金絲桃苷抑制肺炎支原體肺炎模型小鼠的損傷

申冬冬， 侯江紅， 袁 飛

(河南省中醫(yī)院兒科， 河南 鄭州 450002)

金絲桃苷抑制肺炎支原體肺炎模型小鼠的損傷

申冬冬， 侯江紅△， 袁 飛

(河南省中醫(yī)院兒科， 河南 鄭州 450002)

目的： 探討金絲桃苷對肺炎支原體肺炎(MPP)小鼠的保護(hù)作用及其調(diào)控機(jī)制。方法：選取BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為對照組、模型組、金絲桃苷低劑量(12.5 mg/kg)組和金絲桃苷高劑量(50 mg/kg)組。以肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(MPFH)滴鼻造模，第2天開始治療，治療3 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HE染色檢測肺組織病理改變；全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中C-反應(yīng)蛋白(CRP)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和心肌型肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，檢測肺組織中活性氧簇(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平；ELISA和Western blot方法分別檢測血清和肺組織中白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-18和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平；RT-qPCR和Western blot方法檢測NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，模型組小鼠的肺組織中出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、肺泡間質(zhì)增寬等病理變化；CRP、ALT、AST、LDH和CK-MB水平顯著上調(diào)(P<0.05)；ROS水平顯著上升，而SOD和GSH水平顯著下降(P<0.05)；IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平顯著上調(diào)(P<0.05)；NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達(dá)也顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，金絲桃苷組中的上述癥狀明顯減輕，且高劑量比低劑量組的緩解效果更明顯。結(jié)論：金絲桃苷能夠抑制MPP小鼠的損傷，這可能與其抑制氧化應(yīng)激和NLRP3炎性體的激活有關(guān)。

金絲桃苷； 肺炎支原體肺炎； 炎癥； 氧化應(yīng)激； 炎性體

肺炎支原體肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)是由肺炎支原體(Mycoplasmapneumo-niae，MP)引起的肺部急性炎癥病變，是常見的兒童肺炎之一，占20%左右，近年來其臨床發(fā)病率有明顯增高的趨勢[1]。小兒MPP是一種傳染性疾病，主要通過呼吸道傳染，通過血液流經(jīng)全身，傳染性很強(qiáng)，在人多的地方傳染率高達(dá)50%。其臨床癥狀多樣，除呼吸系統(tǒng)外，還可引起腦炎、腎炎、心肌炎、免疫性溶血性貧血等多種疾病，常會導(dǎo)致多系統(tǒng)功能障礙，甚至引起患者死亡[2-3]。金絲桃苷(hyperoside，Hyp)，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種天然的黃酮醇苷類化合物，存在于金絲桃科、薔薇科、桔?？?、唇形科等多種植物的果實(shí)及全草中，具有抗氧化[4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6]等多種藥理學(xué)活性，對心肌缺血、肝損傷、胃損傷等多種疾病[7-9]有一定的治療效果，但Hyp對于MPP肺炎損傷的作用未見相關(guān)報(bào)道，因此，本研究用MP誘導(dǎo)MPP模型小鼠，觀察Hyp對模型小鼠肺損傷的作用并進(jìn)行初步的機(jī)制探討，為臨床治療小兒MPP提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 藥品、試劑和儀器

金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購于上海源葉生物科技有限公司；肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(MPFH)購于ATCC；PPLO肉湯培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自Gibco；C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、心肌型肌酸激酶同工酶(MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等檢測試劑盒均購于由南京建成生物工程研究所；ELISA試劑盒購于上海藍(lán)基生物公司；Trizol Reagent購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq mixture 購自TaKaRa；PMSF、蛋白裂解試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜購自Millipore；抗IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α等Ⅰ抗購于Santa Cruz；抗NLRP3、ASC、caspase-1等Ⅰ抗購自Millipore；Ⅱ抗購自Pierce。

細(xì)胞培養(yǎng)箱和紫外分光光度計(jì)購自Thermo Fisher Scientific；7300實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增系統(tǒng)購自Applied Biosystem；Western blot 設(shè)備和酶聯(lián)免疫檢測儀購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 MP培養(yǎng) 將MPFH 干粉用PPLO完全培養(yǎng)液(含胎牛血清、酵母提取物、酚紅、青霉素等)充分混勻，培養(yǎng)于37 ℃生化培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)液由紅變橙黃時(shí)傳代。將處于對數(shù)生長期的 MP，CCU 定量，常規(guī)凍存，待用時(shí)用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液調(diào)至所需濃度。

