缺氧應(yīng)激,發(fā)生許多病理生理變化及相應(yīng)的臨床癥狀[1]。為了適應(yīng)生存,機(jī)體在組織和細(xì)胞水平發(fā)生重大調(diào)整以適應(yīng)低氧環(huán)境。機(jī)體適應(yīng)缺氧的機(jī)制很多,近年來的研究進(jìn)展表明,在缺氧條件下,自噬已經(jīng)成為重要調(diào)節(jié)機(jī)制[2,3]。自噬(autophagy) 是通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)包裹胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、RNA)和一些細(xì)胞內(nèi)源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細(xì)胞器),并轉(zhuǎn)送至溶酶體中降解,釋放氨基酸、核苷酸和脂肪酸等大分子物質(zhì),實(shí)現(xiàn)再循環(huán),為細(xì)胞修復(fù)和重建提供原料,以滿足細(xì)胞代謝和細(xì)胞器更新需要[4]。自噬對細(xì)胞在應(yīng)激情況下( 如饑餓、缺氧) 的存活、程序性細(xì)胞死亡以及細(xì)胞內(nèi)病原體的清除有重要作用。研究表明[5],細(xì)胞自噬過多或過少等異?,F(xiàn)象會嚴(yán)重影響細(xì)胞和生物個(gè)體的生長、發(fā)育和衰老過程,可引發(fā)腫瘤、自身免疫性疾病、心血管病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種人類重大疾病。自噬是進(jìn)化過程中保守行為之一,酵母、哺乳動(dòng)物都可以找到參與自噬的同源基因,現(xiàn)己統(tǒng)一命名為自噬相關(guān)基因 (autophagy-related gene,Atg)[6]。其中Atg5、Atg8(LC3)和Atg6(Beclin1)等自噬蛋白的定位、修飾及相互作用決定著自噬體的形成、加工、成熟與溶酶體的融合以及再生等動(dòng)態(tài)過程[7]。

    大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化細(xì)胞株(pheochromocytoma,PC12)是公認(rèn)的對氧敏感的細(xì)胞,已被廣泛用于研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病及細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境氧含量的變化的信號傳導(dǎo)機(jī)制的一個(gè)模型系統(tǒng)[8]。本研究通過實(shí)驗(yàn)觀察在缺氧條件下,PC12細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的自噬現(xiàn)象,探討自噬對缺氧細(xì)胞的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清(均為蘭州民海生物有限公司);青霉素(哈藥制藥集團(tuán),批號:A120805410);硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司,批號:1205103);鼠神經(jīng)生長因子(武漢海特生物制藥股份有限公司,批號20121265);甲基噻唑藍(lán)四氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、25%戊二醛和ECL超敏發(fā)光液(均為Sigma公司);LDH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);活性氧ROS檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所); RIPA裂解緩沖液(07B13A05)和BCA蛋白檢測試劑盒(AR0116)(均為BOSTER);Anti-LC3B兔多克隆抗體(ab48394)和 Anti-Beclin 1 (ab137355)(均為abcam);Anti-Atg5(Cell Singnaling Technology);辣根標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體和辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(均為中杉金橋)。

    1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧處理

    PC12細(xì)胞株(購于上海中科院細(xì)胞庫)加入含10%馬血清和5%的胎牛血清及50 ng/ml鼠神經(jīng)生長因子的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),DMEM高糖培養(yǎng)基中加入100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素,2.6 mg/ml碳酸氫鈉。PC12細(xì)胞培養(yǎng)于面積60 mm的聚苯乙烯培養(yǎng)皿中,置37℃、95% 空氣和5% CO2常氧培養(yǎng)箱中孵育,待細(xì)胞覆蓋80% 左右傳代,按每2天1∶3傳代,待傳代3~4次后,用于實(shí)驗(yàn)。

