人參皂苷 Rg1對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠行為學(xué)變化和海馬神經(jīng)元自噬的影響*

吳仲敏， 程正文， 倪桂蓮， 邵愛(ài)民， 崔 融△

(1臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，浙江 臺(tái)州 318000； 2臨海市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 浙江 臨海 317000)

人參皂苷 Rg1對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠行為學(xué)變化和海馬神經(jīng)元自噬的影響*

吳仲敏1, 2， 程正文2， 倪桂蓮2， 邵愛(ài)民2， 崔 融2△

(1臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，浙江 臺(tái)州 318000；2臨海市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 浙江 臨海 317000)

目的： 研究人參皂苷 Rg1 對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)大鼠行為學(xué)變化和海馬神經(jīng)元自噬的影響。方法: 將SD大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組；模型組；人參皂苷Rg1低、高劑量(20和40 mg/kg)組；陽(yáng)性藥(氟西汀)組。采用連續(xù)單一應(yīng)激和足底電擊相結(jié)合方法制備 PTSD 模型，人參皂苷 Rg1 低、高劑量組和陽(yáng)性藥組分別連續(xù)灌胃給藥 21 d，對(duì)照組及模型組每日等體積生理鹽水灌胃。造模前后各組大鼠分別作曠場(chǎng)試驗(yàn)和僵立行為測(cè)定，Nissl染色法觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，免疫熒光雙標(biāo)記法觀察海馬 beclin 1和LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元，Western blot法檢測(cè)海馬 beclin 1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ 蛋白水平以及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，模型組大鼠在曠場(chǎng)箱內(nèi)活動(dòng)次數(shù)減少，木僵率提高,海馬神經(jīng)元排列疏松，出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，伴有不同程度的細(xì)胞固縮,beclin 1和LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多,beclin 1 蛋白水平增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率增大。人參皂苷 Rg1 低、高劑量組大鼠在曠場(chǎng)箱內(nèi)活動(dòng)次數(shù)增加，木僵率下降，海馬神經(jīng)元空泡樣結(jié)構(gòu)減少，細(xì)胞數(shù)量增多，beclin 1和LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元減少，beclin 1 蛋白水平下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率減少。其中，人參皂苷Rg1高劑量組較Rg1低劑量組上述改變更為明顯。結(jié)論: PTSD 模型大鼠存在明顯的海馬神經(jīng)元自噬增強(qiáng)和行為學(xué)異常表現(xiàn)。人參皂苷 Rg1 對(duì) PTSD 癥狀有明顯改善作用，其機(jī)制可能與抑制海馬神經(jīng)元異常自噬活動(dòng)有關(guān)。

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙； 人參皂苷 Rg1； 海馬； 自噬

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指由突發(fā)性、威脅性或?yàn)?zāi)難性生活事件導(dǎo)致長(zhǎng)期持續(xù)存在的精神障礙[1]。其臨床表現(xiàn)以再度體驗(yàn)創(chuàng)傷為特征，并伴有情緒的易激惹和回避行為[2]。近年來(lái)，隨著嚴(yán)重自然災(zāi)害、重大傳染病流行和突發(fā)事件的不斷發(fā)生，PTSD 呈明顯上升趨勢(shì)[3]，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。已有的研究認(rèn)為，PTSD 的發(fā)生與海馬神經(jīng)元萎縮、凋亡、異常自噬以及突觸萎縮等改變相關(guān)聯(lián)[4-5]，其中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)系統(tǒng)在PTSD海馬的病理變化中扮演重要角色，5-HT系統(tǒng)功能低下被認(rèn)為是PTSD的主要病因[6-7]，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明了。人參皂苷 Rg1(ginsenoside Rg1)是人參的主要活性成分，具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用[8]，能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生,提高免疫功能[9]，但其對(duì)PTSD是否有干預(yù)作用，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)連續(xù)單一應(yīng)激(single prolonged stress)和足底電擊(foot stock)相結(jié)合的方法制備 PTSD 大鼠模型[10]，觀察人參皂苷 Rg1對(duì)PTSD大鼠行為學(xué)變化和海馬神經(jīng)元自噬的影響，探討人參皂苷 Rg1對(duì)PTSD大鼠的干預(yù)作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)儀器、藥物及試劑