2.2 動(dòng)物分組和MPP小鼠模型的建立 3周齡SPF級BALB/c小鼠，雌雄各半。體重(15±1)g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對照組、模型組(MP組)、Hyp低劑量(12.5 mg/kg)組和Hyp高劑量(50 mg/kg)組，每組10只。用乙醚將小鼠輕度麻醉后，模型組和金絲桃苷治療組的小鼠鼻內(nèi)接種50 μL含有1×1010CCU/L的MP 菌液，對照組以等量生理鹽水處理，連續(xù)處理3 d。金絲桃苷治療組在MP 感染第2天后按12.5 mg/kg和50 mg/kg分別進(jìn)行金絲桃苷灌胃，連續(xù)處理4 d。正常組和感染組以等量生理鹽水灌胃。模型建立后進(jìn)行分離培養(yǎng)。各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組和對照組隔離飼養(yǎng)。

2.3 標(biāo)本采集 給藥結(jié)束第2天，取各組小鼠眼球全血，分離血清。然后將小鼠引頸處死，取肺組織，其中一部分肺組織用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行組織病理形態(tài)學(xué)檢測；另一部分用來提取總RNA和總蛋白，進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測。

2.4 HE染色 取小鼠肺組織，4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行梯度乙醇脫水，脫鈣后進(jìn)行石蠟包埋，切片。按照說明書步驟進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺部組織學(xué)變化。

2.5 全自動(dòng)生化分析儀檢測 將小鼠眼球全血以3 500 r/min離心 10 min，取上清液，即為血清。根據(jù)檢測試劑盒說明書，用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中CRP、ALT、AST、LDH、CK-MB的水平；檢測肺部組織中SOD、ROS、GSH的水平。

2.6 ELISA檢測 ELISA 法檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。于酶標(biāo)儀上測490 nm處的吸光度(A)后，根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)的值。

2.7 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 按Trizol Reagent的使用說明書，提取各組小鼠肺部組織的總RNA。紫外分光光度計(jì)測定 RNA 濃度和純度，用 1% 的變性瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證 RNA 的完整性。取總 RNA 2 μg，利用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作參照產(chǎn)品說明。使用 7300 實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL，包括10 μL 2×的SYBR Premix Ex Taq mixture，0.2 μmol/L 的引物，2 μL cDNA 和RNA-free ddH2O。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min; 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。以β-actin 為內(nèi)參照，每個(gè)樣品做3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 取肺部組織進(jìn)行研磨，采用蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒法測定蛋白樣品濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上樣量，然后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5% BSA于37 ℃搖床封閉1 h。隨后進(jìn)行I 抗孵育，包括兔源IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)、IL-18(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)、NLRP3(1∶500)、ASC(1∶500)、caspase-1(1∶500)和山羊源GAPDH(1∶1 000)等，4 ℃孵育過夜，漂洗3次(每次5 min)。再將PVDF膜轉(zhuǎn)入相應(yīng)的山羊抗兔或驢抗山羊Ⅱ抗(1∶10 000)中室溫孵育1 h，漂洗4次(每次5 min)。經(jīng)Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描，目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值反映蛋白的表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺部組織的病理學(xué)檢測

從HE染色的結(jié)果可以看出，對照組肺泡結(jié)構(gòu)均勻清晰，肺泡內(nèi)無滲出，無炎癥反應(yīng)；MP感染小鼠肺泡間質(zhì)增寬，肺泡出現(xiàn)大量的滲出物，有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤;相較于MP感染組，Hyp治療組的間質(zhì)性炎癥反應(yīng)明顯減輕，淋巴和巨噬細(xì)胞浸潤減少，且50 mg/kg比12.5 mg/kg劑量的效果更加明顯，見圖1。

Figure 1.The effects of Hyp on the lung tissue structure of MPP mice. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMP group.

