miR-23a和ESRP1在直腸癌中的作用*

勞玲娟， 宋新江， 徐 佳

(1紹興第二醫(yī)院肛腸外科， 浙江 紹興 312000； 2岳陽市一人民醫(yī)院胃腸外科，湖南 岳陽 414000)

miR-23a和ESRP1在直腸癌中的作用*

勞玲娟1， 宋新江1， 徐 佳2

(1紹興第二醫(yī)院肛腸外科， 浙江 紹興 312000；2岳陽市一人民醫(yī)院胃腸外科，湖南 岳陽 414000)

目的： 研究miR-23a和上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1(epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1)在直腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)，以及對(duì)體外直腸癌細(xì)胞活力和凋亡的作用。方法: 采用RT-qPCR分析miR-23a在36例直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，免疫組化檢測ESRP1在直腸癌組織中的表達(dá)，分析miR-23a和ESRPl在直腸癌組織中的相關(guān)性；利用RT-qPCR檢測miR-23a在直腸癌Caco-2和SW480細(xì)胞及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460中的表達(dá)；合成miR-23a inhibitor和inhibitor 陰性對(duì)照 (inhibitor NC)，并將其分別轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞后，通過CCK-8法檢測miR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲；通過Western blot技術(shù)檢測SW480細(xì)胞中ESRPl蛋白的表達(dá)；構(gòu)建野生型pGL3-ESRP1-3’UTR(wt-pGL3-ESRP1-3’UTR)或突變型pGL3-ESRP1-3’UTR(mut-pGL3-ESRP1-3’UTR)質(zhì)粒，并分別與miR-23a inhibitor或inhibitor NC共轉(zhuǎn)染至HEK293和SW480細(xì)胞中，利用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明檢測雙螢光素酶活性；將ESRP1 mimic或mimic NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞活力和凋亡；Western blot法檢測瞬轉(zhuǎn)ESRP1 mimic后對(duì)ESRP1、caspase-3、Smac和XIAP蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果: miR-23a和ESRP1在直腸癌組織的表達(dá)較癌旁正常組織分別上調(diào)和下調(diào)，兩者呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01)；miR-23a的表達(dá)與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤深度相關(guān)；與NCM460細(xì)胞相比較，miR-23a在SW480細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor后，SW480細(xì)胞活力較inhibitor NC組顯著下降(P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor后SW480細(xì)胞早期凋亡率明顯升高，同時(shí)細(xì)胞體外侵襲能力受到抑制；螢光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明ESRP1是miR-23a的直接靶基因；轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor至SW480細(xì)胞后ESRP1蛋白表達(dá)水平明顯升高；ESRP1 mimic轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后可抑制細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)caspase-3和Smac的表達(dá)，下調(diào)XIAP的表達(dá)。結(jié)論: miR-23a可通過負(fù)向調(diào)控下游靶基因ESRP1從而影響直腸癌細(xì)胞生長和凋亡。

直腸癌； miR-23a； 上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1； 細(xì)胞凋亡

近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)作為一組高度保守的單鏈非編碼小RNA，能夠與其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)mRNA發(fā)生不完全結(jié)合，從而調(diào)控靶向調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯[1-2]。近年來的研究證實(shí)，miRNA在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)或低表達(dá)能夠起到癌基因或抑癌基因的作用，并調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的多種惡性生物學(xué)行為，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3]。miRNA-23a (miR-23a)是位于染色體19p13.12上的miR-23a/24/27a家族成員。近年來報(bào)道稱miR-23a不僅調(diào)控正常細(xì)胞生長和分化，同時(shí)與多種惡性腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切[4-6]。但miR-23a在直腸癌中的表達(dá)和作用尚不明確，仍待進(jìn)一步研究。為此，本次研究擬分析miR-23a和上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1(epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1)在直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)一步研究兩者在直腸癌組織中的聯(lián)系及其對(duì)體外直腸癌細(xì)胞生長和凋亡的影響，探討miR-23a對(duì)直腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)意義。

