應用TMT結合質(zhì)譜技術篩選高原紅細胞增多癥患者血漿差異表達蛋白*

趙 婧， 蘇占海， 劉永年， 汪曉洲， 楊應忠, 3, 4, 5△

(1青海大學醫(yī)學院, 2青海省心腦血管病?？漆t(yī)院內(nèi)科, 3青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心, 4青海省高原醫(yī)學應用基礎重點實驗室, 5青海-猶他高原醫(yī)學聯(lián)合重點實驗室，青海 西寧 810001)

應用TMT結合質(zhì)譜技術篩選高原紅細胞增多癥患者血漿差異表達蛋白*

趙 婧1， 蘇占海1， 劉永年1， 汪曉洲2， 楊應忠1, 3, 4, 5△

(1青海大學醫(yī)學院,2青海省心腦血管病?？漆t(yī)院內(nèi)科,3青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心,4青海省高原醫(yī)學應用基礎重點實驗室,5青海-猶他高原醫(yī)學聯(lián)合重點實驗室，青海 西寧 810001)

目的： 應用串聯(lián)質(zhì)譜標簽(TMT)結合質(zhì)譜技術比較高原紅細胞增多癥(HAPC)患者和健康對照者血漿中的差異表達蛋白。方法: 收集HAPC患者血漿4例，與之相匹配的健康對照組血漿5例，組內(nèi)等量混合后利用多重免疫親和層析柱去除14種高豐度蛋白，TMT試劑標記后樣本進行液相色譜分離，采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜鑒定及相對定量；獲取HAPC患者和健康對照血漿各20例，ELISA方法驗證部分篩選的差異蛋白。結果: 共鑒定和定量了1 094種蛋白，差異表達的蛋白有249種，其中HAPC組較健康對照組表達量≥1.5倍的上調(diào)蛋白質(zhì)有162種，表達量≤67%的下調(diào)蛋白質(zhì)有87種；C反應蛋白和血清淀粉樣蛋白A在HAPC組中較健康對照組表達量均上調(diào)(P<0.05)。結論: 篩選出多種與炎癥相關的差異表達蛋白，為深入研究HAPC發(fā)生機制奠定了良好基礎。

高原紅細胞增多癥； 串聯(lián)質(zhì)譜標簽； 質(zhì)譜

高原紅細胞增多癥(high-altitude polycythemia，HAPC)是指長期生活在海拔2 500 m以上高原的世居者或移居者，對高原低氧環(huán)境逐漸失去習服而導致的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為血液紅細胞過度增多，是最常見的一種慢性高原病。由于紅細胞過度增多，血液黏滯度異常增高，微循環(huán)障礙產(chǎn)生，組織嚴重缺氧，易導致血栓形成或局部組織壞死等并發(fā)癥[1]。目前，HAPC發(fā)病機制仍不清楚，學者們提出是遺傳因素和高海拔環(huán)境因素相互作用的共同結果，具有遺傳易感性，并且遺傳因素在發(fā)病機制中起決定性作用[2-3]，雖然已為HAPC分子機制研究奠定基礎，卻不能全面系統(tǒng)地闡述其內(nèi)在的各種關聯(lián)，且HAPC易感者缺乏早期有效的診斷方式和生物標記物。進一步深入研究HAPC的發(fā)病機制，對在高原人群中早期預防和治療HAPC具有至關重要的指導意義。近年來，蛋白質(zhì)組學技術的應用為研究疾病發(fā)病機制、尋找適宜的生物標志物提供了可能[4]。液相色譜質(zhì)譜技術對蛋白和肽段的分離鑒定發(fā)展迅速，它能夠避免基于凝膠的雙向電泳技術對蛋白分離范圍有限及人為誤差較大等的不足。串聯(lián)質(zhì)譜標簽(tandem mass tags，TMT)是一種同量異序化學標簽，是通過串聯(lián)質(zhì)譜對不同樣品中的蛋白進行同時鑒定和定量的有力工具。本研究旨在應用TMT結合質(zhì)譜技術，篩選HAPC病人與健康對照間的血漿差異表達蛋白，通過生物信息學分析篩出在HAPC中起調(diào)控作用的重要差異蛋白，并進一步探索它們在HAPC發(fā)生機制中的關鍵作用。

