低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的體外實(shí)驗(yàn)*

吳 濤， 段曉劍， 田 宇， 陳海旭， 徐志宏， 劉 靜，王衛(wèi)華， 朱玲玲， 王剛石△

(1. 解放軍總醫(yī)院南樓消化科， 2. 解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所， 衰老及相關(guān)疾病研究北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100853；3. 江蘇華益科技有限公司， 江蘇 蘇州 215500； 4. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京100850)

低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的體外實(shí)驗(yàn)*

吳 濤1， 段曉劍1， 田 宇1， 陳海旭2， 徐志宏3， 劉 靜2，王衛(wèi)華1， 朱玲玲4△， 王剛石1△

(1. 解放軍總醫(yī)院南樓消化科， 2. 解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所， 衰老及相關(guān)疾病研究北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100853；3. 江蘇華益科技有限公司， 江蘇 蘇州 215500； 4. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京100850)

目的：研究低氘環(huán)境對(duì)人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)增殖的影響并初步探討其相關(guān)機(jī)制。方法：用含不同氘濃度的蒸餾水(實(shí)驗(yàn)組：25 ppm；對(duì)照組：150 ppm)配制的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC-7901。分別在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩組細(xì)胞的增殖率、細(xì)胞周期及凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，用Western blot法對(duì)兩組細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原蛋白(PCNA)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：低氘環(huán)境下SGC-7901細(xì)胞的增殖率比對(duì)照組低10%左右。低氘環(huán)境對(duì)細(xì)胞的劃痕愈合能力及集落形成能力也有顯著抑制作用(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低氘組的細(xì)胞G1期細(xì)胞的比例增加(P<0.01)，而其所處S期細(xì)胞的比例下降(P<0.05)，兩組細(xì)胞間早凋及晚凋比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot 的結(jié)果顯示低氘環(huán)境下培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞的PCNA的表達(dá)明顯下降。結(jié)論：低氘環(huán)境能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這可能與低氘環(huán)境下胃癌細(xì)胞阻滯于G1期及下調(diào)其PCNA的表達(dá)有關(guān)。

低氘環(huán)境；胃癌；增殖；PCNA；細(xì)胞周期；凋亡

【DOI】 10.12047/j.cjap.5448.2017.001

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2008年相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤的第3位和第4位[1,2]。目前，除了常規(guī)的治療手段外，人們?cè)诓粩嗵剿髦委熚赴┑男路椒ā?/p>

是自然界存在的氫的穩(wěn)定同位素，地表水中氘/氫(D/H)大約為1∶6 600，自然水中氘的含量約為0.0150%(150 ppm)，通常把水中氘含量低于150 ppm的水稱(chēng)為低氘水(deuterium-depleted water, DDW)[3,4]。有關(guān)研究表明，氘在小鼠的組織及血漿中的含量分布不均勻(血漿多于組織)[5]。飲水中氘元素的含量對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要影響，氘元素能夠維持正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，而低氘環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)及核酸的合成、細(xì)胞分裂有抑制作用[6,7]。隨著對(duì)氘研究的逐步深入，高濃度氘對(duì)生物的反向作用也逐漸被報(bào)道。人們發(fā)現(xiàn)降低自然水中氘含量的65%，具有抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[8]。隨后，相關(guān)臨床試驗(yàn)也證明，在常規(guī)使用抗癌藥物的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用低氘水能夠有效的延長(zhǎng)肺癌、乳腺癌、前列腺癌患者的生存期[9-11]。然而，低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響卻鮮有報(bào)道，為此本研究初步探討低氘環(huán)境對(duì)人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

通過(guò)精餾的方法從自來(lái)水中制備低氘水[11]。將氘含量調(diào)整為25 ppm(實(shí)驗(yàn)組)及150 ppm(對(duì)照組)，但調(diào)整水中18O的濃度保持一致(0.198%)。SGC-7901細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)消化科實(shí)驗(yàn)室提供，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，鼠抗人PCNA單克隆抗體購(gòu)自Abacm公司。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞以1×103cells/100 μl的濃度接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞分別加入50 ppm、100 ppm和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培養(yǎng)基并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出96孔板，每孔中加入10 μl CCK-8反應(yīng)液，37℃下避光孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組的OD值。根據(jù)以上預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組濃度氘環(huán)境培養(yǎng)的細(xì)胞在48 h時(shí)的OD450值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(50 ppm, 0.439±0.013; 100 ppm, 0.433±0.016; 150 ppm, 0.435±0.013;n=5)。因此本實(shí)驗(yàn)將25 ppm及150 ppm濃度分別作為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組所用氘濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。分別將細(xì)胞在25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組的OD值。

