鎘對刺參幼參體內(nèi)金屬硫蛋白含量及其變化規(guī)律的影響

張叢堯,吳反修,張建強,左然濤,馬悅欣,常亞青,周瑋

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.大連市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)合會,遼寧大連116023;3.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,中國水產(chǎn)學(xué)會,北京100125)

鎘對刺參幼參體內(nèi)金屬硫蛋白含量及其變化規(guī)律的影響

張叢堯1、2,吳反修3,張建強2,左然濤1,馬悅欣1,常亞青1,周瑋1、2

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.大連市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)合會,遼寧大連116023;3.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,中國水產(chǎn)學(xué)會,北京100125)

為評價水體中鎘(Cd2+)對刺參Apostichopus japonicus體內(nèi)金屬硫蛋白(MT)的誘導(dǎo)效果,以刺參幼參(體質(zhì)量8.87 g±1.12 g)為研究對象,在水溫16～18℃下,探討水體中不同濃度Cd2+(＜0.005、0.025、0.050、0.250、0.500 mg/L)脅迫下幼參體內(nèi)MT含量隨Cd2+脅迫時間(0、12、36、60、84、108 h)的變化規(guī)律。結(jié)果表明:隨著Cd2+脅迫時間的延長,幼參腸道、呼吸樹和體壁中MT含量呈先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢,且在36 h時各組織中MT含量最高或相對較高;Cd2+脅迫36 h時,幼參體內(nèi)MT含量依次為腸道＞呼吸樹＞體壁,且Cd2+脅迫后幼參各組織間MT含量有顯著性差異(P＜0.05);各時間點下,Cd2+濃度試驗組幼參腸道、呼吸樹和體壁中MT含量均顯著高于對照組(P＜0.05);在Cd2+脅迫各時間點,幼參腸道和呼吸樹中MT含量隨Cd2+濃度的升高呈顯著“階梯式”升高(P＜0.05),體壁中MT含量則隨Cd2+濃度的升高而升高,Cd2+濃度為0.025、0.050 mg/L時,體壁中MT含量相差不大(P＞0.05),但均顯著低于Cd2+濃度最高組(0.500 mg/L)(P＜0.05)。研究表明,水體中的Cd2+可誘導(dǎo)刺參組織合成金屬硫蛋白,其中對腸道和呼吸樹的誘導(dǎo)效果最明顯,36 h即可達到較為顯著的誘導(dǎo)效果,因此,刺參腸道和呼吸樹組織中的MT含量可作為評價水體中重金屬Cd2+污染的生物標(biāo)志物。

鎘;刺參;組織;金屬硫蛋白

鎘是一種常見的毒性較強的重金屬污染物,主要通過水和食物進入水生生物體內(nèi),并具有很長的潛伏期。它與生物體內(nèi)的疏基蛋白結(jié)合,可抑制多種酶活性或使酶失活[1],從而影響生物體的生長和繁殖。

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的低分子量(相對分子質(zhì)量通常小于10 000)、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白或多肽[1-3],具有廣泛的生物學(xué)功能,可參與機體微量元素的儲存、運輸和代謝,清除羥基自由基以及解除重金屬的毒性等。至今已發(fā)現(xiàn)60多種海洋無脊椎動物中存在MT[4-6]。大量研究證明,在重金屬銀(Ag+)、鎘(Cd2+)、銅(Cu2+)、汞(Hg2+)、鋅(Zn2+)等誘導(dǎo)下,生物體內(nèi)MT含量會顯著增加,且這種誘導(dǎo)與環(huán)境中金屬濃度具有一定的相關(guān)性,因此,MT可作為指示有毒重金屬污染的生物標(biāo)志物[7]。目前,國內(nèi)外對重金屬暴露下水生生物不同組織中MT的合成、表達及動態(tài)變化,在貝類、蝦蟹類、魚類和其他海洋生物中已有報道[8-14]。