圖1 Hyp對MPP模型小鼠肺部組織結(jié)構(gòu)的影響

2 血清生化指標(biāo)檢測

如表1所示，模型組小鼠血清中CRP、ALT、AST、CK-MB和LDH水平明顯高于對照組(P<0.05)，各劑量Hyp藥物保護(hù)組與模型組相比，血清中CRP、ALT、AST、CK-MB和LDH水平顯著降低(P<0.05)，且Hyp劑量越高，降低效果越明顯。

表1 Hyp對MPP模型小鼠血清中CRP、ALT、AST、CK-MB和LDH水平的影響

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMP group.

3 炎癥因子檢測

用ELISA方法檢測MPP小鼠血清中炎癥因子的水平，結(jié)果如表2所示，與對照組相比，模型組中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Hyp藥物組中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。我們進(jìn)一步用Western blot方法檢測肺部組織中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Hyp藥物組中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的蛋白表達(dá)顯著降低，見圖2。

表2 Hyp對MPP模型小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平的影響

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsMP group.

Figure 2.The effects of Hyp on the protein levels of IL-1β, IL-6, IL-18 and TNF-α in the lung tissues of MPP mice.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMP group.

圖2 Hyp對MPP模型小鼠肺部組織中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α蛋白水平的影響

4 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

如表3所示，與對照組相比，模型組小鼠肺部組織中ROS水平顯著升高，SOD和GSH水平顯著降低(P<0.05);各劑量Hyp藥物保護(hù)組與模型組相比，ROS水平顯著降低，SOD和GSH的水平顯著升高(P<0.05)，且Hyp劑量越高，效果越明顯。

表3 Hyp對MPP模型小鼠肺部組織中SOD、GSH和ROS水平的影響

Table 3.The effects of Hyp on the levels of SOD, GSH and ROS in the lung tissues of MPP mice (Mean±SD.n=3)

GroupROS(U/mg)SOD(U/mg)GSH(nmol/mg)Control321.3±37.616.7±4.365.4±13.2MP580.3±63.2*8.2±2.3*32.1±7.5*Hyp(12.5mg/kg)502.6±47.7#12.6±3.7#48.3±7.8#Hyp(50mg/kg)453.1±53.5#15.2±4.5#57.8±8.3#

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsMP group.

5 NLRP3炎性體檢測

通過RT-qPCR和Western blot檢測了NLRP3、接頭蛋白ASC和caspase-1的表達(dá)水平差異。RT-qPCR和Western blot結(jié)果一致，與對照組相比，NLRP3、ASC和caspase-1在模型組中的表達(dá)水平上調(diào)，差異顯著(P<0.05)。與模型組相比，Hyp藥物處理顯著下調(diào)NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá)(P<0.05)，且Hyp濃度越高，下調(diào)效果越顯著，見圖3。

討 論

MP為一類無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，大小介于細(xì)菌和病毒之間的原核微生物，是兒童呼吸道感染最常見的病原體之一，學(xué)齡期前后的兒童中多見因MP感染而引起的MPP[10]。隨著對其發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)MPP患兒不僅表現(xiàn)出嚴(yán)重的肺部病變，全身多臟器多系統(tǒng)也受到損害，所以MP感染與兒童健康保健有著密切關(guān)系。當(dāng)前國內(nèi)外臨床對小兒MPP的治療首選大環(huán)內(nèi)酯類藥物，近年來發(fā)現(xiàn)MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有耐藥性，臨床上治療MP感染仍有很大的困難。為此，有效治療MP感染引起的MPP已成為各國學(xué)者致力研究的重點(diǎn)，其中中醫(yī)藥治療受到越來越多的關(guān)注。中醫(yī)藥對MPP的治療機(jī)理包括抑制肺炎支原體、調(diào)節(jié)免疫、改善微循環(huán)等方面，黃芩、麻黃和丹參等傳統(tǒng)中藥材因?yàn)槠淇寡?、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能而應(yīng)用于MPP的治療[11]。Hyp因其抗氧化、抗炎作用在中醫(yī)藥研究中備受青睞，我們猜測Hyp能夠抑制MPP模型小鼠損傷。本實(shí)驗(yàn)通過MP誘導(dǎo)小鼠MPP模型來研究 Hyp 對MPP損傷的作用。

Figure 3.The effects of Hyp on the levels of NLRP3, ASC and caspase-1 in the lung tissues of MPP mice. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMP group.