材 料 和 方 法

1 組織標(biāo)本

收集2014年5月～ 2015年5月間在岳陽市一人民醫(yī)院胃腸外科經(jīng)手術(shù)切除的36例新鮮直腸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，男性患者共有25例，女性患者共有11例，年齡在36.5歲～72.3歲之間，平均年齡為(61.4±4.3)歲。所有納入本次隊(duì)列的患者均經(jīng)過兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科專家分別確診為直腸腺癌，且所有患者均未接受新輔助治療。其它排除標(biāo)準(zhǔn)包括下咽困難、急慢性感染、充血性心力衰竭、COPD和肝硬化。

2 試劑

Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco； Trizol試劑和Lipofectamine 2000購自Invitrogen；miR-23a inhibitor及相應(yīng)的inhibitor陰性對(duì)照(negative control，NC)siRNA序列(inihibitor NC)購自GenePharma；miRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR 試劑盒和細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自TaKaRa；CCK-8試劑盒和Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；抗ESRP1、caspase-3、Smac和X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)和β-actin抗體購自Epitomics；野生型pGL3-ESRP1-3’UTR (wt-pGL3-ESRP1-3’UTR)或突變型pGL3-ESRP1-3’UTR (mut-pGL3-ESRP1-3’UTR)質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒及雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Promega；ESRP1 mimic及mimic陰性對(duì)照(mimic negative control siRNA,mimic NC)購自銳博生物。

3 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人胚腎細(xì)胞株HEK-293、人直腸癌高分化腺癌細(xì)胞株Caco-2、人直腸癌低分化腺癌細(xì)胞株SW480及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460均由上海細(xì)胞生物研究所提供。細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補(bǔ)充10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(0.1 g/L)。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至占培養(yǎng)瓶底面積90%以上時(shí)用胰蛋白酶消化并用于實(shí)驗(yàn)。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 miRNA的提取及檢測 miRNA的提取實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照miRNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行。miR-23a的上游引物序列為5’-CCAGATCAGGCATCCTATTTG-3’，下游引物序列為5’-TATCATTGTCGAATTCCAGTGT-3’；內(nèi)參照U6的上游引物序列為5’-GCTTCGCCAATTTGGGGTTG-3’，下游引物序列為5’-GTTGGTTCTGAGCGGTATCA-3’。依照PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒說明書步驟將cDNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成。對(duì)miRNA進(jìn)行定量分析檢測步驟為：95 ℃ 2 min； 95 ℃ 45 s， 60 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本檢測3次。通過2-ΔΔCt的方法計(jì)算miR-23a的相對(duì)表達(dá)差異倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.2 免疫組織化學(xué)法檢測ESRP1的表達(dá) 所有直腸癌和癌旁正常組織標(biāo)本均使用4%的多聚甲醛固定、梯度濃度乙醇脫水、石蠟包埋及切片后，按照SP染色法進(jìn)行免疫組化染色，使用PBS代替 I 抗作為陰性對(duì)照。切片的免疫組化: 烘片、脫蠟與水化、封閉、加 I 抗、加 II 抗、DAB 顯色、鏡檢。ESRP1染色陽性表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)，在低倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野并拍照，后期使用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件分析ESRP1在標(biāo)本中的陽性表達(dá)程度。

4.3 將miR-23a inhibitor、inhibitor NC、ESRP1 mimic及mimic NC轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞 將對(duì)數(shù)生長期的SW480細(xì)胞接種于24孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，將5 μL濃度為20 μmol/L的miR-23a inhibitor與5 μL轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000混勻后加入細(xì)胞中，miR-23a inhibitor的轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后進(jìn)行相關(guān)功能性、RT-qPCR和Western blot等檢測。Inhibitor NC、ESRP1 mimic及mimic NC的轉(zhuǎn)染方法同miR-23a inhibitor的轉(zhuǎn)染。