    PC12細(xì)胞缺氧處理:PC12細(xì)胞置37℃、95% 空氣和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,至細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿80%左右,放入95% N2和5% CO2缺氧培養(yǎng)箱,根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體要求來設(shè)定缺氧時(shí)間,缺氧的環(huán)境條件除了氧氣濃度設(shè)置為0.5%之外,其他的外部條件都與常氧培養(yǎng)環(huán)境條件保持一致

    1.2 細(xì)胞存活分析法

    通過MTT 法檢測在缺氧條件下對PC12細(xì)胞存活率的影響。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,加入96孔板,37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,置缺氧箱中分別缺氧1、3、6、9、12、24、36和48 h。在缺氧時(shí)間到達(dá)后,每孔中加入MTT溶液,繼續(xù)置常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,棄去上清液,每個(gè)孔中加入DMSO,振搖15 min,經(jīng)多功能酶標(biāo)儀于490 nm測量OD值,光密度用來表示細(xì)胞的存活率,另設(shè)以正常氧培養(yǎng)為對照組(正常生長的細(xì)胞+培養(yǎng)基)。

    1.3 透射電鏡觀察自噬

    PC12細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理后,PBS洗滌、離心、收集細(xì)胞,采用戊二醛固定細(xì)胞,4℃過夜;用PBS漂洗;然后用 1%鋨酸固定液4℃固定,再用PBS漂洗;細(xì)胞脫水,把脫水后的細(xì)胞包埋在樹脂中,固化細(xì)胞;固定好的蠟塊經(jīng)超模切片機(jī)切片,用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,透射電子顯微鏡觀察、照相。

    1.4 LDH測定

    PC12細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理后,吸取上清液50 μl,其他按照LDH檢測試劑盒說明書操作步驟加相應(yīng)反應(yīng)液,混勻,室溫放置3 min,用紫外分光光度計(jì)于440 nm測定各吸收值。每個(gè)缺氧時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次取平均值。

    1.5 ROS測定

    PC12細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理后,棄去上清液,加用不含血清的培養(yǎng)基(DMEM)稀釋DCFH-DA的工作液1 ml,37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min,棄去上清,洗滌兩次,PBS吹打均勻,用多功能酶標(biāo)儀測量各吸收值。ROS供氫體為陽性對照。

    1.6 細(xì)胞膜電位(MMP)測定

    取常氧和缺氧處理后的PC12,按照J(rèn)C-1檢測試劑盒說明書操作步驟加相應(yīng)JC-1染色工作液,37℃孵育20 min后,洗滌兩次,加入150 μl PBS,用多功能酶標(biāo)儀測量各紅綠熒光的吸收值,計(jì)算紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。CCCP(10 μmol/L)作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。重復(fù)測量3次,取平均值。

    1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)

    PC12細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理后,用無菌預(yù)冷的PBS溶液

    清洗,向其加入RIPA裂解液,冰上裂解,收集裂解液,離心,收集上清液,用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣品所對應(yīng)的蛋白濃度。取30 μg蛋白在12%SDS-PAGE上進(jìn)行電泳,再轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用脫脂奶粉的TBST溶液封閉后,于一抗中孵育, 4℃過夜,再把PVDF膜放入二抗溶液中,在室溫下孵育后, TBST清洗,使用ECL對PVDF膜進(jìn)行顯色發(fā)光處理,利用Tanon-4200SF全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng),對其進(jìn)行曝光處理。測定灰度值時(shí),使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析。每個(gè)缺氧時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 缺氧對PC12細(xì)胞的影響

    用MTT法測得常氧下和缺氧下PC12細(xì)胞的存活率,在缺氧6 h時(shí)細(xì)胞存活率為0.73±0.09,而常氧下為0.68±0.08;在缺氧9 h時(shí)細(xì)胞存活率為0.77±0.06,而常氧下為0.75±0.10;在缺氧12 h時(shí)細(xì)胞存活率為0.70±0.09,而常氧下為0.78±0.08,細(xì)胞存活率明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。缺氧48 h后細(xì)胞存活率僅為0.49±0.06,細(xì)胞存活率顯著降低 (P<0.01),結(jié)果表明細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間延長存活率明顯下降(表1)。