材 料 和 方 法

1 研究對象

1.1 研究對象納入/排除標準 依據(jù)2004年第六屆國際高原醫(yī)學和低氧生理學術大會制定的《慢性高原病青海診斷標準》[5]和我國高原病命名、分型及診斷標準(1995年中華醫(yī)學會第三次全國高原醫(yī)學學術討論會推薦稿)[6]。制定HAPC納入標準：(1)居住海拔3 000 m以上高原，已連續(xù)居住≥5年，病程呈慢性經(jīng)過；(2)臨床表現(xiàn)主要是頭痛、頭暈、乏力、睡眠障礙、紫紺、結膜充血、皮膚紫紅等多血癥病狀；(3) 具以下3項血液學參數(shù)： 紅細胞(red blood cell, RBC)≥6.5×1012/L，血紅蛋白(hemoglobin, Hb)≥200 g/L，紅細胞壓積(hematocrit, Hct)≥65%；(4)除外真性紅細胞增多癥和其它繼發(fā)性紅細胞增多；(5)轉至海拔低處，癥狀減輕，病情逐漸好轉，RBC、Hb和Hct逐漸降低；(6)經(jīng)過體檢，肝腎功能、心電圖、胸片、腹部超聲等檢測指標均無異常者；(7)近期無外傷及手術病史，無發(fā)熱、炎癥及其它可能影響檢測結果的情況。高原健康對照納入標準：(1)居住海拔3 000 m以上高原，已連續(xù)居住≥5年；(2)Hb在150～190 g/L；(3)無疾病史，經(jīng)過體檢，肝腎功、心電圖、胸片、腹部超聲等檢測指標均無異常者；(4)近期無外傷及手術病史，無發(fā)熱、炎癥及其他可能影響檢測結果的情況。

1.2 研究對象來源 HAPC患者(HAPC patient，HAPC-P)組20例病人(蛋白質(zhì)譜實驗部分僅選取4例，ELISA實驗部分20例)來自2015年11月～2016年5月在青海省心腦血管病?？漆t(yī)院住院的漢族男性患者，均長期居住于海拔3 000 m以上地區(qū)，Hb > 210 g/L，均無吸煙史，無慢性肺部疾病，無慢性呼吸功能紊亂或某些慢性病變而引起的低氧血癥，無發(fā)熱、炎癥及其它影響檢測結果的情況。健康對照(HAPC-control，HAPC-C)組入選的20例漢族男性(蛋白質(zhì)譜實驗部分僅選取5例，ELISA實驗部分20例)來自2016年4月青海省人民醫(yī)院體檢中心，均長期居住于海拔3 000 m以上地區(qū)，無吸煙史，體檢結果健康，無疾病。所有樣本采集均獲得本人和家屬的知情同意。為排除性別因素對實驗結果的影響，所有研究對象均為男性，HAPC-P組平均年齡49.75±18.08，HAPC-C組平均年齡46.25±4.27，差異無統(tǒng)計學顯著性。

2 主要試劑和儀器

人血漿高豐度蛋白去除試劑盒(Agilent)；BCA定量試劑盒和TMT Isobaric Mass Tagging Kit(Pierce)；考馬斯亮蘭 R-250(北京經(jīng)科宏達生物技術有限公司)；人C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)定量酶聯(lián)檢測試劑盒和人血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)定量酶聯(lián)檢測試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)。質(zhì)譜儀(Agilent)；高效液相色譜儀(Thermo Scientific)；真空濃縮儀(Eppendorf)；連續(xù)光譜酶標儀(Molecular Devices)。

3 主要方法

3.1 血漿樣本的采集 所有對象禁食12 h，其中HAPC疾病組病人未給予治療，于次日清晨采肘靜脈血5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血漿分裝后于-80 ℃冰箱保存。

3.2 去除血漿高豐度蛋白 使用人血漿高豐度蛋白去除試劑盒按照說明書操作步驟去除血漿內(nèi)14種高豐度蛋白。去除高豐度蛋白后，按照BCA定量試劑盒說明書準備標準品。使用酶標儀測562 nm吸光度值，并繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線，計算樣品的濃度。根據(jù)測定的濃度每組取100 μg蛋白分裝，同時取20 μg蛋白進行SDS-PAGE以檢測血漿樣本去除高豐度蛋白效果，濃縮膠電壓80 V持續(xù)40 min，分離膠電壓120 V持續(xù)120 min，考馬斯亮藍R-250染色，脫色至條帶清晰。