圖3 Hyp對MPP模型小鼠肺部組織中NLRP3、ASC和caspase-1表達(dá)的影響

CRP是一種急性時(shí)相蛋白，因其不受性別、年齡、貧血等因素的影響，優(yōu)于其它急性期反應(yīng)物質(zhì)。臨床檢測CRP的動(dòng)態(tài)變化對判斷MPP病情嚴(yán)重程度及治療效果有重要意義。MP感染患兒由于呼吸功能障礙而引發(fā)心肌缺氧性損傷[12]，治療期間應(yīng)注意監(jiān)測ALT、AST、CK-MB、LDH等生化指標(biāo)，預(yù)防嚴(yán)重心肌損害的發(fā)生，對改善患兒預(yù)后具有非常重要的意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MPP模型小鼠血清中CRP、ALT、AST、CK-MB和LDH水平均明顯升高，且肺部存在明顯的病理學(xué)改變，表明MP感染可導(dǎo)致小鼠肺部結(jié)構(gòu)和功能損傷，并提示MPP小鼠造模成功。而Hyp能明顯降低MPP小鼠血清中CRP、ALT、AST、CK-MB和LDH水平，減輕肺部組織炎癥細(xì)胞浸潤和壞死程度，提示Hyp 能夠減輕MP誘導(dǎo)的肺炎損傷。

目前研究表明，MP作為致病原可激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機(jī)體釋放各種細(xì)胞因子，保護(hù)機(jī)體抵抗病原體的侵蝕，但過量的細(xì)胞因子對機(jī)體有害，引發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。MP感染可誘發(fā)IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，作為最重要的炎癥介導(dǎo)因子，IL-1β和TNF-α不僅能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)，還能夠刺激其它炎癥因子的釋放，例如IL-6[14]。IL-6作為促炎癥細(xì)胞因子，是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。有研究表明，IL-6水平與小兒社區(qū)獲得性肺炎嚴(yán)重程度高度相關(guān)，肺炎越嚴(yán)重則IL-6水平越高[15]。IL-18是多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，由活化的單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，MPP模型小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α濃度均明顯高于對照組，而在Hyp藥物組血清中顯著下調(diào)，說明Hyp能夠抑制MP感染誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

氧化應(yīng)激廣泛存在于機(jī)體，發(fā)揮著重要的生理功能。一旦受到病原體感染等不良剌激，氧化-抗氧化動(dòng)態(tài)平衡被打破，“過?！钡淖杂苫纯梢宰陨淼姆肿?、細(xì)胞等組分為靶細(xì)胞，對自身造成氧化損傷。有研究表明，肺炎支原體吸附在細(xì)胞膜表面后可伸出微管插入細(xì)胞內(nèi)并釋放過氧化氫和超氧游離基，氧化應(yīng)激引起的肺損傷與MPP的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系[16]，所以我們進(jìn)一步評估了小鼠肺部的氧化應(yīng)激程度。ROS是生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、一氧化氮等活性含氧化合物的總稱。SOD和GSH是清除氧自由基的重要組分，是機(jī)體抗自由基損傷的重要防御機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPP小鼠中 ROS 水平升高，而SOD和GSH水平降低。而Hyp 可明顯下調(diào)MPP小鼠ROS水平，上調(diào)SOD和GSH水平，表明 Hyp可能是通過清除自由基，增強(qiáng)抗過氧化能力而減輕MP感染引起的氧化損傷。Xing等[17]研究報(bào)道, Hyp在人肝細(xì)胞系L02中能夠通過激活Nrf2-ARE信號通路來減輕H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷，而Nrf2-ARE信號通路的激活與Hyp調(diào)控p38/ERK/PI3K介導(dǎo)的GSK-3β磷酸化、調(diào)控Keap1 的表達(dá)以及調(diào)控microRNAs等作用有關(guān)，提示我們Hyp在MPP模型小鼠中可能是通過調(diào)控Nrf2-ARE信號通路發(fā)揮抗氧化損傷功能。