    GroupOD值NormoxiaHypoxia1h0.60±0.080.61±0.083h0.61±0.110.63±0.146h0.68±0.080.73±0.099h0.75±0.100.77±0.0612h0.78±0.080.70±0.09*24h0.73±0.090.61±0.09**36h0.76±0.090.54±0.05**48h0.78±0.100.49±0.06**

    *P<0.05,**P<0.01vsthe normoxic group

    2.2 缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬現(xiàn)象

    透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時(shí)間延長,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬泡,有些自噬泡中包裹著線粒體。在缺氧3~12 h自噬明顯增加,而缺氧48 h,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡,出現(xiàn)空泡樣或凋亡樣細(xì)胞死亡(圖1)。

    2.3 缺氧條件下PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

    自噬相關(guān)蛋白LC3[9]、Atg5[10]和Beclin1[5,6]參與自噬泡伸展、擴(kuò)張和形成,并在各種刺激誘導(dǎo)自噬起至關(guān)重要作用。通過Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LC3B和Atg5水平在缺氧1~24 h明顯增加(P<0.01),36 h后開始下降。Beclin 1在缺氧1~6 h逐漸增加,在缺氧12~24 h明顯增加(P<0.05),36 h后開始下降;而缺氧48 h顯著下降(P<0.01),結(jié)果表明細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間延長LC3、Atg5和Beclin1出現(xiàn)先增加再下降的趨勢(圖2,表2)。

    Fig. 1 Representative electron microphototographs of autophagy in hypoxia (×8 000) A: Cells in normoxia. cellular, nuclear, endoplasmic reticulum and mitochondria morphology were normal, no autophagosomes; B~I(xiàn): Cells in hypoxia for 1, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48 h, respectively

    Fig. 2 Representative Western blot images of the LC3, Atg5, Beclin 1 and β-actin protein levels in PC 12 cells for various hypoxic duration

    GroupIATargetprotein:IAβ-actinLC3-II/LC3-IAtg5Beclin100.77±0.170.04±0.011.62±0.131h1.10±0.20**0.23±0.02**1.78±0.153h1.59±0.14**0.94±0.08**1.66±0.156h3.09±0.31**0.95±0.07**1.90±0.149h3.46±0.37**1.26±0.09**1.86±0.1412h3.10±0.26**1.25±0.15**2.16±0.27*24h2.17±0.17**1.16±0.09**2.00±0.17*36h1.18±0.11*1.01±0.07**1.75±0.1248h1.02±0.050.03±0.010.32±0.03**

    *P<0.05,**P<0.01vs0 h group

    2.4 不同缺氧時(shí)間下LDH、ROS和MMP指標(biāo)的考察結(jié)果

    結(jié)果表明常氧下PC12細(xì)胞LDH為480.02±16.02 U/L,缺氧1~12 h,LDH降低,在缺氧9 h降至385.01±9.98 U/L,而缺氧36 h后LDH升高至523.58±10.20 U/L,與常氧組相比,顯著增加(P<0.05);而ROS水平在缺氧1~9 h升高緩慢,而缺氧12 h后 ROS水平顯著增加(P<0.01),在缺氧條件下,MMP下降(P<0.01),隨著缺氧時(shí)間延長,MMP呈時(shí)間依賴性關(guān)系(表3)。

    GroupLDH(U/L)ROSMMP0h480.02±16.0211.19±1.225.98±0.661h454.83±8.0822.03±1.34**4.77±0.46**3h446.65±18.0122.65±1.57**4.55±0.57**6h404.99±10.89**19.35±0.91**4.24±0.61**9h385.01±9.98**19.76±1.61**2.78±0.49**12h390.09±15.15**67.37±7.43**2.18±0.44**24h476.96±8.1457.80±5.29**1.50±0.39**36h523.58±10.20*34.34±2.32**1.14±0.19**48h510.57±7.66*41.38±6.27**1.19±0.11**