刺參Apostichopus japonicus是中國記載的21種食用海參中唯一分布于黃渤海的溫帶種類,在江蘇連云港、山東半島、遼東半島、河北北戴河等沿海均有分布,具有極高的營養(yǎng)價值,為“海產(chǎn)八珍”之一[15]。有關(guān)鎘在刺參中的沉積規(guī)律及其對刺參機體免疫性能影響的研究已有一些報道[16-20],但有關(guān)鎘對刺參體內(nèi)MT誘導(dǎo)的相關(guān)研究報道較少。因此,本研究中探討了重金屬鎘脅迫下幼參體內(nèi)MT的合成及其動態(tài)變化規(guī)律,旨在為評價重金屬鎘的污染效應(yīng)提供相應(yīng)的毒理學(xué)資料,為海參養(yǎng)殖的水環(huán)境監(jiān)測及海參健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用刺參幼參選自大連金砣水產(chǎn)食品有限公司育苗場。試驗前先將幼參在沙濾海水中馴養(yǎng)2周。馴養(yǎng)期間水溫為16～18℃,光照＜600 lx,連續(xù)充氣以保證水中溶氧,每天早晚各投喂自配幼參餌料1次,每天清底換水1次,染毒試驗前2 d停止投餌。馴養(yǎng)期間幼參生長明顯,成活率為100%。

試驗用沙濾海水鹽度為31.5～32.0,pH為8.1～8.2,氨氮含量＜0.12 mg/L,水質(zhì)指標(biāo)均符合GB11607—89漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準;試驗用氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司,牛血紅蛋白(Solarbio)為北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 重金屬Cd2+濃度的設(shè)置 經(jīng)檢測,沙濾自然海水中Cd2+含量為0.18 μg/L。以GB 11607-89漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準中Cd2+質(zhì)量濃度≤0.005 mg/L為對照組,用CdCl2·5H2O分別配制成Cd2+濃度為0.025、0.050、0.250、0.500 mg/L的4個濃度組,對照組及各濃度組均設(shè)置3個平行。

1.2.2 幼參染毒試驗 采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒,試驗在PVC水槽(50 L)中進行。對照組及各濃度組共用15個水槽,均放置30頭經(jīng)事先馴養(yǎng)的健康幼參(體長7.45 cm±0.53 cm,體質(zhì)量8.57 g± 1.12 g),在水溫為16～18℃、連續(xù)充氣條件下進行染毒試驗。試驗期間不投餌料,每天換水1次,每次換水1/2,并補充Cd2+至其原有濃度。

1.2.3 組織樣品的選取及預(yù)處理 分別在染毒0、12、36、60、84、108 h時取樣分析不同質(zhì)量濃度Cd2+脅迫下幼參不同組織中MT含量的變化。從每一水槽中隨機取幼參4頭,用吸水紙吸干體表,置于冰盤中解剖,分別取出其腸道和呼吸樹并切取體壁組織0.1 g,用預(yù)冷的去離子水(0～4℃)洗去其表面的組織液和雜質(zhì),用吸水紙吸干后將4頭幼參的各種組織歸類放在一起用分析天平分別稱重,然后放入超低溫冰箱(-80℃)中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 MT含量的分析測定與計算 采用金屬/血紅蛋白飽和法測定MT含量[21]。將冷凍組織(腸道、呼吸樹和體壁)樣品解凍后,分別放入10 mL的勻漿器中,按1 g組織樣品加入4 mL緩沖液的比例,加入預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液(pH 8.6),進行冰浴勻漿;勻漿液用2-16 K低溫冷凍離心機(SIGMA)離心(0℃,10 000 r/min)30 min;用移液槍吸取0.2 mL上清液注入1.5 mL離心管中,同時加入0.5 mL質(zhì)量濃度為0.01 mol/L的Cd2+,充分混合后在室溫下放置15 min;向其中加入0.2 mL的牛血紅蛋白(質(zhì)量分數(shù)為2%),充分混合后放入80℃的水浴鍋中水浴加熱3 min,再離心(0℃,10 000 r/min)10 min,移取上清液置于新的離心管中;重復(fù)加牛血紅蛋白步驟2次,將所得的上清液全部取出;用原子吸收分光光度法測定上清液中重金屬Cd2+的含量以計算Cd-MT的含量。