3.3 TMT標記全蛋白 各取100 μg低豐度蛋白樣品，加入尿素、0.1% SDS和三乙基碳酸氫銨(TEAB， triethylammonium bicarbonate),再加LC-MS級超純水至體積100 μL，置于冰上。加入5 μL TCEP，于55 ℃恒溫振蕩金屬浴中，700 r/min反應1 h。然后加入5 μL碘乙酰胺，于25 ℃恒溫振蕩金屬浴中700 r/min避光反應30 min。反應結束加入660 μL丙酮，-20 ℃下沉淀過夜后4 ℃下10 000 r/min離心10 min后移去丙酮，室溫條件下沉淀風干。取100 μL TEAB溶解沉淀蛋白，加入胰酶于37 ℃搖床中振蕩酶切過夜。TMT標記使用試劑盒TMT Isobaric Mass Tagging Kit，取41 μL乙腈加入至 0.8 mg TMT10標記試劑中，渦旋振蕩充分溶解。過夜酶切樣品離心后取上清，加入41 μL TMT10 標記試劑，于25 ℃恒溫振蕩金屬浴中，700 r/min反應2 h(HAPC-P組和HAPC-C組分別用TMT10-129C和TMT10-129N標記)后加入8 μL 5%羥氨以終止標記反應，然后混合標記后的樣品用于C18色譜柱分級。

3.4 C18色譜柱樣品分級 配制 C18 色譜緩沖液A液(2%乙腈和98%水，pH=10)和B液(90%乙腈和10%水，pH=10)。用A液平衡C18色譜柱 25 min，運行多肽測試品確認Ultimate 3000 high-performance liquid chromatography系統(tǒng)和色譜柱狀態(tài)良好。將合并的TMT標記后樣品于45 ℃使用真空濃縮液真空濃縮抽干，加入 A 液溶解，使用 5% MS 級氨水調(diào)節(jié) pH 值至10。室溫下 10 000 r/min 離心 5 min，取上清進樣。收集2～15 min 的流出液以及24～63 min 的分級組分，用1.5 mL Eppendorf離心管每分鐘收集1管組分。根據(jù)色譜圖各時間收樣的峰面積進行雙收樣合并，共形成20個峰面積近似的分級組分，于45 ℃真空濃縮抽干。

3.5 質(zhì)譜相對定量檢測 配制液相色譜A液(99.9%水和0.1%甲酸)和 B 液(99.9%乙腈和0.1%甲酸)。分別取分級后的抽干樣品加入上樣緩沖液(96%水、4%乙腈和0.1%甲酸)充分溶解，室溫下10 000 r/mim 離心5 min，取約含1 μg 蛋白的上清進樣到液質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC系統(tǒng)和Q Exactive 質(zhì)譜儀)進行樣品檢測。質(zhì)譜全掃描范圍 m/z350-1 600，一級質(zhì)譜分辨率為70 000(400 m/z 處)，二級質(zhì)譜分辨率為 35 000(400 m/z處)，并選擇全掃描中離子強度 TOP 20 的母離子使用 higher-energy collsional dissociation方法碎裂，進行二級質(zhì)譜序列測定，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)。

3.6 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)處理 從NCBI下載人蛋白數(shù)據(jù)庫用于質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。將生成的質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)使用 Proteome Discoverer軟件在上述數(shù)據(jù)庫中進行搜庫計算分析。選用胰酶特異性酶切，最多允許2個漏切位點，設定 Cys碘乙?；蚑MT10修飾為固定修飾參數(shù)，設定甲硫氨酸氧化為可變修飾參數(shù)，母離子質(zhì)量允差0.0015%，子離子質(zhì)量允差為0.02 Da。選擇低于1%假陽性率(false positive rates，F(xiàn)PR)條件下高度可信的多肽作為蛋白質(zhì)定性鑒定的過濾參數(shù)，選擇特異性多肽用于不同樣品間蛋白質(zhì)的相對定量分析。本實驗中差異蛋白質(zhì)確定標準為: 差異倍數(shù)≥1.5或≤67%。