    *P<0.05,**P<0.01vsthe 0 h group

    3 討論

    缺氧廣泛存在于多種病理生理環(huán)境中,嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常功能。機(jī)體適應(yīng)缺氧的機(jī)制研究很多,越來越多文獻(xiàn)報(bào)道,自噬對缺氧細(xì)胞起保護(hù)作用。缺氧誘導(dǎo)的自噬不僅減少呼吸鏈中氧氣不足產(chǎn)生的自由電子,同時(shí)也會使細(xì)胞通過分解代謝產(chǎn)生ATP利于細(xì)胞在低氧環(huán)境下生存[11]。Zhang[12]等人研究表明,缺氧似乎是一個(gè)早期促生存的過程,可能作為對細(xì)胞預(yù)測極端應(yīng)激的報(bào)警信號。也有文獻(xiàn)報(bào)道耗竭自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin1和LC3其中之一,會增加低氧下細(xì)胞死亡[13]。本研究結(jié)果顯示在不同缺氧時(shí)間自噬對PC12細(xì)胞的存活率有明顯影響,在缺氧早期細(xì)胞內(nèi)自噬泡增多,自噬相關(guān)蛋白LC3B、 Atg5和Beclin 1表達(dá)增加,自噬現(xiàn)象明顯,細(xì)胞存活率也明顯增加。盡管自噬分子機(jī)制和生物功上有了新進(jìn)展,但在缺氧條件下自噬的作用主要是促進(jìn)細(xì)胞存活還是死亡仍有爭議。有文獻(xiàn)報(bào)道自噬是一種不同于凋亡或壞死的細(xì)胞死亡形式[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明長時(shí)間缺氧,LC3B、 Atg5和Beclin 1表達(dá)減少,自噬現(xiàn)象減弱,推測長時(shí)間缺氧對細(xì)胞的損傷超過細(xì)胞自我修復(fù)能力時(shí),會出現(xiàn)大量空泡樣死亡細(xì)胞。

    近年來研究進(jìn)展表明,缺氧誘導(dǎo)的自噬可通過清除受損的線粒體,調(diào)控線粒體更新和循環(huán)利用,減少ROS產(chǎn)生,維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)態(tài),保護(hù)細(xì)胞在低氧環(huán)境下生存[14,15]。LDH是機(jī)體能量代謝中的一種重要酶,細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH大小可反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度。MMP是維持正常線粒體的膜結(jié)構(gòu)和功能不可缺少條件,耗損 MMP會產(chǎn)生線粒體碎片。線粒體是ROS生成的主要場所,也最易受ROS危害,受損線粒體會生成更多的ROS,從而出現(xiàn)氧化損傷的惡性循環(huán)。因此,及時(shí)有效清除受損線粒體對減輕細(xì)胞氧化損傷至關(guān)重要。通過透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在缺氧早期,PC12細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的自噬泡,其內(nèi)清晰可見包裹著線粒體,同時(shí)ROS水平升高緩慢,LDH增加趨勢和MMP下降趨勢相對減弱,而缺氧12 h后 ROS和LDH水平顯著增加,推測自噬在缺氧一定時(shí)間范圍內(nèi)可清除受損線粒體,減少ROS的產(chǎn)生,緩解線粒體膜電位的下降來維持線粒體的功能,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,保護(hù)PC12細(xì)胞在低氧環(huán)境下存活,但缺氧時(shí)間長對自噬作用反而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中只是觀察了缺氧條件下,對PC12細(xì)胞自噬發(fā)生的表象,但如何調(diào)控自噬在防治缺氧策略中更有利還需進(jìn)一步研究。

    [1] Semenza GL. Oxygen sensing, homeostasis, and disease [J].NEnglJMed, 2011, 365 (6): 537-547.

    [2] Liu J, Hao H, Huang H,etal. Hypoxia regulates the therapeutic potential of mesenchymal stem cells through enhanced autophagy [J].IntJLowExtremWounds, 2015, 14(1): 63-72.