行為學(xué)自動(dòng)觀察分析系統(tǒng)：采用Noldus行為學(xué)研究設(shè)備，含計(jì)算機(jī)、攝像監(jiān)控及Observer、EthoVision等分析軟件。人參皂苷 Rg1 由上海同田生物技術(shù)有限公司提供；鹽酸氟西汀分散片，每片含鹽酸氟西汀相當(dāng)于氟西汀 20 mg，由Lilly生產(chǎn)；兔抗beclin 1 抗體和兔抗LC3抗體均購(gòu)自Abcam；放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(bicinchonic acid，BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康成年雄性 SD 大鼠，體重(200±20)g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)為SYXK-2012-0178；適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d后，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，剔除水平和垂直活動(dòng)總分低于10的大鼠。而后采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)合格的大鼠50只，隨機(jī)分成 5 組，即對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥(氟西汀)組和人參皂苷 Rg1 低、高劑量組，每組 10 只。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 PTSD 模型的建立及干預(yù)方法 大鼠適應(yīng)性單籠飼養(yǎng) 7 d后，除對(duì)照組外，其余大鼠均采用連續(xù)單一應(yīng)激和足底電擊相結(jié)合方法制備PTSD模型：先給予單一連續(xù)應(yīng)激(禁錮 2 h，強(qiáng)迫游泳 20 min，乙醚麻醉至昏迷)，30 min后大鼠置于電擊箱(40 cm×30 cm×25 cm)適應(yīng)196 s后給予 15 個(gè)循環(huán)周期(電流0.8 mA，持續(xù) 10 s，間歇 10 s)的足底電擊。對(duì)照組大鼠放入相同的電擊箱10 min，不給予足底電擊。電擊結(jié)束后把動(dòng)物放回鼠籠靜養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為：22～25 ℃，晝夜節(jié)律，自由飲水?dāng)z食。實(shí)驗(yàn)期間每天9:00予陽(yáng)性藥組大鼠灌服氟西汀，氟西汀的用藥劑量為10 mg/kg；人參皂苷低、高劑量組大鼠分別灌服人參皂苷 Rg1 20和40 mg/kg[11-12]，均溶于生理鹽水中；對(duì)照組及模型組每日等體積生理鹽水灌胃。各組灌胃容積均為5 mL/kg，連續(xù)給藥 21 d后測(cè)試實(shí)驗(yàn)效應(yīng)。

3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠焦慮水平 連續(xù)給藥 21 d后分別取各組大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)在安靜環(huán)境下進(jìn)行，采用特制的曠場(chǎng)箱(100 cm × 100 cm × 40 cm)，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，箱體為立方形，內(nèi)側(cè)壁及底面為灰色，用黑線劃分為 25 格，每格形制均為 20 cm × 20 cm。沿側(cè)壁的格稱(chēng)為外周格(16 個(gè)周邊正方形)，其余為中央格(9 個(gè)中心正方形)。正中格正上方安置攝像頭。將動(dòng)物放入箱內(nèi)底面正中格內(nèi)，同時(shí)用自動(dòng)觀察分析系統(tǒng)攝像，觀察大鼠在5 min內(nèi)穿越格數(shù)(4爪均進(jìn)入方格才記數(shù)，為水平運(yùn)動(dòng)得分)和后肢直立次數(shù)(2 前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運(yùn)動(dòng)得分)。每只大鼠僅進(jìn)行1次測(cè)定。每一次測(cè)定完畢后徹底清潔方箱內(nèi)壁及底面再進(jìn)行下一只觀察，以免上次動(dòng)物余留的信息(如動(dòng)物的大、小便和氣味)影響下次測(cè)試結(jié)果。

3.3 僵立行為測(cè)試大鼠恐懼表達(dá) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行僵立行為測(cè)試，將大鼠置于原造模電擊箱中，測(cè) 4 min 內(nèi)的僵立行為，每 10 s測(cè)1次，表現(xiàn)為僵立行為時(shí)為陽(yáng)性，所得陽(yáng)性次數(shù)之和占總次數(shù)的百分比為木僵率。僵立行為是一種普遍見(jiàn)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的防御行為，表現(xiàn)為刻板式的蹲伏姿勢(shì)，可以有一定程度的搖擺，大鼠外觀除呼吸運(yùn)動(dòng)以外其余的肌肉運(yùn)動(dòng)均消失，是大鼠恐懼表達(dá)的一種行為方式。