4.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將SW480細(xì)胞以每孔5×103個(gè)播種至96孔板中。在每個(gè)培養(yǎng)孔中添加完全培養(yǎng)基至100 μL，并將細(xì)胞放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中至細(xì)胞融合，每孔添加CCK-8溶液0.01 mL反應(yīng)1 h，用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處吸光度(A490)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測SW480細(xì)胞凋亡 SW480細(xì)胞被冰PBS緩沖液洗滌3次后使用胰酶消化。加入2.5 μL Annexin V試劑和50 μL結(jié)合緩沖液在室溫下黑暗中反應(yīng)15 min，隨后添加5 μL碘化丙啶和50 μL結(jié)合緩沖液在室溫下黑暗中孵育5 min。細(xì)胞懸浮在Annexin V試劑，細(xì)胞濃度為1×109～1×1010/L，所有樣品使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

4.6 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長期SW480細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/L，將300 μL細(xì)胞懸液和300 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基分別加入Transwell上室和下室，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入結(jié)晶紫染色液染色20 min，在倒置顯微鏡下觀察穿過小室的藍(lán)染細(xì)胞，在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)算平均值，每組重復(fù)3次。

4.7 Western blot檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá) SW480細(xì)胞在冰冷的PBS液中洗滌3次后重懸于細(xì)胞裂解液(每孔100 μL)中。將裂解的細(xì)胞置于冰上反應(yīng)30 min，再在4 ℃、12 000×g離心20 min，收集上清后使用BCA蛋白檢測試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)樣品(30 μg)使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的硝酸纖維素膜上，并使用5%脫脂奶粉于4℃下孵育過夜，該膜在4 ℃與 I 抗在室溫下反應(yīng)30 min后，在室溫下與 II 抗再次孵育1 h。以內(nèi)參照β-actin蛋白條帶灰度值來校正目的蛋白的灰度值。

4.8 螢光素酶報(bào)告基因檢測 將wt-pGL3-ESRP1-3’UTR或mut-pGL3-ESRP1-3’UTR質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293和SW480細(xì)胞中，再分別將等量的miR-23a inhibitor或inhibitor NC再轉(zhuǎn)染至HEK293和SW480細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒制造商的要求對(duì)雙螢光素酶活性進(jìn)行分析檢測。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用t檢驗(yàn)比較2組數(shù)據(jù)間的差異，運(yùn)用方差分析法對(duì)3組數(shù)據(jù)間的差異進(jìn)行分析，運(yùn)用2檢驗(yàn)對(duì)臨床病理學(xué)特征數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-23a和ESRP1在直腸癌組織中的表達(dá)

RP-qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-23a在88.9%(32/36)的直腸癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，與癌旁正常組織相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1A。同時(shí)對(duì)miR-23a與36例直腸癌患者臨床病理學(xué)特征進(jìn)行分析可知，在36例直腸癌組織標(biāo)本中，miR-23a在浸潤漿膜層組織中的表達(dá)顯著高于未浸潤漿膜層組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中miR-23a的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但直腸癌組織中miR-23a的表達(dá)水平與患者性別、年齡和分化程度無明顯相關(guān)性，見表1。利用免疫組化檢測ESRP1蛋白在36例直腸癌及癌旁正常組織標(biāo)本中的表達(dá)可知，ESRP1在直腸癌組織中的表達(dá)較正常直腸組織明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1B、C；對(duì)miR-23和ESRP1在直腸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析可知，miR-23和ESRP1在直腸癌組織中表達(dá)的Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.794，呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01)，見圖1D。

Figure 1.Expression of miR-23a and ESRP1 in human rectal cancer tissues.A： relative miR-23a expression was increased in human rectal cancer tissues compared with the matched adjacent noncancerous tissues； B： representative images showed that immunostaining with the antibody to recognize ESRP1 in the noncancerous and cancer tissues； C： the relative level of ESRP1 was down-regulated in human rectal cancer tissues compared with the matched adjacent noncancerous tissues； D: an inversely correlation between miR-23a and ESRP1 expression in human rectal cancer tissues was observed. Mean±SD.n=36.**P<0.01vsnormal tissue.