1.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞以5×105cells/ml的濃度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到95%～100%融合。用10 μl槍頭以垂直于6孔板底部方向直線劃痕。隨后將細(xì)胞用PBS洗3次以去除劃下的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別加入25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培養(yǎng)基并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組胃癌細(xì)胞的遷移能力，分別在培養(yǎng)的0 h、24 h、48 h拍照，用同一標(biāo)尺測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞劃痕的寬度，設(shè)0 h時(shí)劃痕寬度為1，以此計(jì)算出24 h、48 h時(shí)劃痕的相對(duì)寬度。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞以500 cells/well分別接種于6孔板中，每組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別加入25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培養(yǎng)基并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，直至肉眼可見(jiàn)的集落形成時(shí)終止培養(yǎng)。每孔加入2 ml 4%多聚甲醛固定液并于4℃條件下固定20 min。棄掉固定液，加入結(jié)晶紫染液染色30 min，去離子水洗掉浮色，置于空氣中干燥。顯微鏡下拍照并對(duì)每孔中的集落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞分別用25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集兩組細(xì)胞并將其濃度調(diào)整為2×106cells/ml。用70% 的乙醇在4℃條件下固定細(xì)胞2 h。細(xì)胞以1 000 r/min 離心5 min，用PBS清洗2次。棄掉上清液并加入1 ml RNAse溶液，將其置于37℃下反應(yīng)30 min。溶液冷卻至室溫后，每組離心管中加入0.1 ml PI染液，避光保存并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞分別用25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，在冰上收集各組的培養(yǎng)上清及細(xì)胞，用低溫離心機(jī)在4℃條件下2 000 r/min 離心3 min，用4℃ PBS清洗細(xì)胞1次。結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞并將其濃度調(diào)整為(1～5)×106cells/ml。取100 μl細(xì)胞懸液并加入5 μl Annexin V熒光染料，室溫孵育10～15 min。用結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞并用200 μl 的結(jié)合緩沖液重懸。加入5 μl PI染色液，4℃避光保存并上機(jī)檢測(cè)。

1.7 PCNA蛋白檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞以3×105cells/ml的密度接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞分別用25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，在4℃條件下，12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法蛋白定量。以每孔100 μg蛋白上樣，濃縮膠60 V，40 min，分離膠100 V，90 min，直至藍(lán)色條帶到凝膠底端。蛋白電泳分離后，設(shè)定100 V，轉(zhuǎn)膜2 h。室溫下用10%脫脂奶粉(TTBS)封閉2 h，洗膜2次，每次5 min。加入PCNA一抗(1∶500)，β-actin一抗(1∶1 000)，4℃過(guò)夜。TTBS洗膜3次，每次10 min。加入適當(dāng)稀釋濃度二抗(1∶1 000)室溫下孵育2 h。棄掉未結(jié)合的二抗，TTBS洗膜3次，每次10 min。最后于暗室中顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)低氘環(huán)境對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖的影響，與150 ppm組相比，25 ppm濃度氘環(huán)境培養(yǎng)的細(xì)胞在48 h的OD450值顯著降低，將胃癌細(xì)胞置于25 ppm及150 ppm氘濃度環(huán)境下培養(yǎng)24 h, 48 h, 72 h 及 96 h，25 ppm濃度氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表1)。

2.2 低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移能力的影響

25 ppm組細(xì)胞劃痕寬度在24 h、48 h時(shí)分別為0.790±0.017、0.569±0.047,與150 ppm組相比(0.607±0.022、0.419±0.034)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)

GroupOD45024h48h72h96h150ppm0.309±0.0090.312±0.0070.552±0.0080.915±0.05025ppm0.270±0.016**0.282±0.010**0.525±0.008**0.824±0.039*

*P<0.05，**P<0.01vs150 ppm group

2.3 低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞的集落形成能力的影響

集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)長(zhǎng)期低氘環(huán)境刺激對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組集落數(shù)分別為234±19、327±13，25 ppm低氘環(huán)境下細(xì)胞集落數(shù)較對(duì)照組明顯減少(P<0.01，圖2)。

2.4 低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，表現(xiàn)為S期細(xì)胞的比率減少(25 ppm，27.98%±3.77%；150 ppm， 39.83%±1.99%；P<0.05)G1期細(xì)胞的比率增多(25 ppm，57.81%±5.63%；43.77%±6.176%；P<0.01)。兩組間G2期細(xì)胞的比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.5 低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)低氘環(huán)境下胃癌細(xì)胞的早期凋亡及晚期凋亡情況。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞的早期凋亡比率分別為1.593%±0.206%、1.290%±0.053%，晚期凋亡比率分別為1.907%±1.068%、1.757%±1.097%，兩組細(xì)胞早凋及晚凋比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組死亡細(xì)胞的比率分別為3.500%±1.274%、3.047%±1.111%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

2.6 低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響

PCNA是反映腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5)。

3 討論

目前，臨床上對(duì)胃癌的治療效果遠(yuǎn)不盡人意。近幾年，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明降低水中氘元素的含量能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[12,13]。然而，關(guān)于低氘水對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響卻鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，低氘環(huán)境能夠通過(guò)下調(diào)PCNA的表達(dá)及阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。由于胃粘膜能夠直接與低氘液體(如低氘水)接觸，因此這一發(fā)現(xiàn)有望成為治療胃癌的新策略。