因每分子MT可結(jié)合7個Cd2+[22],Cd-MT的相對分子質(zhì)量按照9799計[23],故1 g幼刺參組織中Cd-MT含量(μg/g)的計算公式為

Cd-MT=CCd×V×9799×VS/(G×7×112.4×VN)。其中:CCd為上清液中Cd2+的濃度(μg/mL);V為組織勻漿體積(mL);VS為測定時所取上清液的體積(mL);G為取樣組織的質(zhì)量(g);VN為勻漿后的取樣體積(mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,在單因素方差分析(ANOVA)達到顯著水平時(P＜0.05),采用Turkey's檢驗進行組間多重比較,試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準差表示(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+脅迫作用下幼參組織中MT含量的變化

從表1可見:隨時間的延長,對照組(Cd2+濃度＜0.005 mg/L)幼參腸道、呼吸樹和體壁的MT含量無顯著性變化(P＞0.05);Cd2+濃度試驗組幼參3種組織的MT含量均呈先顯著升高后趨于平穩(wěn)的變化趨勢;36 h時,Cd2+濃度試驗組腸道中MT含量最大,顯著高于0、12 h的對應(yīng)值(P＜0.05),但與60、84、108 h所對應(yīng)的數(shù)值均無顯著性差異(P＞0.05);36 h時,呼吸樹和體壁中MT含量在Cd2+濃度為0.500 mg/L時最大,但此時其他濃度試驗組呼吸樹和體壁MT也具有相對較高的含量,且與60、84、108 h所對應(yīng)的數(shù)值無顯著性差異(P＞0.05)。

從表1還可見:各時間點下,Cd2+濃度試驗組幼參腸道、呼吸樹和體壁中MT含量均顯著高于對照組(P＜0.05);隨著水體中Cd2+濃度升高,幼參腸道和呼吸樹MT含量在各時間點(12、36、60、84、108 h)均呈“階梯式”增長,即Cd2+誘導(dǎo)MT的能力呈現(xiàn)高濃度組＞低濃度組＞對照組,且各組間(除呼吸樹12 h時0.050 mg/L與0.250 mg/L濃度組外)均有顯著性差異(P＜0.05);各時間點下,體壁的MT含量也隨Cd2+脅迫濃度的增加而升高,其中0.025、0.050 mg/L Cd2+濃度組體壁的MT含量無顯著性差異(P＞0.05),但二者均顯著低于0.500 mg/L Cd2+濃度組(P＜0.05)。

2.2 Cd2+脅迫后幼參各組織中MT合成量的比較

從圖1可見:試驗結(jié)束時,Cd2+濃度試驗組幼參腸道、呼吸樹和體壁的MT含量均顯著高于對照組(P＜0.05),且在Cd2+濃度最高時達到最大值,各組織MT含量依次為腸道(6.67 μg/g)＞呼吸樹(4.94 μg/g)＞體壁(3.39 μg/g)(P＜0.05);而對照組腸道MT含量顯著高于體壁(P＜0.05),其余組織間無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 各濃度Cd2+脅迫不同時間對幼參腸道、呼吸樹和體壁中金屬硫蛋白含量的影響Tab.1 Metallothionein(MT)contents in the intestine,respiratory trees,and body wall of juvenile sea cucumberApostichopus japonicusexposed to various concentrations of cadmium at different timeμg/g