    [3] Giordano S, Darley-Usmar V, Zhang J. Autophagy as an essential cellular antioxidant pathway in neurodegenerative disease[J].RedoxBiol, 2013, 2: 82-90.

    [4] Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: renovation of cells and tissues[J].Cell, 2011, 147(4): 728-741.

    [5] Klionsky DJ, Codogno P. The mechanism and physiological function of macroautophagy [J].JInnateImmun, 2013, 5 (5): 427-433.

    [6] Xie Y, Kang R, Sun X,etal. Posttranslational modification of autophagy-related proteins in macroautophagy[J].Autophagy, 2015, 11(1): 28-45.

    [7] Mizushima N, Yoshimori T, Ohsumi Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation [J].AnnuRevCellDevBiol, 2011, 27: 107-132.

    [8] Charlier N, Leclere N, Felderhoff U,etal. Hypoxia-induced cell death and changes in hypoxia-inducible factor-1 activity in PC12 cells upon exposure to nerve growth factor[J].BrainResMolBrainRes, 2002, 104(1): 21-30.

    [9] Hanna RA, Quinsay MN, Orogo AM,etal. Microtubule-associated protein1 light chain 3(LC3) interacts with Bnip3 protein to selectively remove endoplasmic reticulum and mitochondria via autophagy[J].JBiolChem, 2012, 287(23): 19094-19104.

    [10]Nishida Y, Arakawa S, Fujitani K,etal. Discovery of Atg5/Atg7- independent alternative macroautophagy [J].Nature, 2009, 461(7264): 654-658.

    [11]Martínez-Borra J, López-Larrea C. Autophagy and self-defense [J].AdvExpMedBiol, 2012, 738: 169-184.

    [12]Zhang H, Bosch-Marce M, Shimoda LA,etal. Mitochondrial autophagy is an HIF-1- dependent adaptive metabolic response to hypoxia[J].JBiolChem, 2008, 283(16): 10892-10903.

    [13]Lizama-Manibusan B, McLaughlin B. Redox modification of proteins as essential mediators of CNS autophagy and mitophagy [J].FEBSLett, 2013, 587(15): 2291-2298.

    [14]Pei F, Lin H, Liu H,etal. Dual role of autophagy in lipopolysaccharide-induced preodontoblastic cells [J].JDentRes, 2015, 94(1): 175-82.

    [15]Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1: Regulator of mitochondrial metabolism and mediator of ischemic preconditioning [J].BiochimBiophysActa, 2011, 1813(7): 1263-1268.

    [16]Wu H, Huang S, Zhang D. Autophagic responses to hypoxia and anticancer therapy in head and neck cancer [J].PatholResPract, 2015, 211(2): 101-108.