3.4 Nissl染色法觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu) 行為學(xué)測(cè)試完畢后，隨機(jī)抽取各組大鼠5 只，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)深麻醉,經(jīng)升主動(dòng)脈灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/L PB，pH 7.4)內(nèi)固定，固定后取出腦塊，再固定 2 h，Leica 恒冷箱冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，切片梯度乙醇降至水，0.1% 焦油紫染色 5～10 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

3.5 免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)海馬組織beclin 1 和 LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元 分別取各組大鼠固定后的腦塊，連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm ，隔2取1，分為3套切片，依次裱貼于經(jīng)明膠處理的載玻片上，切片入 PBS 液洗滌 3 遍，80%甲醇(含0.03%過(guò)氧化氫)溶液處理30 min，然后滴加抗體稀釋液4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。其中第1套切片進(jìn)行 NeuN 和 beclin 1 雙標(biāo)記染色，首先切片入兔抗 beclin 1 (1∶1 000)抗體中孵育48 h；再在生物素化的羊抗兔 IgG(1∶200， Vector)中孵育 24 h；然后在avidin結(jié)合的 FITC(1∶200， Vector)中孵育 6 h，經(jīng) PBS 液洗滌 3 遍后，再次將切片置于鼠抗 NeuN(1∶1 000，Abcam)抗體中孵育48 h；用生物素化的羊抗鼠 IgG(1∶200， Vector)孵育 24 h；在avidin結(jié)合的 Texas-red(1∶200， Vector)中孵育 6 h。以上步驟均在 4 ℃ 避光條件下進(jìn)行， 經(jīng) PBS 甘油(1∶1)封片。第2套切片用于 NeuN 和 LC3雙標(biāo)記染色,染色步驟同上。第3套切片作為陰性對(duì)照(用 PBS 液替代 I 抗，其余實(shí)驗(yàn)步驟不變)。

在激光共聚焦顯微鏡下分別觀察紅色 Texas-red 標(biāo)記(細(xì)胞核)的 NeuN 陽(yáng)性神經(jīng)元中綠色 FITC 標(biāo)記(細(xì)胞漿)的 beclin 1和LC3。陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)：隨機(jī)抽取每個(gè)海馬組織雙標(biāo)記陽(yáng)性的 4 張切片，200 倍視野下用顯微鏡目鏡測(cè)微尺(上海光學(xué)儀器廠)計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)(mm2)beclin 1和 LC3 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的平均值。

3.6 Western blot法檢測(cè)海馬組織beclin 1 和 LC3蛋白水平 行為學(xué)測(cè)試完畢后，另取各組大鼠5只，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深麻醉,大鼠斷頭速取新鮮海馬組織，分別稱(chēng)量各組海馬組織 100 mg，按比例加入RIPA 裂解液，冰浴充分研磨，離心取上清為海馬組織總蛋白，參照 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按30 μg 蛋白量上樣，應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入目標(biāo)蛋白 I 抗(1∶1 000)或β-actin I 抗(1∶500)，4 ℃ 反應(yīng)過(guò)夜。次日洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1∶1 000， Vector)，室溫孵育 1 h，洗膜后加 ECL 顯色劑，膠片曝光顯影，采用ImageJ 軟件分析 Beclin 1 和LC3 蛋白表達(dá)情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部資料用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn), 多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用 LSD 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)改變明顯

1.1 人參皂苷 Rg1作用后PTSD大鼠曠場(chǎng)箱內(nèi)垂直和水平運(yùn)動(dòng)得分增加 如表1所示，給予不同的干預(yù)因素21 d 后，5組間垂直運(yùn)動(dòng)(直立次數(shù))和水平運(yùn)動(dòng)均有顯著差異(P<0.01)。其中模型組大鼠在垂直運(yùn)動(dòng)、水平運(yùn)動(dòng)方面均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；與模型組相比，人參皂苷 Rg1 低、高劑量組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分均顯著增加(P<0.05)，氟西汀組的垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分也顯著高于模型組(P<0.01)。

1.2 人參皂苷 Rg1作用后PTSD大鼠木僵率降低 5組間僵立行為百分率均有顯著差異(P<0.01)。其中與對(duì)照組比較，模型組大鼠木僵率明顯提高(P<0.01)；與模型組相比，人參皂苷 Rg1 低、高劑量組大鼠木僵率顯著降低(P<0.05)，氟西汀組的木僵率也顯著低于模型組(P<0.01)，見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠曠場(chǎng)行為和僵立行為測(cè)試結(jié)果比較