3 討論

3.1 Cd2+對幼參3種組織MT含量誘導(dǎo)的劑量和時間效應(yīng)

大量研究證明,在重金屬誘導(dǎo)下,生物體內(nèi)MT含量會顯著增加,且這種誘導(dǎo)作用與環(huán)境中金屬離子的濃度具有一定的正相關(guān)性[7]。本研究結(jié)果顯示,在質(zhì)量濃度為0.025～0.500 mg/L的Cd2+脅迫下,隨著Cd2+濃度的增大,幼參腸道和呼吸樹的MT含量顯著升高,并表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,Cd2+高濃度組對MT的誘導(dǎo)作用顯著大于低濃度組,這表明水中的Cd2+可誘導(dǎo)幼參體內(nèi)MT的合成和表達。隨著脅迫時間的延長,幼參3種組織中的MT含量均表現(xiàn)為先快速升高后趨于平穩(wěn)的趨勢,且在一定時間內(nèi)呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,表明此劑量-效應(yīng)關(guān)系和處理時間有明顯的相關(guān)性,即在Cd2+脅迫后的36 h時具有較為顯著的誘導(dǎo)效果。本研究結(jié)果還表明,在幼參3種組織中MT的誘導(dǎo)量表現(xiàn)為Cd2+高濃度組＞低濃度組＞對照組,且水中Cd2+對幼參組織MT的誘導(dǎo)作用在36 h時達最大或較大誘導(dǎo)量。這與吳眾望等[11]關(guān)于重金屬離子對凡納濱對蝦的研究結(jié)果基本一致,該研究發(fā)現(xiàn),隨著重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)濃度的升高和作用時間的延長,凡納濱對蝦肝胰臟MT含量表現(xiàn)為高濃度組＞低濃度組＞對照組,且誘導(dǎo)效果主要表現(xiàn)在48 h內(nèi)。此外,周彥鋒等[13]研究認為,水體中的Cd2+可誘導(dǎo)鯽組織中MT的合成與表達,且誘導(dǎo)效果主要表現(xiàn)在12 h內(nèi),本試驗結(jié)果只在主要誘導(dǎo)時間(36 h)上與其有一定差異,這可能與不同水生生物的生長、代謝等不同有關(guān)。

3.2 Cd2+對幼參MT含量誘導(dǎo)的組織差異性

關(guān)于重金屬在海產(chǎn)經(jīng)濟動物不同組織中的蓄積及毒性研究,在魚類、貝類、蝦蟹類中已有較多報道。如牙鲆染毒的前7 d,銅在各組織中蓄積速率次序為內(nèi)臟團＞鰓＞肌肉[24];鎘在櫛孔扇貝各組織中蓄積量次序為內(nèi)臟＞鰓＞肌肉[25];銅在凡納濱對蝦不同組織中積累濃度依次為肝胰腺＞鰓絲＞甲殼＞肌肉[26];脊尾白蝦對重金屬鎘的累積能力依次為內(nèi)臟團＞鰓＞外殼＞肌肉＞足[27]。以上研究均表明,重金屬在海產(chǎn)經(jīng)濟動物不同組織中蓄積量基本均表現(xiàn)為內(nèi)臟＞鰓＞肌肉。而在刺參中也具有相同的規(guī)律。丁君等[28]發(fā)現(xiàn),幼參對Zn2+、Cu2+的蓄積量依次為呼吸樹＞消化道＞體壁,說明幼參體壁對Zn2+、Cu2+的蓄積量遠比消化道和呼吸樹低;趙元鳳等[29]發(fā)現(xiàn),鉛濃度為0.5 mg/L時,刺參各組織中鉛蓄積速率依次為內(nèi)臟團＞縱?。倔w壁,表明內(nèi)臟是鉛蓄積的主要部位。本試驗中研究了不同Cd2+濃度脅迫下幼參腸道、呼吸樹和體壁MT含量的變化,結(jié)果顯示,Cd2+脅迫下幼參3種組織合成MT的能力依次為腸道＞呼吸樹＞體壁。這與上述關(guān)于不同組織對重金屬蓄積規(guī)律的研究結(jié)果基本吻合,這種誘導(dǎo)作用與蓄積的金屬濃度具有正相關(guān)性[30]。

