組織切片抗酸染色法的改良和應用體會

陳世梁，吳文川，盧志承

(海南省人民醫(yī)院病理科，海南 ?？?570311)

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組織切片抗酸染色法的改良和應用體會

陳世梁，吳文川，盧志承

(海南省人民醫(yī)院病理科，海南 海口 570311)

目的 探討在組織切片病理診斷中抗酸染色方法的改良和應用，提高結(jié)核病的診斷率。方法選取病理診斷為肺結(jié)核的患者60例，每例選出病變蠟塊1塊，每塊蠟塊切片2張，1張用傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen抗酸染色法染色，另1張用改良抗酸染色法染色，比較兩種染色方法的陽性率和染色效果。結(jié)果60例患者中，應用傳統(tǒng)抗酸染色方法檢出抗酸桿菌28例，陽性率為46.67%，應用改良抗酸染色方法檢出抗酸桿菌49例，陽性率為81.67%。兩種方法檢測結(jié)果陽性率比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與傳統(tǒng)抗酸染色方法相比，改良抗酸染色方法檢出的結(jié)核桿菌細菌量多，菌體粗且著色深。結(jié)論改良的抗酸染色法提高了結(jié)核桿菌的檢出率，值得臨床推廣應用。

抗酸染色；組織切片；結(jié)核分枝桿菌

近年來，隨著免疫組化檢測技術和分子病理技術的廣泛應用，很多特殊染色方法逐漸被免疫組化及分子病理學診斷技術取代。但是，由于結(jié)核桿菌著色的特異性，利用抗酸染色在病理組織切片檢測出結(jié)核桿菌是診斷結(jié)核病的金指標，因此抗酸染色在日常病理工作中仍然發(fā)揮著不可替代的作用。Ziehl-Neelsen抗酸染色法[1]是檢測結(jié)核桿菌的傳統(tǒng)經(jīng)典的方法，但該法存在操作繁瑣費時、陽性率較低等弊端。為此，筆者在實踐工作中加以改良，取得了比較滿意的效果，現(xiàn)介紹如下：

1 材料與方法

1.1 材料 選取海南省人民醫(yī)院病理科2012-2015年經(jīng)病理診斷為肺結(jié)核的患者60例，每例選出病變蠟塊1塊。

1.2 方法 60例蠟塊每例分別切片2張，分成傳統(tǒng)組和改良組，分別進行傳統(tǒng)抗酸染色和改良抗酸染色。

1.2.1 傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen抗酸染色法[1](1)常規(guī)石蠟切片3～5μm厚；(2)常規(guī)二甲苯脫蠟至水；(3)苯酚堿性品紅液染色1 h；(4)自來水洗1 min；(5)0.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘；(6)水洗1 min；(7)Mayer蘇木素復染2 min；(8)流水沖洗10 min；(9)常規(guī)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.2 改良抗酸染色法 (1)石蠟切片厚度5～ 6μm。(2)切片用松節(jié)油和97號汽油按體積比1:1的混合液脫蠟2次，每次約5～10 min；用吸水紙將抹去切片周圍液體至切片稍濕潤；流水漂洗1 min。(3)0.5%的高碘酸溶液氧化5～8 min，流水沖洗2 min，再用蒸餾水浸洗2次，每次30 s。(4)0.2%TritonX-100液處理10 min。(5)苯酚堿性品紅液在室溫下染色20～30 min。 (6)流水洗去多余染液。(7)20%硫酸水溶液分化30 s～ 1 min。(8)流水沖洗5 min。(9)Mayer蘇木素淺染胞核。(10)流水沖洗10 min。(11)置于60℃烘箱內(nèi)烘干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 統(tǒng)計學方法 兩種方法結(jié)果的比較采用SPSS18.0進行χ2檢驗，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種抗酸染色法的抗酸桿菌檢測結(jié)果比較 60例患者中，應用傳統(tǒng)抗酸染色方法檢出抗酸桿菌28例，陽性率為46.67%，應用改良抗酸染色方法檢出抗酸桿菌49例，陽性率為81.67%。兩種方法檢測結(jié)果比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=15.983，P<0.01)。

2.2 兩種抗酸染色法的染色效果比較 傳統(tǒng)抗酸染色方法中的結(jié)核桿菌呈紅色，菌體呈細桿狀，背景著色較深(圖1)。改良抗酸染色方法中的陽性結(jié)核桿菌量增多，呈亮紅色，菌體呈桿狀，色澤鮮明，菌體和背景著色適度，對比明顯而清晰(圖2)。

圖1 Ziehl-Neelsen抗酸染色法(×100)

圖2 改良抗酸染色法(×100)