Table 1.Comparison of the locomotor activity in open-field test and the stiff rate in stiff behavior test among groups (mean±SD.n=10)

GroupOpen-fieldtestStiffbehaviortestHorizontalmovementVerticalmovementRateofstiffbehavior(%)Control57.6±6.312.4±1.76.8±1.3PTSD28.8±3.5**3.8±0.5**52.6±8.6**Rg1-20mg/kg38.4±7.5△4.8±0.5△33.6±8.3△Rg1-40mg/kg47.8±3.7△△7.3±0.5△△23.5±4.2△△Fluoxetine53.6±5.8△△9.2±1.2△△18.4±3.3△△

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsPTSD group.

2 人參皂苷 Rg1作用后PTSD海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于完整

如圖1所示，對(duì)照組海馬神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，模型組海馬神經(jīng)元排列疏松，出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，伴有不同程度的細(xì)胞固縮；人參皂苷 Rg1 組較之模型組海馬神經(jīng)元排列趨向整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)日趨完整，空泡樣結(jié)構(gòu)不斷減少，細(xì)胞數(shù)量也有所增加，尤以高劑量組改變明顯；氟西汀組海馬神經(jīng)元的數(shù)量、排列和細(xì)胞結(jié)構(gòu)與人參皂苷 Rg1 高劑量組相似。

Figure 1.The distribution of hippocampal neurons in rats (Nissl staining).Scale bar=50 μm.

圖1 Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)與分布

3 人參皂苷 Rg1作用后PTSD海馬beclin 1 和 LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元減少

激光共聚焦顯微鏡下觀察海馬熒光雙標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，5組間beclin 1和LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元均有顯著差異，模型組顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，人參皂苷 Rg1 高劑量組和氟西汀組的beclin 1 和 LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元明顯少于模型組(P<0.01)，略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異,見(jiàn)圖2、表2。

Figure 2.Distribution of beclin 1 and LC3 positive neurons in hippocampus of the rats (immunofluorescence labeling). Scale bar=50 μm.

圖2 免疫熒光標(biāo)記大鼠海馬beclin 1和LC3陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)與分布

表2 各組大鼠海馬beclin 1標(biāo)記陽(yáng)性和LC3標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量

Table 2.Numbers of beclin 1-positive neurons and LC3-positive neurons in rat hippocampus (mm-2. Mean±SD.n=5)

GroupBeclin1-positiveneuronsLC3-positiveneuronsControl4.5±1.15.8±1.3PTSD45.6±7.2**57.6±10.1**Rg1-20mg/kg32.4±4.5△33.6±5.3△Rg1-40mg/kg21.8±3.7△△23.5±4.2△△Fluoxetine11.2±2.2△△11.4±3.3△△

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05 ，△△P<0.01vsPTSD group.

4 人參皂苷 Rg1作用后PTSD海馬神經(jīng)元自噬水平減低

海馬組織Western blot結(jié)果見(jiàn)圖3、表3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，5組間beclin 1 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均有顯著差異。模型組beclin 1 蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯高于對(duì)照組(P<0.01), 人參皂苷 Rg1 高劑量組的 beclin 1 蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯低于模型組(P<0.01)，略高于對(duì)照組；人參皂苷Rg1高劑量組的beclin 1蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均低于低劑量組(P<0.05)。

討 論

PTSD的臨床表現(xiàn)主要為對(duì)創(chuàng)傷事件的病理性重現(xiàn)、對(duì)創(chuàng)傷相關(guān)線索回避、持續(xù)性高喚醒，以及對(duì)創(chuàng)傷經(jīng)歷的選擇性遺忘和情感麻木等。本研究采用連續(xù)單一應(yīng)激和足底電擊相結(jié)合方法制備 PTSD 大鼠模型，通過(guò)曠場(chǎng)行為檢測(cè)和僵立次數(shù)變化來(lái)驗(yàn)證模型制備效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明連續(xù)單一應(yīng)激+足底電擊應(yīng)激能較好地誘發(fā)大鼠多種 PTSD 樣精神和行為異常表現(xiàn),顯示本模型為研究 PTSD 發(fā)病機(jī)制及藥理機(jī)制的較理想的動(dòng)物模型。

Figure 3.The changes of beclin 1 and LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ protein levels in the hippocampus of the rats determined by Western blot.