腸道和呼吸樹是刺參的主要內(nèi)臟組織,在代謝活動中發(fā)揮了重要作用。腸道是容載、消化食物和吸收營養(yǎng)的組織,而呼吸樹為刺參的呼吸器官,需要與外界進行氣體交換,以起到魚、貝類和蝦蟹類中鰓的作用,因此,兩種組織對重金屬的蓄積量相對較高,誘導(dǎo)合成MT的能力也較強。而相比之下,體壁(肌肉)對重金屬的親和性遠比腸道和呼吸樹弱[23],體壁內(nèi)的蓄積量較低,其誘導(dǎo)MT的能力也較弱。筆者認為,幼參腸道和呼吸樹兩種組織可用作評價Cd2+污染的靶組織,而體壁(肌肉)組織則不適合,也側(cè)面反映出,從飲食安全角度分析,食用刺參體壁要比食用整體刺參安全。

水體中的Cd2+可以誘導(dǎo)刺參組織合成MT,其中對腸道和呼吸樹的誘導(dǎo)效果最明顯,且在36 h時達到較為明顯的誘導(dǎo)效果。因此,刺參腸道和呼吸樹組織中的MT含量可以作為評價水體中重金屬Cd2+污染的生物標(biāo)志物。

圖1 不同Cd2+濃度下各組織108 h時的MT含量Fig.1 Metallothionein(MT)content in intestine,respiratory trees and body wall of juvenile sea cucumberApostichopus japonicusexposed to different concentrations of cadmium for 108 h

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Effects of cadmium on content and change of metallothionein in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

ZHANG Cong-yao1,2,WU Fan-xiu3,ZHANG Jian-qiang2,ZUO Ran-tao1, MA Yue-xin1,CHANG Ya-qing1,ZHOU Wei1,2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China; 2.Dalian Fisheries Industry Technology Innovation Association,Dalian 116023,China;3.The National Fisheries Techonology Extension Center,China Fisheries Society,Beijing 100125,China)

The contents of metallothionein(MT)were monitored in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus with body weight of(8.87±1.12)g exposed to cadmium concentration of＜0.005,0.025,0.050,0.250,and 0.500 mg/L for 0,12,36,60,84,and 108 h at water temperature of 16-18℃to investigate the effects of cadmium on content and change of metallothionein in juvenile sea cucumber.The MT contents were shown to be significantly increased in the intestine,respiratory trees and body wall of juvenile sea cucumber exposed to cadmium with a concentration equal to or higher than 0.025 mg/L(P＜0.05),with the maximal content of MT in intestine,followed by respiratory tree and body wall,with significance difference(P＜0.05).MT contents in all detected tissues were first found to be significantly increased in the first 36 h,and then kept at a constant level at the exposure time from 36 h to 108 h.The juveniles exposed to cadmium had significantly higher MT contents in intestine and respiratory tree(P＜0.05),significantly higher in the body wall at 0.025 mg/L and 0.050 mg/L cadmium than that in the lowest concentration(＜0.005 mg/L),and significantly lower MT contents than that in the highest concentration (0.500 mg/L)(P＜0.05).The findings indicated that cadmium induced the synthesis of MT,whose contents in intestine and respiratory tree were chosen as the sensitive parameter to assess cadmium contamination of sea water.

cadmium;Apostichopus japonicus;tissue;metallothionein

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.02.011

2095-1388(2017)02-0184-05

S91

:A

2016-11-11

遼寧省教育廳一般項目(L2014288);遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)及成果產(chǎn)業(yè)化項目(2015203003);大連市科技計劃項目(2012B11NC049);國家“十二五”科技支撐計劃項目(2015BAD17B05)

張叢堯(1960—),男,講師。E-mail:zhangcongyao@dlou.edu.cn

左然濤(1985—),男,博士,講師。E-mail:rtzuo@dlou.edu.cn