對質(zhì)譜檢測得到的原始數(shù)據(jù)，使用PD軟件與相應數(shù)據(jù)庫進行搜庫計算分析，對搜庫結果進行過濾，保留可靠的多肽和蛋白。統(tǒng)計分析結果，篩選差異蛋白，對所有差異蛋白應用基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)按照其生物學功能及在機體內(nèi)參與的生理學反應過程進行GO分類，對其生物學過程(biological process, BP)、細胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)進行分析。

3.7 ELISA驗證結果 選取差異蛋白C反應蛋白和血清淀粉樣蛋白A，采用ELISA法按照說明書分別檢測二者在HAPC-P組與HAPC-C組血漿中的含量。

結 果

1 去除高豐度蛋白效果

應用SDS-PAGE檢驗兩組樣品高豐度蛋白去除效果，考馬斯亮藍染色后對比原血漿和去除高豐度蛋白樣品電泳條帶發(fā)現(xiàn)血漿中高豐度蛋白去除效果良好，低豐度蛋白樣品蛋白條帶清晰、豐富，蛋白量多，樣品間蛋白均一性較一致，表明低豐度蛋白得到有效富集,見圖1。

Figure 1.The results of SDS-PAGE of plasma after removal of high-abundance proteins. M: marker; A: high-abundance proteins in HAPC-P group; B: low-abundance proteins in HAPC-P group; C: low-abundance proteins in HAPC-C group; D: high-abundance proteins in HAPC-C group.

圖1 HAPC-P組與HAPC-C組原血漿和去除高豐度蛋白后血漿SDS-PAGE結果

2 生物學功能分析

從質(zhì)譜結果看，在1% FPR的條件下，共鑒定和定量了1 094種蛋白，其中差異表達的蛋白有249種，其中HAPC組較正常組上調(diào)蛋白162種，下調(diào)蛋白87種，其中共篩選出19種炎癥免疫反應相關蛋白。本研究對249種通過鑒定的蛋白進行GO分類。結果發(fā)現(xiàn)，在細胞組分方面，這些蛋白主要位于細胞外囊泡；在生物學過程方面，這些蛋白主要參與抗原加工等生物學過程；在分子功能方面，這些差異蛋白主要涉及酶活性、抗氧化活性等方面,見圖2。

Figure 2.Gene ontology of differential proteins. A: cellular component, top 10; B: biological process, top 10; C: molecular function, top 10.

圖2 差異蛋白的GO分類

3 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡分析和京都基因與基因組百科全書(Kyto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路的富集分析結果

將篩選出的249種蛋白在STRING 數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)中找出這些差異蛋白間的互作關系。對篩選出的差異蛋白CRP、脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein, LBP)、SAA與促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)、缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-15、IL-16、MCP-1、腫瘤壞死因子α(tumor necrotic factor-α，TNF-α)間的蛋白相互作用進行了分析。進一步對參與各類生物過程的蛋白進行富集分析,結果匹配到114條KEGG通路，顯著富集的前10條通路見表1。

表1 KEGG途徑富集分析

Term: the describtion of pathway; ID: the number of pathway.

4 ELISA檢測結果

采取ELISA檢測了CRP和SAA在HAPC-P組和HAPC-C組血漿中的含量。結果顯示血漿CRP水平和SAA水平在HAPC-P組均上調(diào)，較HAPC-C組明顯升高(P<0.05),見表2。

表2 HAPC-P組與HAPC-C組血漿CRP和SAA含量

Table 2.Plasma contentrations of CRP and SAA in HAPC-P group and HAPC-C group (n=20)

ProteinGroupMedian(mg/L)Interquartilerange(mg/L)PCRPHAPC-C2.9114.170.003HAPC-P17.34243.69SAAHAPC-C0.460.780.01HAPC-P1.082.78