圖1 miR-23a 和ESRP1在人直腸癌組織中的表達(dá)

表1 miR-23a與36例直腸癌患者臨床病理因素的關(guān)系

2 miR-23a對(duì)體外直腸癌細(xì)胞活力、凋亡和侵襲的影響

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明，miR-23a在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460中的表達(dá)量較低，而在人直腸癌細(xì)胞系Caco-2 和SW480中表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)與Caco-2細(xì)胞相比，SW480細(xì)胞中miR-23a表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，見圖2A。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SW480細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

將miR-23a inhibitor或inhibitor NC轉(zhuǎn)染進(jìn)入SW480細(xì)胞48 h后，RT-qPCR結(jié)果表明miR-23a的相對(duì)表達(dá)量分別較對(duì)照組上升(15.25±2.21)%和下降(75.53±11.38)%，轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor可顯著下調(diào)miR-23a在SW480細(xì)胞中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染inhibitor NC對(duì)miR-23a的相對(duì)表達(dá)量無明顯影響，見圖2B。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染inhibitor NC后48 h，細(xì)胞的吸光度與對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor后SW480細(xì)胞的吸光度較inhibitor NC組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖2C。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明，SW480細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor或inhibitor NC 48 h后細(xì)胞早期凋亡率分別為(14.5±2.1)%和(3.8±0.5)%，與對(duì)照組細(xì)胞[(2.4±0.4)%]相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2D。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明，SW480細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor后可顯著抑制細(xì)胞侵襲行為，SW480細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor或inhibitor NC 48 h后侵襲出Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為14.6±2.5和85.8±11.3，與對(duì)照組細(xì)胞(94.6±12.7)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01),見圖2E。

3ESRP1是miR-23a的直接靶基因

通過miRNA預(yù)測軟件TargetScan進(jìn)行分析可知，miR-23a與ESRP1的3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，推測ESRP1可能是miR-23a的靶向調(diào)控基因(圖3A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-23a與ESRP1 3’UTR是否能直接結(jié)合，我們構(gòu)建wt-pGL3-ESRP1-3’UTR或mut-pGL3-ESRP1-3’UTR質(zhì)粒，再分別與miR-23a inhibitor或inhibitor NC共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞和SW480細(xì)胞中。結(jié)果表明野生型ESRP1 3’UTR質(zhì)粒和miR-23a inhibitor共轉(zhuǎn)染后的螢光素酶活性較野生型ESRP1 3’UTR質(zhì)粒和inhibitor NC共轉(zhuǎn)染后的螢光素酶活性明顯升高(P<0.01)。而突變型ESRP1 3’UTR質(zhì)粒和miR-23a共轉(zhuǎn)染組與突變型ESRP1 3’UTR質(zhì)粒和inhibitor NC共轉(zhuǎn)染組的螢光素酶活性相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，從而表明ESRP1是miR-23a的直接靶向基因(圖3B)。另外，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞后可顯著上調(diào)ESRP1蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染inhibitor NC至SW480細(xì)胞后對(duì)ESRP1蛋白的表達(dá)無顯著影響(圖3C)。

通過轉(zhuǎn)染ESRP1 mimic至SW480細(xì)胞中，我們觀察到ESRP1 mimic可明顯上調(diào)ESRP1蛋白在SW480細(xì)胞中的表達(dá)，見圖4；同時(shí)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mimic NC組細(xì)胞的吸光度與對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而ESRP1 mimic組細(xì)胞的吸光度較mimic NC組低(56.21±8.23)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3D；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與mimic NC組相比較，轉(zhuǎn)染ESRP1 mimic可明顯增加SW480細(xì)胞的凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3E。

4 ESRP1負(fù)向調(diào)控XIAP在SW480細(xì)胞中的表達(dá)

如圖4所示，Western blot檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染mimic NC對(duì)SW480細(xì)胞中caspase-3、Smac和XIAP蛋白的表達(dá)無明顯影響，但轉(zhuǎn)染ESRP1 mimic可明顯上調(diào)caspase-3和Smac蛋白在SW480細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)抑制XIAP蛋白的表達(dá)，與mimic NC組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。