圖3 Western blot檢測(cè)大鼠海馬beclin 1和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白水平的變化

表3 各組大鼠海馬beclin 1蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平比值的定量結(jié)果

Table 3.Protein quantification of beclin 1 and the expression ratio of LC3-Ⅱ to LC3-Ⅰin rat hippocampus (Mean±SD.n=5)

GroupBeclin1LC3-Ⅱ/LC3-ⅠControl1142.5±655.10.218±0.013PTSD2545.6±877.2**0.676±0.021**RG1-20mg/kg1832.4±754.5△0.433±0.023△RG1-40mg/kg1311.8±683.7△△0.265±0.018△△Fluoxetine1278.2±852.5△△0.211±0.015△△

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsPTSD group.

人參皂苷 Rg1是人參的標(biāo)志性成分，對(duì)老年癡呆、腦缺血、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病有一定改善作用，它還能夠增加神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性，具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用[13],而人參皂苷 Rg1 是否具有抗PTSD作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)連續(xù)單一應(yīng)激+足底電擊應(yīng)激刺激制備PTSD大鼠模型，依據(jù)王巧云等[11]和李彥東等[12]的灌胃劑量與方法，觀察人參皂苷 Rg1抗PTSD的活性，并探討人參皂苷 Rg1抗PTSD的機(jī)制。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和僵立行為測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg1 組大鼠的穿格次數(shù)和直立次數(shù)顯著增加，僵立次數(shù)明顯減少，說(shuō)明人參皂苷 Rg1可以改善大鼠的PTSD 樣行為，對(duì)PTSD具有明顯調(diào)節(jié)作用。 PTSD的海馬組織存在明顯萎縮、體積縮小現(xiàn)象[14-15]，海馬作為中樞邊緣系統(tǒng)的主要結(jié)構(gòu)，與情緒、記憶以及應(yīng)激聯(lián)系密切，海馬損傷會(huì)導(dǎo)致海馬相關(guān)的空間記憶、應(yīng)激、情感控制和對(duì)新奇事物的反應(yīng)處理等過(guò)程的缺陷[16]。本研究發(fā)現(xiàn) PTSD 模型大鼠海馬神經(jīng)元排列疏松，出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，伴有不同程度的細(xì)胞固縮；人參皂苷 Rg1 低、高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)量均有不同程度增加，空泡樣結(jié)構(gòu)明顯減少；陽(yáng)性藥氟西汀組海馬神經(jīng)元在數(shù)量、排列和結(jié)構(gòu)方面的變化均與人參皂苷 Rg1 高劑量組相似。這說(shuō)明人參皂苷 Rg1和氟西汀均具有促進(jìn)海馬神經(jīng)元增殖和減緩PTSD海馬病理進(jìn)程的作用。

有研究報(bào)道PTSD大鼠的海馬神經(jīng)元存在過(guò)度自噬[17]，因此過(guò)度自噬可能是海馬體積縮小的重要原因。臨床上推薦的抗PTSD一線藥物氟西汀是典型的選擇性5-HT再攝取抑制劑，新近的研究認(rèn)為其作用機(jī)制與抑制海馬神經(jīng)元過(guò)度自噬，改善海馬神經(jīng)元突觸重塑性有關(guān)[18]。Beclin 1是調(diào)控自噬的關(guān)鍵因子,也是自噬體的標(biāo)志分子之一[19]；LC3則是自噬的關(guān)鍵蛋白，分為Ⅰ型和Ⅱ型,采用蛋白印跡法測(cè)定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是一種評(píng)價(jià)自噬活性簡(jiǎn)單易行的辦法[20]，本研究首先采用免疫熒光雙標(biāo)記法標(biāo)記各組大鼠海馬beclin 1和LC3陽(yáng)性神經(jīng)元，在激光共聚焦顯微鏡下觀察beclin 1和LC3陽(yáng)性神經(jīng)元，并采用蛋白印跡法檢測(cè)beclin 1 蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，結(jié)果顯示PTSD大鼠beclin 1、LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多，海馬beclin 1 蛋白水平顯著增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯增大，提示自噬參與了 PTSD的病理進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg1 低、高劑量組和氟西汀組大鼠海馬beclin 1和LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元均不斷減少，beclin 1 蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均有不同程度下降，其中，人參皂苷 Rg1 高劑量組較之 Rg1 低劑量組上述改變更為明顯。由此，可以認(rèn)為人參皂苷 Rg1是通過(guò)減緩PTSD大鼠海馬神經(jīng)元的異常自噬活動(dòng)而產(chǎn)生良好的抗PTSD作用，這為臨床用藥開(kāi)拓了廣闊前景。