討 論

TMT是一種同量異序化學標簽，是通過串聯(lián)質(zhì)譜對不同樣品中的蛋白進行同時鑒定和定量的有力工具。近年來，基于串聯(lián)質(zhì)譜技術在蛋白組學領域受到了越來越多的關注，這種方法包括胰酶酶解多肽的標記及質(zhì)譜鑒定、分析2個部分。由于標記效率極高，幾乎可以在所有多肽的末端進行標記，故提供了定量分析基礎，同時這種標記方法在肽類水平上的標記要比其它化學標記方法更為有效，已廣泛應用于研究疾病發(fā)病機制、尋找適宜的生物標志物等方面。本研究旨在應用TMT結合質(zhì)譜技術，篩選HAPC病人與健康對照間的血漿差異表達蛋白，通過生物信息學分析篩出在HAPC中起調(diào)控作用的重要差異蛋白，并進一步探索它們在HAPC發(fā)生機制中的關鍵作用。

HAPC主要表現(xiàn)為紅細胞過度增多，血液黏滯度異常增高、微循環(huán)障礙，組織嚴重缺氧，易導致血栓形成或局部組織壞死等并發(fā)癥[1]。HAPC的發(fā)病機制復雜多樣，公認與HAPC發(fā)生有關的有缺氧誘導因子-促紅細胞生成素途徑：缺氧環(huán)境下，腎臟及腎外低氧感受器受到低氧刺激，通過HIF-1α途徑加速腎臟分泌EPO，進而與骨髓內(nèi)干細胞EPO受體結合引起紅系增殖，增高血液中的紅細胞數(shù)量[7]。流行病學調(diào)查表明HAPC男性的發(fā)病率明顯高于女性，同時青年人顯著高于老人和兒童，提示雄激素在HAPC發(fā)病中有重要作用：雄激素與其特異的AR結合，促進腎臟紅細胞生成素的產(chǎn)生，刺激紅細胞的生成[8]，進一步發(fā)展成為HAPC。

目前，越來越多的學者研究表明炎癥因子在高原病的發(fā)病中起到了重要作用：高原缺氧環(huán)境中，內(nèi)毒素、TNF-α等誘導單核巨噬細胞產(chǎn)生促炎因子IL-1、IL-6、IL-8和抗炎因子IL-10 增多，加速了骨髓造血干細胞增殖，促使紅細胞過度增生，血液黏稠、流動阻滯，加重全身多臟器血流負擔，進而引發(fā)如損傷微循環(huán)、部分細胞死亡及免疫功能調(diào)節(jié)紊亂等慢性炎癥反應[1,9]。Nizet等[10]的研究顯示，低氧可影響和啟動炎癥免疫反應；Kubo等[11]的研究發(fā)現(xiàn)高原肺水腫(high-altitude pulmonary edema，HAPE)患者的支氣管肺泡灌洗液中IL-1、IL-6、CRP、TNF-α等炎性標志物明顯增多；Zhou等[12]在實驗研究中模擬高原急性暴露發(fā)現(xiàn)大鼠血管通透性和腦含水量顯著增高，腦組織中TNF-α、NO等炎癥介質(zhì)隨著海拔的增加而增加。學者們對HAPC與炎癥因子間的關系也進行了研究：于前進等[13]應用蛋白芯片檢測HAPC患者血清中40種炎癥細胞因子的表達，發(fā)現(xiàn)HAPC患者血清 IL-1β、IL-2、IL-3、IL-15、IL-16、MCP-1和TNF-α表達水平均顯著增高；Li等[7]的研究顯示高原低氧上調(diào)IL-3和IL-6，促進造血干細胞選擇性向紅系分化，進而誘導紅細胞增生。

本課題組應用TMT結合質(zhì)譜技術，對HAPC患者的血漿進行蛋白質(zhì)組學分析，較其他學者的研究而言，本實驗鑒定出的差異表達蛋白更廣更全，相關資料沒有在本文一一陳列，讀者可以向作者索要。本實驗中共鑒定和定量了1 094種蛋白，其中差異表達的蛋白有249種，其中HAPC組較健康對照組表達量上調(diào)的蛋白有162種，表達量下調(diào)的蛋白有87種，其中又篩選出19種差異表達的與炎癥免疫反應相關蛋白；結合GO功能分類中差異蛋白主要參與抗原加工等生物學過程、KEGG通路中抗原加工通路顯著富集，發(fā)現(xiàn)亞油酸代謝、花生四烯酸代謝等涉及炎癥免疫反應的通路發(fā)生變化，且差異表達蛋白中CRP、SAA、LBP等炎性免疫蛋白差異倍數(shù)大、特異性多肽數(shù)量高，并且ELISA方法驗證結果顯示CRP和SAA在血漿中的含量均在HAPC組中上調(diào)，表達量高于健康對照組，由此我們推測HAPC的發(fā)生中炎性因子有重要作用。單獨蛋白通過彼此之間的相互作用構成蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡來參與生物信號傳遞、基因表達調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細胞周期調(diào)控等生命過程的各個環(huán)節(jié)，所以我們將篩選出的3個蛋白CRP、LBP、SAA與其他學者報道研究過的與HAPC發(fā)生有關的因子，在 STRING 數(shù)據(jù)庫中找出它們之間的互作關系，發(fā)現(xiàn)除CRP以外各因子間互相密切作用，本實驗結果與其他學者的研究結果基本一致。