NLRP3炎性體是由NLRP3、ASC及caspase-1前體組成的一類大分子多蛋白復(fù)合體，屬于NOD 樣受體家族成員，是機(jī)體胞漿中重要的模式識別受體。NLRP3可識別機(jī)體自身危險(xiǎn)信號及細(xì)菌等外源性危險(xiǎn)信號，當(dāng)其被激活后，通過接頭蛋白ASC招募caspase-1前體，使其水解，產(chǎn)生p20和p10大小亞基，形成p20/p10異二聚體，再形成4聚體，即有活性的caspase-1，進(jìn)而對IL-1β、IL-18等前體進(jìn)行剪切，促進(jìn)有生物活性的IL-1β和IL-18釋放至細(xì)胞外，參與炎癥反應(yīng)[18]。Bose 等[19]研究發(fā)現(xiàn)MP的CARDS毒素能夠和NLRP3分子進(jìn)行反應(yīng)，促進(jìn)NLRP3炎性體的形成，激活一系列的炎癥反應(yīng)。也有研究表明，ROS參與MP激活NLRP3炎性體的過程[20]，所以我們進(jìn)一步檢測了NLRP3炎性體的激活水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MP感染可顯著升高NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá)水平，而Hyp處理后，NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá)水平顯著降低，說明Hyp能夠抑制MP誘導(dǎo)的NLRP3炎性體的激活。

綜上所述，Hyp可抑制MP誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷，發(fā)揮抗炎、抗氧化的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除自由基、抑制NLRP3炎性體的激活有關(guān)。本研究為小兒MPP的發(fā)病機(jī)制研究和藥物治療提供了新的思路。但是，Hyp的抗氧化作用是否與Nrf2-ARE信號通路的激活有關(guān)，Nrf2-ARE信號通路與NLRP3炎性體的激活是否相關(guān)以及Hyp抑制肺炎損傷的其它分子機(jī)制，均需要進(jìn)一步探討。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Hyperoside suppresses injury inMycoplasmapneumoniaepneumonia mice

SHEN Dong-dong, HOU Jiang-hong, YUAN Fei

(DepartmentofPediatrics,HenanProvinceHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450002,China.E-mail:shiguirongtcm@163.com)

AIM: To investigate the protective effect of hyperoside (Hyp) onMycoplasmapneumoniae(MP) pneumonia (MPP) mice and the underlying regulatory mechanism. METHODS: BALB/c mice (n=40) were randomly divided into control group, model group, low-dose (12.5 mg/kg) Hyp group and high-dose (50 mg/kg) Hyp group. The MPP model was established using MP standard strains (MPFH) through nasal dripping. The treatment started on the second day, and the follow-up experiments were performed after 3 d. The lung histopathology were detected by HE staining. The levels of C-reactive protein (CRP), alanine aminotransferase (ALT), aspartate transaminase (AST), lactate dehydrogenase (LDH) and MB isoenzyme of creatine kinase (CK-MB) in the serum, and the levels of reactive oxygen species (ROS), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) in the lung tissues were measured by automatic biochemical analyzer. ELISA and Western blot were used to detect interleukine-1 beta (IL-1β), IL-6, IL-18 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) levels in the serum and lung tissues, respectively. The expression of NLRP3, ASC and caspase-1 at mRNA and protein levels was evaluated by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: Compared with control group, the inflammation and alveolar interstitial widening were observed in the lung tissues of model mice, and the CRP, ALT, AST, LDH and CK-MB levels were significantly up-regulated (P<0.05). The ROS level was increased, while SOD and GSH levels were significantly decreased (P<0.05). The levels of IL-1β, IL-6, IL-18 and TNF-α were markedly up-regulated (P<0.05). The protein expression of NLRP3, ASC and caspase-1 was also obviously increased (P<0.05) in model group. Compared with model group, the symptoms above were significantly relieved in Hyp group, and the effect of high-dose Hyp was more apparent than that of the low-dose one. CONCLUSION: Hyperoside suppresses the injury in MPP mice, which may be related to the inhibition of oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation.

Hyperoside;Mycoplasmapneumoniaepneumonia; Inflammation; Oxidative stress; Inflammasomes

1000- 4718(2017)05- 0884- 06

2016- 08- 22

2017- 02- 20

R725.6； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.019

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△通訊作者 Tel： 0371-60905533； E-mail: shiguirongtcm@163.com