討 論

miRNAs在惡性腫瘤的起源和發(fā)展過程中扮演著重要角色。miRNAs的表達(dá)水平在不同組織來源的腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系中有較大區(qū)別。miRNAs在腫瘤中發(fā)揮癌基因還是抑癌基因的作用取決于其下游靶向 mRNA的表達(dá)。經(jīng)過近幾十年來對(duì)miRNAs與惡性腫瘤關(guān)系的研究，當(dāng)前應(yīng)用miRNAs用于直腸癌的治療引起胃腸外科研究人員的關(guān)注。通過基因芯片定量對(duì)結(jié)直腸癌組織中數(shù)百種miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明有24種miRNAs在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平異常[7]。沉默miR-6734可延緩結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，降低其惡性侵襲性行為，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。另外有報(bào)道稱miR-200家族可通過下調(diào)Notch通路從而在調(diào)控結(jié)直腸癌增殖和凋亡中發(fā)揮了重要作用[9]。近期研究發(fā)現(xiàn)miR-23a在結(jié)腸癌組織中表達(dá)較正常結(jié)腸組織中表達(dá)明顯上調(diào)[10]，但其作用機(jī)制尚不明確。

Figure 2.Effects of miR-23a on the viability， apoptosis and invasion of human rectal cancer cells. A: the expression of miR-23a was significantly higher in the malignant Caco-2 cells and SW480 cells than that in the normal human colonic epithelial cells by RT-qPCR； B: decreased miR-23a level in the SW480 cells was detected by RT-qPCR; C: the rectal cancer SW480 cells were transfected with miR-23a inhibitor or inhibitor NC for 48 h, and the cell viability was measured by CCK-8 assay; D: the rectal cancer cells were processed for Annexin V/PI staining and analyzed with flow cytometry after transfected with miR-23a inhibitor or inhibitor NC for 48 h; E: the cell invasion was evaluated by Matrigel counting assay. NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCM460;△△P<0.01vsinhibitor NC.

圖2 miR-23a對(duì)直腸癌細(xì)胞活力、凋亡和侵襲的影響

Figure 3.Verification of the relationship between ESRP1 and miR-23a. A: the miR-23a binding site in the 3’-UTR of ESRP1 mRNA; B: the relative luciferase activity was measured in the SW480 cells after co-transfection of ESRP1-3’UTR-wt or ESRP1-3’UTR-mut with miR-23a inhibitor or inhibitor NC; C: the protein level of ESRP1 in the SW480 cells transfected with miR-23a inhibitor or inhibitor NC was examined by Western blot； D， E: the SW480 cells were transfected with ESRP1 mimic to increase the expression of ESRP1， and the viability and apoptosis of the SW480 were analyzed by CCK-8 assay and flow cytometry， respectively. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vsinhibitor NC;**P<0.01vsmimic NC.

圖3 ESRP1 與 miR-23a 關(guān)系驗(yàn)證

本研究中，我們檢測了36例直腸癌組織和癌旁組織中miR-23a的表達(dá)情況，并分析其與直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果顯示，miR-23a在直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，提示miR-23a在直腸癌發(fā)生的早期階段可能充當(dāng)著癌基因的作用；同時(shí)miR-23a在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌組織中的表達(dá)水平較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌組織明顯升高，提示miR-23a在直腸癌的轉(zhuǎn)移階段又起到了癌基因的作用，從而促進(jìn)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；此外，miR-23a的表達(dá)水平隨著患者TNM分期升高而逐漸升高，表明miR-23a可能與直腸癌的惡性進(jìn)展一致；同時(shí)miR-23a在體外直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)也高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞。這種miR-23a在良、惡性組織及細(xì)胞中的表達(dá)差異表明miR-23a與直腸癌細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展可能存在一定的關(guān)聯(lián)，與文獻(xiàn)報(bào)道相仿[7]。