機體組織器官長期處于缺氧狀態(tài)，發(fā)生能量代謝障礙致使細胞內(nèi)氧自由基生產(chǎn)增加，使細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、乳酸(lactic acid，LA)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)活性增加，破壞機體內(nèi)平衡而引發(fā)或加重細胞炎癥反應，致使紅細胞發(fā)生水腫、變性、溶解、凋亡等炎癥反應[12,14]，在高原缺氧環(huán)境中HAPC患者機體炎癥細胞因子可能存在多途徑相互作用調(diào)控人體組織細胞，以適應高原缺氧環(huán)境，且又在機體內(nèi)誘導或介導炎癥反應。本文中我們對篩選出3種炎性因子CRP、SAA和LBP分別進行分析討論。

CRP由5個完全相同的非糖基化的亞單位非共價聯(lián)結,每個亞單位相對分子質(zhì)量 23 017,由 206個氨基酸殘基組成。CRP基因位于1號染色體長臂,基因組長215 kb,有2個外顯子,中間由1個內(nèi)含子隔開,編碼206個氨基酸殘基。CRP可以抑制骨髓源性內(nèi)皮母細胞的存活和分化，加速內(nèi)皮細胞凋亡，抑制血管新生；CRP本身可以促進單核細胞釋放組織因子，還可通過外周巨噬細胞刺激組織因子合成，進而促進炎癥時血管內(nèi)的血栓形成；CRP可通過與受體的結合誘導許多致炎細胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α 的合成與分泌[15]，還可通過與巨噬細胞、單核細胞上的受體結合，誘導單核巨噬細胞系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用促進H2O2產(chǎn)生，從而引起一系列炎癥反應和細胞組織破壞。然而，本實驗顯示CRP與其它炎性因子及EPO、HIF-1α、AR間無關聯(lián)，但是從已報道的文獻可知CRP可誘導如IL-1β、IL-6和TNF-α 的合成與分泌進而誘導發(fā)生HAPC，且從我們分析的數(shù)據(jù)來看CRP的差異倍數(shù)和特異性多肽數(shù)量都很高，ELISA驗證結果同樣顯示HAPC組的CRP濃度高于健康對照組，所以我們推測CRP與HAPC的發(fā)生發(fā)展中還存在許多未知因子及關聯(lián)值得我們進一步進行探索。

SAA位于11號染色體短臂，大小為150 kb，有4個外顯子和3個內(nèi)含子，已發(fā)現(xiàn)4種人SAA基因，均在11號染色體上。正常時人體內(nèi)的SAA主要來源于肝細胞，當機體受到低氧刺激后發(fā)生炎癥反應，產(chǎn)生一系列細胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等刺激肝細胞釋放SAA，且三者對SAA的誘導功能有明顯的協(xié)同作用[16]。正常單核細胞中SAA可誘導凝血激酶mRNA的表達，促進血小板在血管損傷處與纖維結合蛋白黏附，炎癥狀態(tài)下與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體結合促進血栓的形成，提示SAA可能參與了炎癥損害時的血栓形成；SAA可聯(lián)合中性粒細胞誘導細胞因子的釋放，造成細胞因子的蓄積，當單核細胞被SAA刺激后發(fā)現(xiàn)TNF產(chǎn)生增多，提示SAA可導致血管的炎性反應，造成血管內(nèi)皮細胞損傷和功能紊亂[17]。