相關(guān)研究證明，低氘水對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率高達(dá)20%，其抑制效果在不同的作用時(shí)間點(diǎn)各有差異。Cong 等人[8]提出，短時(shí)間接觸低氘環(huán)境(50 ppm)能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，隨后細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)，繼而隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，肺癌細(xì)胞又被抑制增殖。本研究中發(fā)現(xiàn)50 ppm及100 ppm濃度的低氘環(huán)境并不能抑制胃癌細(xì)胞增殖。25 ppm至105 ppm濃度范圍內(nèi)的低氘環(huán)境對(duì)生物體無(wú)毒副作用[10,17]。因此，本研究將氘濃度降低至25 ppm并且觀察到了其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。與其他相關(guān)研究相比，本研究中低氘環(huán)境對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制率為10%左右，這可能與研究者所用的細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有關(guān)。與其它研究不同，本研究在制備低氘水時(shí)嚴(yán)格控制了水中其他元素(如18O等)的含量，以此排除氘元素以外其他因素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。因精餾法制備低氘水時(shí)，水中的18O及其他微量元素和電解質(zhì)的含量也會(huì)隨之改變，因此選擇了150 ppm自然水而不是蒸餾水作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。

本文初步探索了低氘環(huán)境抑制胃癌細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制，例如細(xì)胞周期、凋亡等。發(fā)現(xiàn)低氘環(huán)境能夠使胃癌細(xì)胞停留于G1期。相關(guān)研究也表明，細(xì)胞的分裂增殖與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變及氘元素的含量密切相關(guān)[14, 15]。此外，細(xì)胞中D/H比值的增高可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期[16]，與以上研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)揭示了低氘環(huán)境能夠降低S期胃癌細(xì)胞的比率。這可能與低氘環(huán)境改變了胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，影響細(xì)胞內(nèi)D/H的比率，進(jìn)而調(diào)整細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)源誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生一系列生理改變有關(guān)。此外，相關(guān)研究表明，低氘水能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能與下調(diào)C-myc, Ha-ras 及P53基因的表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制目前尚無(wú)定論[17]。然而，本研究中我們并沒(méi)有觀察到低氘環(huán)境誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，這可能與本研究中所使用的細(xì)胞系有關(guān)。

PCNA是細(xì)胞增殖周期中S期細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)的抗原，因其在多種腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)且與DNA的復(fù)制、修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，因此常作為評(píng)定腫瘤的進(jìn)展及臨床預(yù)后的指標(biāo)[18,19]。本研究發(fā)現(xiàn)25 ppm低氘環(huán)境能夠下調(diào)胃癌細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)，這與本研究中實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞被阻滯在G1期這一結(jié)果相吻合，但還需要更深入的研究其相關(guān)機(jī)制。

綜上所述，低氘環(huán)境下培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期能夠被有效阻滯，胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，這可能與低氘環(huán)境能夠通過(guò)下調(diào)PCNA的表達(dá)、阻滯細(xì)胞周期抑制胃癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)新的胃癌治療策略提供了理論依據(jù)。

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Deuterium depleted environment inhibits the growth of gastric cancer cells： in vitro study

WU Tao1, DUAN Xiao-jian1, TIAN Yu1, CHEN Hai-xu2, XU Zhi-hong3,LIU Jing2, WANG Wei-hua1, ZHU Ling-ling4△, WANG Gang-shi1△

(1. Department of Geriatric Gastroenterology, Chinese PLA General Hospital, 2. Institute of Gerontology and Geriatrics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853; 3. Jiangsu Huayi Technology Co. Ltd, Suzhou 215500; 4. Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850, China)

Objective: To examine whether deuterium depleted environment may affect the biological features of human gastric cancer cells(SGC-7901)and explore the possible underlying mechanisms. Methods: SGC-7901 cells were cultured in RPMI-1640 medium prepared with distilled water of different deuterium concentrations(experimental group: 25ppm deuterium ；control group:150ppm deuterium). Assays on cellular proliferation, cell cycle and apoptosis were conducted at different time points and comparison. The protein expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was measured using Western blot. Results: In contrast to 150ppm group, the proliferation rate of SGC-7901 cells in 25ppm deuterium was decreased by 10% as indicated by the CCK-8 assay. Wound healing ability and the colony formation ability of these cells were also significantly suppressed (P<0.05). Flow cytometry analysis further revealed that exposure to 25ppm significantly increased the ratio of cancer cells at G1 phase (P<0.01) while decreased the ratio at S phase (P<0.05) compared to the 150ppm group. There was no significant difference in apoptosis between the two groups. Down-regulated expression of PCNA was also identified in cancer cells treated with 25ppm deuterium. Conclusion: Deuterium depleted environment inhibited the proliferation of gastric cancer cells, which may be attributed to the down-regulation of PCNA and cell cycle arrest at G1 phase.

deuterium depleted environment； gastric cancer； proliferation； PCNA; cell cycle; apoptosis

2016-04-28

2016-10-24

R453.9

A

1000-6834(2017)01-001-05

△【通訊作者】Tel: 010-66876245，010-66931315; E-mail: wanggangshi@hotmail.com，linglingzhu@hotmail.com