為進(jìn)一步研究miR-23a在直腸癌惡性生物學(xué)行為中的作用，我們通過miR-23a inhibitor下調(diào)SW480細(xì)胞中miR-23a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-23a不僅對(duì)體外SW480細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，而且可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外體外侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)SW480細(xì)胞中miR-23a的表達(dá)可顯著抑制SW480細(xì)胞體外侵襲行為，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與miR-23a和臨床病理學(xué)特征相關(guān)的結(jié)果相印證，從而進(jìn)一步表明miR-23a與直腸癌惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。既往研究表明，miR-23a在調(diào)控宮頸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤增殖和凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用[4-6]，但其精確的作用機(jī)制目前尚不十分明確。本研究通過生物信息學(xué)分析miR-23a為ESRP1潛在的上游調(diào)控因子，同時(shí)通過螢光素酶報(bào)告基因，首次在SW480細(xì)胞中驗(yàn)證了ESRP1是miR-23a的直接靶向基因。ESRP1作為一種定位于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白，可通過直接結(jié)合特異性mRNA序列，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等相關(guān)基因的表達(dá)，從而在調(diào)節(jié)惡性腫瘤的多種惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮了重要作用[11]。Yae等[12]發(fā)現(xiàn)ESRP1在結(jié)腸上皮細(xì)胞中的異常表達(dá)可上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的黏附性，從而抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的成瘤性。同時(shí)ESRP1在哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞系發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)下調(diào)，而異位表達(dá)的ESRP1則可逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變[13]。本研究發(fā)現(xiàn)ESRP1在直腸癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯減少，而ESRP1和miR-23a在直腸癌組織中的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，提示ESRP1可能與直腸癌的發(fā)生和發(fā)展存在一定聯(lián)系。同時(shí)，下調(diào)miR-23a可增加其下游靶向基因ESRP1在直腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)，有效抑制細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但miR-23a是否通過靶向調(diào)控ESRP1而在調(diào)控直腸癌細(xì)胞活力和凋亡過程中發(fā)揮了一定作用尚未可知。為此，我們通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)SW480細(xì)胞中內(nèi)源性ESRP1的表達(dá)，觀察到提升ESRP1在直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)可有效抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明miR-23a可靶向調(diào)控直腸癌細(xì)胞中ESRP1的表達(dá)，從而對(duì)直腸癌細(xì)胞生長和凋亡產(chǎn)生一定的作用。

Figure 4.Western blot analysis of ESRP1, caspase-3, Smac and XIAP protein expression after transfection with ESRP1 mimic or mi-mic NC in the SW480 cellsinvitro. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmimic NC.

圖4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染ESRP1 mimic或mimic NC對(duì)SW480細(xì)胞中ESRP1、caspase-3、Smac和XIAP蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族是caspase家族的內(nèi)源性抑制因子，利用該家族所含有的高度保守的桿狀病毒IAP序列與caspase結(jié)合而發(fā)揮凋亡抑制作用，從而顯著抑制細(xì)胞凋亡[14]。XIAP作為IAP家族中抑制凋亡作用最強(qiáng)的成員，其可通過與caspase-3的結(jié)合而使其喪失活性，從而阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生。而多種基因可負(fù)性調(diào)控XIAP抑制caspase-3活性作用過程，促凋亡蛋白Smac就是其中非常重要的一員，Smac可與凋亡抑制因子XIAP發(fā)生特異性結(jié)合，解除XIAP對(duì)caspase-3的抑制作用，從而引起活化的caspase的釋放，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[15]。既往研究表明，XIAP是miR-23a的靶向調(diào)控基因之一[16]，而ESRP1作為本次研究中發(fā)現(xiàn)的新的miR-23a靶向調(diào)控基因。ESRP1和XIAP均在調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長和凋亡中發(fā)揮了一定作用，兩者之間是否存在一定聯(lián)系？在本研究中，上調(diào)ESRP1在體外直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)可明顯抑制XIAP的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)caspase-3和Smac的表達(dá)，從而表明ESRPl可能通過調(diào)控凋亡抑制因子XIAP和促凋亡因子caspase-3和Smac的表達(dá)對(duì)體外直腸癌細(xì)胞的生長和凋亡產(chǎn)生一定的影響。