LBP是存在于正常人血漿中的一種糖蛋白，分子量為60 kD，人LBP基因全長28.5 kb，含有14個外顯子。LBP與脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 結合后，通過模式識別受體的方式與單核-巨噬細胞膜上的膜錨定CD14(member CD14，mCD14)結合形成 LPS-LBP-mCD14復合物,經(jīng)單核-巨噬細胞膜上Toll樣受體4-髓樣分化蛋白2-髓樣分化蛋白因子88(TLR4-MD2-MyD88)識別并向細胞內(nèi)傳遞信號,再經(jīng)NF-κB 向胞核內(nèi)傳遞信號, 從而介導炎癥因子的分泌[18]。當血清LBP含量升高時,會導致單核-巨噬細胞過度活化,大量分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等和一氧化氮(nitric oxide，NO),導致過激炎癥發(fā)生進而造成機體損害；大量釋放的NO與超氧陰離子相互結合形成過氧化亞硝基化合物，損害線粒體呼吸功能，影響電轉運和ATP生產(chǎn)速度[19]，發(fā)生能量代謝障礙并破壞機體內(nèi)平衡而引發(fā)或加重細胞炎癥反應，致使細胞發(fā)生水腫、變性、溶解、凋亡等炎癥反應。

本研究采用TMT技術篩選出了一系列HAPC相關的血清差異蛋白，但是這些蛋白在HAPC發(fā)生發(fā)展中的具體機制仍不能闡述明白，需要進一步評價這些血漿差異蛋白作為HAPC候選標志物的可靠性。且由于實驗經(jīng)費有限，ELISA方法僅驗證了CRP和SAA這2個因子，故后續(xù)我們將進一步擴大病例對差異表達蛋白進行深入驗證討論，繼續(xù)探索炎癥因子在HAPC發(fā)生發(fā)展中的機制，尋找HAPC易感者早期有效的診斷方式和生物標志物。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Differentially expressed plasma proteins in high-altitude polycythemia patients based on technique of TMT combined with mass spectrometry

ZHAO Jing1, SU Zhan-hai1, LIU Yong-nian1, WANG Xiao-zhou2, YANG Ying-zhong1, 3, 4, 5

(1SchoolofMedicine,QinghaiUniversity,2DepartmentofInternalMedicine,QinghaiCardiovascularandCerebrovascularDiseaseSpecialHospital,3ResearchCenterforHighAltitudeMedicalScience,SchoolofMedicine,QinghaiUniversity,4BasicandAppliedKeyLaboratoryforHighAltitudeMedicalScienceandTechnologyofQinghai,5Qinghai-UtahUnitedKeyLaboratoryforHighAltitudeMedicalScience,QinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:yingzhong-yang@hotmail.com)

AIM: To screen differentially expressed proteins in plasma of the patients with high-altitude polycythemia (HAPC) and healthy people by the technique of tandem mass tags (TMT) combined with mass spectrometry. METHODS: Four HAPC patients and five matched healthy individuals were enrolled, and their plasma samples were obtained. After balanced mixing, multiple immune affinity chromatography column was used to remove 14 kinds of high-abundant proteins, and HPLC-MS/MS using an isobaric TMT proteomic technology was performed to indentify the differentially expressed proteins among groups. The concentrations of C-reactive protein (CRP) and serum amyloid A (SAA) proteins in the plasma in 20 HAPC patients and 20 health controls were measured by ELISA.RESULTS: A total of 1 094 kinds of proteins were identified, and 249 differentially expressed proteins were screened, with 162 kinds of proteins up-regulated by ≥1.5 folds and 87 kinds of proteins down-regulated by ≤67% in HAPC group. The plasma concentrations of CRP and SAA in HAPC patients were higher than those in health controls (P<0.05). CONCLUSION: Many kinds of differentially expressed proteins screened out are related to inflammation, which lays a foundation for further study of HAPC pathogenesis.

High-altitude polycythemia; Tandem mass tags; Mass spectrum

1000- 4718(2017)05- 0944- 07

2016- 11- 29

2017- 02- 28

青海省科技廳科技支撐計劃(No. 2015-SF-124); 青海省科技廳應用基礎基金項目(No. 2016-ZJ-706)

R339.5+4; R599.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.030

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