    2015-06-08

    2016-05-10

    Q255

    A

    1000-6834(2017)01-065-04

    △【通訊作者】Tel: 13893616926; E-mail: mahuipingcxr @ aliyun.com

    猜你喜歡
    明顯增加培養(yǎng)箱存活率
    嬰兒培養(yǎng)箱的質(zhì)控辦法及設(shè)計(jì)改良探討
    園林綠化施工中如何提高植樹存活率
    損耗率高達(dá)30%,保命就是保收益!這條70萬噸的魚要如何破存活率困局?
    微生物培養(yǎng)箱的選購與管理
    食品工程(2020年3期)2020-01-05 14:38:16
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預(yù)計(jì)年產(chǎn)3.5萬斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    黃河在咆哮
    基于模糊PID參數(shù)自整定的細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度控制算法
    法國針對華人暴力搶劫增加
    人民周刊(2016年17期)2016-11-05 21:29:41
    神回復(fù)
    家庭百事通(2016年9期)2016-09-08 18:03:13
    Alice臺風(fēng)對東海鮐魚魚卵仔魚的輸運(yùn)和存活率的影響
    丝袜在线中文字幕| 亚洲成人久久爱视频| a级毛片a级免费在线| 久久午夜亚洲精品久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产主播在线观看一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美成人午夜精品| 老司机在亚洲福利影院| 国产伦一二天堂av在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 中文资源天堂在线| 亚洲无线在线观看| 久久狼人影院| 免费看a级黄色片| 男女午夜视频在线观看| 国产精品国产高清国产av| 韩国av一区二区三区四区| 日韩欧美国产在线观看| 老司机福利观看| 成人午夜高清在线视频 | 一本精品99久久精品77| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲五月色婷婷综合| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产区一区二久久| 长腿黑丝高跟| 自线自在国产av| 国产激情欧美一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 极品教师在线免费播放| 草草在线视频免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲人成77777在线视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 中出人妻视频一区二区| 欧美性猛交黑人性爽| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男女那种视频在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 久久中文字幕人妻熟女| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| www日本黄色视频网| 妹子高潮喷水视频| 热re99久久国产66热| 日韩有码中文字幕| 中国美女看黄片| 无人区码免费观看不卡| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精品乱码一区二三区的特点| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产三级在线视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久性视频一级片| 老司机午夜福利在线观看视频| 中文在线观看免费www的网站 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费在线观看日本一区| 国产伦一二天堂av在线观看| www日本在线高清视频| 动漫黄色视频在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 制服诱惑二区| av福利片在线| 色播在线永久视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 亚洲黑人精品在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| www.精华液| svipshipincom国产片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久婷婷成人综合色麻豆| 在线视频色国产色| 视频区欧美日本亚洲| 操出白浆在线播放| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产99白浆流出| av中文乱码字幕在线| 黄色视频,在线免费观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 午夜福利18| 国产精品二区激情视频| 国产97色在线日韩免费| 色播在线永久视频| 身体一侧抽搐| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品av久久久久免费| 国产视频内射| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 久久久久久久精品吃奶| x7x7x7水蜜桃| 脱女人内裤的视频| 国产成人系列免费观看| 嫩草影院精品99| 色精品久久人妻99蜜桃| 国内精品久久久久精免费| 老司机在亚洲福利影院| 国产不卡一卡二| 99久久无色码亚洲精品果冻| 老司机午夜十八禁免费视频| 一级毛片高清免费大全| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 免费人成视频x8x8入口观看| 男人操女人黄网站| 成人一区二区视频在线观看| 国产一区二区三区视频了| 久久亚洲精品不卡| 精华霜和精华液先用哪个| 999久久久国产精品视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲人成77777在线视频| 女性生殖器流出的白浆| 久久久水蜜桃国产精品网| www.999成人在线观看| 深夜精品福利| 亚洲av美国av| 国产精品二区激情视频| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品,欧美在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 午夜福利视频1000在线观看| www.熟女人妻精品国产| 亚洲色图av天堂| 午夜福利在线在线| 久久精品国产清高在天天线| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲五月天丁香| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美性猛交黑人性爽| tocl精华| 亚洲人成网站高清观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产一区二区激情短视频| 久久久久九九精品影院| 男女那种视频在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲精品粉嫩美女一区| 女警被强在线播放| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久精品国产清高在天天线| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕av电影在线播放| 黄色 视频免费看| 久久天堂一区二区三区四区| 中国美女看黄片| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 久久久久久大精品| 人人妻人人澡人人看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产三级在线视频| 精品免费久久久久久久清纯| 国产v大片淫在线免费观看| 中文字幕高清在线视频| 啦啦啦免费观看视频1| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲欧美激情综合另类| 