3 討論

在病理診斷工作中進行抗酸染色的目的是在組織切片中檢出抗酸桿菌進而確診結(jié)核病。抗酸桿菌屬分枝桿菌，其菌體細胞壁上含有不等量的脂質(zhì)，主要是磷脂、脂肪酸和蠟質(zhì)三種成分[2]。其中，最主要的成分是蠟質(zhì)，它分布在細胞壁最外層形成完整的蠟樣外殼，因此一般染液難以滲透而染色不佳，但實踐證明苯酚堿性品紅可通過延長時間或加熱與結(jié)核桿菌細胞壁相結(jié)合成復合物而著色，這種物質(zhì)可抵抗酸性物質(zhì)的脫色[3]，因此在病理組織切片中經(jīng)酸脫色后仍呈紅色的桿菌為結(jié)核桿菌，這就是結(jié)核桿菌著色的特異性。

傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen抗酸染色法不但陽性率低而且存在以下缺點：①需苯酚堿性品紅液常溫復染1 h，不但費時而且操作時間太長苯酚堿性品紅液出現(xiàn)干涸影響制片質(zhì)量；②苯酚堿性品紅液復染時對組織切片加熱可縮短染色時間，但在工作中我們發(fā)現(xiàn)加熱的時間和溫度往往不易控制，而且加熱時染液蒸發(fā)快也容易出現(xiàn)組織切片干涸現(xiàn)象。

為了提高抗酸染色的陽性率，我們根據(jù)抗酸桿菌的細胞壁結(jié)構特點和著色特異性，從以下幾點對Ziehl-Neelsen抗酸染色法進行改良：①適當增加切片的厚度，5～6μm最為適宜，此厚度即能增加切片中菌體的含量而易于找到細菌，又能清晰地觀察細菌的形態(tài)。②傳統(tǒng)染色法用二甲苯脫蠟，由于二甲苯對于結(jié)核桿菌的脂質(zhì)細胞壁有一定的破壞，致其與苯酚堿性品紅相結(jié)合力減弱或消失，不易染色。改良染色法用汽油和松節(jié)油(體積比1：1)混合液替代二甲苯進行脫蠟，可使菌體細胞壁脂質(zhì)不受破壞，保存菌體壁的完整性。與傳統(tǒng)抗酸染色方法相比，改良抗酸染色方法檢出的結(jié)核桿菌細菌量多，菌體粗且著色深。③按染色特性，結(jié)核桿菌分為抗酸性和嫌色性，后者完全喪失與苯酚堿性品紅相結(jié)合力。濫用抗生素、治療不當?shù)刃袨榭墒箺U菌從抗酸性部分或全部轉(zhuǎn)為嫌色性，因此傳統(tǒng)染色方法檢測這類結(jié)核桿菌的陽性率往往比較低。嫌色性結(jié)核桿菌胞壁含有糖脂結(jié)構，高碘酸可使糖脂結(jié)構上兩個帶有羥基的相鄰的碳鍵氧化成醛基，而堿性品紅能與醛基發(fā)生反應，產(chǎn)生抗酸性的紫紅色基團。因此，改良抗酸染色法中切片在苯酚堿性品紅液染色前經(jīng)過0.5%高碘酸處理，可使嫌色性結(jié)核菌獲得抗酸染色的特性，從而使苯酚堿性品紅與抗酸桿菌結(jié)合更加牢固，增強抗酸桿菌染色效果[4]。④針對結(jié)核桿菌菌體胞壁上含有不等量的脂質(zhì)，一般染液難以滲透而不易著色的熱點，改良抗酸染色法中切片在苯酚堿性品紅液染色前先用TritonX-100處理。TritonX-100是非離子型表面活性劑，具有與極性分子和非極性分子相結(jié)合的親水基團和親油基團，能降低物質(zhì)界面的張力和溶解脂質(zhì)，因此能使菌體胞壁中的脂類在短時間內(nèi)脫去，增加細胞膜的通透性，提高染液的滲透力，使苯酚堿性品紅能順利地滲入菌體壁，使染色效果得到明顯改善[5]，對提高抗酸桿菌檢出率有一定的作用。⑤乙醇可脫去結(jié)核桿菌體表面的蠟質(zhì)，破壞菌體細胞壁完整性而容易造成染色結(jié)果假陰性，因此改良抗酸染色法整個操作過程都不經(jīng)乙醇浸洗。⑥20%硫酸水溶液褪色較弱，時間稍長影響不大，因此改良抗酸染色法用20%硫酸進行分化，操作過程更容易操控。

[1]王伯沄,李玉松,黃高昇,等.病理學技術[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:160.

[2]梁英杰,凌啟波,張威.臨床病理學技術[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:116.

[3]徐開軍,孫濤.抗酸染色中堿性品紅用量分析[J].臨床與實驗病理學雜志,2014,30(11):1315.

[4]胥維勇.氧化劑和表面活性劑在抗酸染色中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志,2013,29(1):103-104.

[5]王德田,董建強.實用現(xiàn)代病理學技術[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社,2012:133-134.

R446.8

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1003—6350(2017）09—1523—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.053

2016-11-16)

陳世梁。E-mail：chenshiliang168@163.com