綜上所述，本研究通過(guò)成功復(fù)制PTSD大鼠模型，探討人參皂苷 Rg1對(duì)PTSD大鼠行為學(xué)和海馬神經(jīng)元自噬的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人參皂苷 Rg1與陽(yáng)性藥氟西汀均具有調(diào)節(jié)大鼠PTSD樣行為作用，且二者的抗PTSD作用機(jī)制均與其抑制PTSD大鼠海馬神經(jīng)元異常自噬以及促進(jìn)海馬神經(jīng)元增殖作用有關(guān)。據(jù)此認(rèn)為，人參皂苷 Rg1對(duì)PTSD具有一定的治療作用，至于何等劑量的人參皂苷 Rg1作用最為理想以及人參皂苷 Rg1抗PTSD作用的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of ginsenoside Rg1 on behavioral changes and autophagy of hip-pocampal neurons of rats with post-traumatic stress disorder

WU Zhong-min1，2, CHENG Zheng-wen2， NI Gui-lian2, SHAO Ai-min2, CUI Rong2

(1DepartmentofAnatomy,TaizhouUniversitySchoolofMedicine,Taizhou318000,China;2DepartmentofNeurology，F(xiàn)irstPeople’sHospitalofLinhaiCity,Linhai317000,China.E-mail:Cuirong1949@163.com)

AIM: To investigate the effects of ginsenoside Rg1 on the behavioral changes and the autophagy of hippocampal neurons of the rats with post-traumatic stress disorder (PTSD). METHODS: The Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups: control group, model group, fluoxetine group, low-dose ginsenoside Rg1 group and high-dose of ginsenoside Rg1 group. The combination of single prolonged stress and foot stock was performed to induce PTSD-like animal model. The rats in fluoxetine group was administered with fluoxetine by gavage at dose of 10 mg/kg for 21 d, while the rats in low and high doses of ginsenoside Rg1 groups were administered with ginsenoside Rg1 by gavage at doses of 20 mg/kg and 40 mg/kg for 21 d， respectively. The rats in control group and model group were both given saline by gavage for 21 d. The open-field test and stiff behavior test were used to examine the behavioral changes of the rats. The morphological structure and numerical changes of the hippocampal neurons were observed by Nissl-staining method. We adopted immunofluorescence labeling to observe the beclin 1 and LC3 positive hippocampal neurons and the levels of beclin 1 and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰratio in rat hippocampus. RESULTS: Compared with control group, decreased vertical movement time and horizontal movement time in open-field test and increased rate of stiff behavior in the stiff behavior test were observed in model group. Hippocampal neurons in model group were loosely arranged with vacuole-like structures and different degrees of cell shrinkage in contrast with control group. More beclin 1 and LC3 positive cells were identified, and higher protein levels of beclin 1 and ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in model group were found as compared with control group. However, increase in movement in open-field test and decrease in stiff behavior were detected in the rats treated with low- and high-dose ginsenoside Rg1 as compared with the model rats. Meanwhile, vacuole structures, the numbers of beclin 1 and LC3 positive neurons, the protein expression of beclin 1 and LC3, and the total cell numbers were increased. Higher dose of ginsenoside Rg1 had more profound effects on these observed results. CONCLUSION: Ginsenoside Rg1 alleviates the abnormal behaviors in the PTSD rats, which might be related to the inhibition of abnormal autophagy of hippocampal neurons.

Post-traumatic stress disorder; Ginsenoside Rg1; Hippocampus; Autophagy

1000- 4718(2017)05- 0896- 06

2016- 12- 26

2017- 03- 02

浙江省公益性應(yīng)用研究計(jì)劃(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)項(xiàng)目(No. 2014C37026； No. 2017C37124)

R925; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.021

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