国产熟女xx| 亚洲精品在线美女| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99久久国产精品久久久| 国产熟女xx| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品色激情综合| 欧美激情高清一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| av电影中文网址| 亚洲色图av天堂| 亚洲最大成人中文| 满18在线观看网站| 一本一本综合久久| 国产亚洲欧美98| 欧美黄色淫秽网站| 三级毛片av免费| 久久久国产成人精品二区| 精品久久久久久久久久久久久 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 91麻豆av在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产成+人综合+亚洲专区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 免费电影在线观看免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲av美国av| 后天国语完整版免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 美国免费a级毛片| 国产精品国产高清国产av| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久久九九精品影院| 欧美中文综合在线视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产一区二区在线av高清观看| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲美女黄片视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日本三级黄在线观看| www日本在线高清视频| 精华霜和精华液先用哪个| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 黄网站色视频无遮挡免费观看| www.999成人在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 成人亚洲精品av一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费av毛片视频| 亚洲七黄色美女视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品影院久久| 69av精品久久久久久| √禁漫天堂资源中文www| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品免费视频内射| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 90打野战视频偷拍视频| 99久久精品国产亚洲精品| www.熟女人妻精品国产| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影 | 黑人操中国人逼视频| 亚洲精品在线观看二区| 男女视频在线观看网站免费 | 免费观看人在逋| 成熟少妇高潮喷水视频| 手机成人av网站| 中文字幕久久专区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| e午夜精品久久久久久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 色av中文字幕| 亚洲精品一区av在线观看| 在线观看一区二区三区| 在线观看日韩欧美| 国产精品免费视频内射| 日韩视频一区二区在线观看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲第一av免费看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美日韩精品网址| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 老司机福利观看| 国产成人欧美| 免费看十八禁软件| 亚洲最大成人中文| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日韩有码中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 免费搜索国产男女视频| 一本大道久久a久久精品| www.999成人在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产日本99.免费观看| 国产视频一区二区在线看| 国产精品av久久久久免费| 欧美久久黑人一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产一区二区三区视频了| 成人午夜高清在线视频 | 日日干狠狠操夜夜爽| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品一区二区三区四区久久 | 精品不卡国产一区二区三区| av天堂在线播放| 日韩欧美国产在线观看| 91老司机精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久精品人妻少妇| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一区福利在线观看| av视频在线观看入口| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产三级在线视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 精品电影一区二区在线| 成年人黄色毛片网站| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲在线自拍视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 啦啦啦 在线观看视频| 精品久久久久久成人av| 午夜福利欧美成人| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 麻豆成人av在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 一本大道久久a久久精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产高清videossex| 国产精品久久久av美女十八| 女人被狂操c到高潮| 亚洲 国产 在线| 成年人黄色毛片网站| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩av在线大香蕉| 在线十欧美十亚洲十日本专区| videosex国产| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲第一青青草原| 国产精品久久电影中文字幕| 一区二区日韩欧美中文字幕| 色av中文字幕| 国产不卡一卡二| 亚洲成国产人片在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产爱豆传媒在线观看 | 久久人妻av系列| 一a级毛片在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 国产av在哪里看| 国产国语露脸激情在线看| 老汉色∧v一级毛片| 日韩大码丰满熟妇| 在线观看66精品国产| 亚洲七黄色美女视频| 欧美日本视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 午夜福利免费观看在线| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 成人欧美大片| 国产午夜精品久久久久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 宅男免费午夜| 黄片播放在线免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久 成人 亚洲| 在线天堂中文资源库| 脱女人内裤的视频| 国产三级黄色录像| 一级毛片精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久 成人 亚洲| 亚洲中文av在线| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品粉嫩美女一区| 看片在线看免费视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 