綜上所述，本研究表明miR-23a可負(fù)向調(diào)控ESRP1的表達(dá)從而影響體外直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡，但miR-23a是否對(duì)體內(nèi)直腸癌同樣具有調(diào)節(jié)增殖和凋亡能力尚未可知，同時(shí)雖然證實(shí)ESRPl與XIAP在體外直腸癌細(xì)胞中存在一定聯(lián)系，但ESRP1與XIAP之間是直接調(diào)控還是間接調(diào)控仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。但本次研究為臨床直腸癌基因治療提供一個(gè)新的作用靶點(diǎn)，在揭示直腸癌的發(fā)病機(jī)制及治療上具有一定積極意義。

[1] 廖紫薇， 鄧紅霞， 張國平， 等. 致癌性微小RNA-106a對(duì)正常胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞生長的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(10):1885-1889.

[2] 肖勝軍， 曾思恩， 方 宇， 等. LMP1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE1癌基因微小RNA表達(dá)譜的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(4): 705-708.

[3] 蔣 振， 郭俊明， 肖丙秀. 特異性微小RNA抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(9):1726-1730.

[4] Yang Z, Wang XL, Bai R, et al. miR-23a promotes IKKα expression but suppresses ST7L expression to contribute to the malignancy of epithelial ovarian cancer cells[J]. Br J Cancer, 2016, 115(6):731-740.

[5] Aghaee-Bakhtiari SH, Arefian E, Naderi M, et al. MAPK and JAK/STAT pathways targeted by miR-23a and miR-23b in prostate cancer: computational andinvitroapproaches [J]. Tumour Biol, 2015, 36(6):4203-4212.

[6] Wen YC, Lee WJ, Tan P, et al. By inhibiting snail signaling and miR-23a-3p, osthole suppresses the EMT-mediated metastatic ability in prostate cancer [J]. Oncotarget, 2015, 6(25):21120-21136.

[7] Tanaka R, Tomosugi M, Sakai T, et al. MEK inhibitor suppresses expression of the miR-17-92 cluster with G1-phase arrest in HT-29 humancolon cancer cells and MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells[J]. Anticancer Res, 2016, 36(9):4537-4543.

[8] Kang MR, Park KH, Yang JO, et al. miR-6734 up-regulates p21 gene expression and induces cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells[J]. PLoS One, 2016, 11(8):e0160961.

[9] Suliman MA, Zhang Z, Na H, et al. Niclosamide inhibits colon cancer progression through downregulation of the Notch pathway and upregulation of the tumor suppressor miR-200 family[J]. Int J Mol Med, 2016, 38(3):776-784.

[10] 唐海林， 鄧 敏， 廖前進(jìn)， 等. miR-23a與轉(zhuǎn)移抑制因子1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2012, 41(1):28-32.

[11] Kikuchi M, Yamashita K, Waraya M, et al. Epigenetic regulation of ZEB1-RAB25/ESRP1 axis plays a critical role in phenylbutyrate treatment-resistant breast cancer [J]. Oncotarget, 2016, 7(2):1741-1753.

[12] Yae T, Tsuchihashi K, Ishimoto T, et al. Alternative splicing of CD44 mRNA by ESRP1 enhances lung colonization of metastatic cancer cell[J]. Nat Commun, 2012, 3:883.

[13] Ishii H, Saitoh M, Sakamoto K, et al. Epithelial splicing regulatory proteins 1 (ESRP1) and 2 (ESRP2) suppress cancer cell motility via different mechanisms[J]. J Biol Chem, 2014, 289(40):27386-27399.