91老司机精品| 国产三级黄色录像| 亚洲国产欧美网| 色综合站精品国产| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久久久久午夜电影| 一级毛片精品| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美乱码精品一区二区三区| 露出奶头的视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲最大成人中文| 人成视频在线观看免费观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲黑人精品在线| 亚洲专区国产一区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲成人久久性| 久久午夜亚洲精品久久| 91字幕亚洲| 可以在线观看的亚洲视频| ponron亚洲| 欧美日韩福利视频一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 可以在线观看的亚洲视频| 大型黄色视频在线免费观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲美女黄片视频| 国产激情久久老熟女| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 国产av在哪里看| 久久久国产成人精品二区| 啦啦啦免费观看视频1| 人妻久久中文字幕网| 国产又色又爽无遮挡免费看| 伦理电影免费视频| 一二三四社区在线视频社区8| 看免费av毛片| 黑丝袜美女国产一区| 香蕉久久夜色| 欧美在线一区亚洲| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 中国美女看黄片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 夜夜爽天天搞| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲第一av免费看| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线天堂中文资源库| 丁香六月欧美| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲五月天丁香| 动漫黄色视频在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲精品色激情综合| 一级毛片精品| 国产伦人伦偷精品视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 男人操女人黄网站| 国产av在哪里看| 精品日产1卡2卡| 午夜免费观看网址| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一二三四在线观看免费中文在| 一本一本综合久久| 最好的美女福利视频网| 亚洲国产中文字幕在线视频| 在线免费观看的www视频| 看片在线看免费视频| 91av网站免费观看| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲av美国av| 在线观看舔阴道视频| 人成视频在线观看免费观看| 色哟哟哟哟哟哟| 热99re8久久精品国产| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜久久久久精精品| 日韩欧美三级三区| netflix在线观看网站| 国产高清有码在线观看视频 | 久久久久久人人人人人| 亚洲成国产人片在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文字幕av电影在线播放| 一夜夜www| 国产视频一区二区在线看| 女警被强在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 精品第一国产精品| 午夜福利免费观看在线| svipshipincom国产片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 男人舔奶头视频| www.精华液| 亚洲激情在线av| 黄色毛片三级朝国网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲人成电影免费在线| 美女午夜性视频免费| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久热爱精品视频在线9| 国产熟女午夜一区二区三区| 在线视频色国产色| 91老司机精品| 丝袜美腿诱惑在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲自拍偷在线| 日本在线视频免费播放| 色综合站精品国产| 午夜激情av网站| 欧美色视频一区免费| 午夜福利18| 高清在线国产一区| 久久久久久久午夜电影| 国语自产精品视频在线第100页| 麻豆国产av国片精品| 美女大奶头视频| 人人澡人人妻人| 日韩欧美免费精品| 熟女电影av网| 老司机午夜十八禁免费视频| 午夜免费观看网址| 国产熟女xx| 日韩大码丰满熟妇| 国产av在哪里看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 听说在线观看完整版免费高清| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 老汉色∧v一级毛片| 国产v大片淫在线免费观看| 18禁国产床啪视频网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产成人影院久久av| 波多野结衣高清无吗| 在线播放国产精品三级| 国产精品精品国产色婷婷| 国产亚洲av高清不卡| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一夜夜www| 亚洲成人久久性| 欧美另类亚洲清纯唯美| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲专区国产一区二区| 国产视频内射| 亚洲精品色激情综合| 99国产精品一区二区三区| 制服诱惑二区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 黄色毛片三级朝国网站| 麻豆av在线久日| 欧美+亚洲+日韩+国产| 伦理电影免费视频| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 精品欧美国产一区二区三| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久青草综合色| 啪啪无遮挡十八禁网站| 嫩草影视91久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| av在线天堂中文字幕| 午夜两性在线视频| 国产v大片淫在线免费观看| 在线天堂中文资源库| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久这里只有精品19| 亚洲,欧美精品.| 欧美性长视频在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩欧美一区视频在线观看| 中文资源天堂在线| 亚洲五月婷婷丁香| 午夜福利欧美成人| 波多野结衣巨乳人妻| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品一区av在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美zozozo另类| 国产精品影院久久| 日本一本二区三区精品| 国产成人精品无人区| 亚洲精品在线观看二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲国产精品成人综合色| 老熟妇仑乱视频hdxx| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲全国av大片| 精品第一国产精品| 满18在线观看网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲av熟女| 99国产极品粉嫩在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲黑人精品在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 九色国产91popny在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜免费成人在线视频| 国产精品一区二区免费欧美|