[14] Zhou S, Huang Q, Zheng S, et al. miR-27a regulates the sensitivity of breast cancer cells to cisplatin treatment via BAK-SMAC/DIABLO-XIAP axis[J]. Tumour Biol, 2016, 37(5):6837-6845.

[15] Welsh K, Milutinovic S, Ardecky RJ, et al. Characterization of potent SMAC mimetics that sensitize cancer cells to TNF family-induced apoptosis[J]. PLoS One, 2016, 11(9):e0161952.

[16] Siegel C, Li J, Liu F, et al. miR-23a regulation of X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) contributes to sex differences in the response to cerebral ischemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(28):11662-11667.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

miR-23a regulates cell growth and apoptosis of rectal cancer via targetingESRP1 gene

LAO Ling-juan1, SONG Xin-jiang1, XU Jia2

(1DepartmentofAnorectalSurgery,ShaoxingSecondHospital,Shaoxing312000,China;2DepartmentofGastrointestinalSurgery,TheFirstPeople’sHospitalofYueyang,Yueyang414000,China.E-mail:hosrmlan@163.com)

AIM: To investigate the expression of miR-23a and epithelial splicing regulatory protein 1(ESRP1) in rectal cancer tissues and cell lines as well as their effects on rectal cancer cell viability and apoptosis. METHODS: The relative levels of miR-23a in the rectal cancer tissues and cultured cells were assessed by RT-qPCR. The positive expression of ESRP1 in the rectal cancer tissues and non-cancer tissues was detected by immunohistochemical staining. The sequences of miR-23a inhibitor and inhibitor negative control (NC) were synthesized, and transfected into the SW480 cells. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The apoptotic rate was analyzed by flow cytometry. The cell invasion was evaluated by Matrigel counting assay. The expression of ESRP1 was determined by Western blot. The wild-type pGL3-ESRP1-3’UTR (wt-pGL3-ESRP1-3’UTR) or mutant pGL3- ESRP1-3’UTR (mut-pGL3-ESRP1-3’UTR) plasmid and miR-23a inhibitor or inhibitor NC were co-transfected into the HEK293 and SW480 cells. The dual luciferase activity was detected according to Promega dual luciferase reporter gene assay kit instructions. The cell viability and apoptosis were evaluated by CCK-8 assay and flow cytometry analysis， respectively， after the SW480 cells were transfected with ESRP1 mimic or mimic NC. The expression of ESRP1, caspase-3, Smac and X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) in the SW480 cells was detected by Western blot.RESULTS: The expression of miR-23a was significantly up-re-gulated in the rectal cancer tissues and cell lines, while the positive expression of ESRP1 was significantly decreased in the rectal cancer specimens. The miR-23a expression was also closely related to lymphnode metastasis and TNM stages of rectal cancer patients. ESRP1 was inversely correlated with miR-23a in the rectal cancer tissues. After transfection with miR-23a inhibitor in human rectal cancer SW480 cells, the down-regulation of miR-23a induced significant inhibition of cell viability as compared with the cells transfected with inhibitor NC (P<0.01). Furthermore, the apoptotic rate induced by the miR-23a inhibitor transfection was markedly higher than that of control (P<0.01). Luciferase assay showed thatESRP1 was a direct target gene of miR-23a. The cell viability and apoptosis were inhibited and promoted， respectively， after transfection with ESRP1 mimic in the SW480 cells. Promoted expression of ESRP1 significantly up-regulated the levels of caspase-3 and Smac as well as down-regulated the expression of XIAP in the SW480 cells. CONCLUSION: The expression of miR-23a is significantly associated with the growth and apoptosis of human rectal cancer cells by targetingESRP1. miR-23a may be a potential therapeutic target for the treatment of rectal cancer in the future.

Rectal cancer; miR-23a; Epithelial splicing regulatory protein 1; Apoptosis

1000- 4718(2017)05- 0817- 09

2016- 11- 15

2017- 01- 23

岳陽市2014年第三批科技資助項(xiàng)目

R363； R735.3+7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.009

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0730-8256328； E-mail： hosrmlan@163.com