飼料中添加殼寡糖對刺參腸壁菌群的影響

司濱,王軼南,劉海映,曹海龍,張建強(qiáng),呂繪倩,孫夢蕾,姜志強(qiáng)

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院,遼寧大連116023;3.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧大連116023;4.大連市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)合會,遼寧大連116023)

飼料中添加殼寡糖對刺參腸壁菌群的影響

司濱1,王軼南1,劉海映2,曹海龍3,張建強(qiáng)4,呂繪倩1,孫夢蕾1,姜志強(qiáng)1

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院,遼寧大連116023;3.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧大連116023;4.大連市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)合會,遼寧大連116023)

為研究飼料中添加殼寡糖對刺參Apostichopus japonicus腸壁菌群的影響,在刺參基礎(chǔ)飼料中分別添加0.25%(G1)、0.50%(G2)、0.75%(G3)和1.00%(G4)的殼寡糖,另設(shè)對照組(G0),養(yǎng)殖50 d后采集各組刺參幼參(5.03 g±0.03 g)腸壁樣品,并采用高通量測序技術(shù)分析刺參腸壁菌群結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明:殼寡糖添加組刺參腸壁的細(xì)菌多樣性和豐度均高于對照組;各組樣品腸壁優(yōu)勢菌門均為變形菌門和厚壁菌門;殼寡糖對刺參腸壁菌群組成產(chǎn)生了明顯影響,對照組優(yōu)勢菌屬為希瓦氏菌屬Shewanella,而殼寡糖添加組希瓦氏菌屬的相對比例均下降,對照組芽孢桿菌屬Bacillus的相對比例較低,而殼寡糖添加組芽孢桿菌屬的相對比例均較高或成為優(yōu)勢菌屬;1.00%殼寡糖組各類菌屬相對比例均較低,高濃度殼寡糖出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。研究表明,飼料中添加殼寡糖可提高刺參腸壁細(xì)菌多樣性和豐度,明顯改善刺參腸壁菌群結(jié)構(gòu)。

刺參;高通量測序;殼寡糖;菌群結(jié)構(gòu)

刺參Apostichopus japonicus的規(guī)模化和集約化養(yǎng)殖常導(dǎo)致刺參發(fā)病,尤其是腐皮綜合征和細(xì)菌性潰爛綜合征嚴(yán)重制約著刺參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。隨著化學(xué)藥物和抗生素類藥物的禁用,人們通過研發(fā)免疫增強(qiáng)劑以有效地防控疾病并提高刺參的產(chǎn)量及品質(zhì)。殼寡糖由殼聚糖降解得到,殼寡糖與殼聚糖水相比具有溶性高、黏度低等物理特性,具有更好的抗菌和免疫能力[3-4]。研究表明,飼料中添加適量殼寡糖能夠提高水產(chǎn)動物機(jī)體免疫力,改善生產(chǎn)性能[5],促進(jìn)其腸道菌群增殖[6],改善幼魚腸道菌群環(huán)境[7]。蔡雪峰等[8]在飼料中添加殼寡糖能使虹鱒腸道內(nèi)腸桿菌科和假單胞菌屬大量減少。目前,有關(guān)投喂添加殼寡糖的飼料對刺參腸壁菌群影響的研究尚未見報道。本研究中,采用MiSeq測序技術(shù)對投喂殼寡糖飼料的刺參腸壁菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,以期為殼寡糖在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參取自大連鶴圣豐養(yǎng)殖場。殼寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)含量約為33%,用纖維素和卡拉膠進(jìn)行雙層包被,能有效降低在水中的溶失。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,試驗(yàn)中根據(jù)飼料中殼寡糖添加量分為5組,G0組(對照組)、G1組(0.25%)、G2組(0.50%)、G3組(0.75%)、G4組(1.00%),每組設(shè)3個平行,共15個水槽(200 L),每個水槽放體質(zhì)量為(5.03±0.03)g的刺參幼參80頭。每天投餌1次,按體質(zhì)量的4%投喂,兩天換水1次,換水量為1/3～1/2,并虹吸殘餌及糞便。養(yǎng)殖期間,全天充氣,水溫控制在(19±2)℃,鹽度為32.0,pH為8.00,養(yǎng)殖試驗(yàn)共進(jìn)行60 d。養(yǎng)殖50 d時,采集刺參腸壁,取樣前一天禁食,從每個水槽取樣3頭,在無菌環(huán)境中收集刺參腸道,除去腸道內(nèi)容物后,合并每組樣品,-80℃下凍存待用。按照分組,將腸壁樣品分別記為G0、G1、G2、G3、G4組。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序 使用土壤DNA提取試劑盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取腸壁DNA。采用16S rDNA擴(kuò)增引物341F(5′CCTACGGGNGGCWGCAG 3′)和805R(5′GACTACHVGGGTATCTAATCC 3′)對樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(共30 μL):2×Phusion Master Mix 15 μL,Primer 3 μL,1 ng/μL DNA 10 μL,雙蒸水2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?98℃下預(yù)變性1 min;98℃下變性10 s,50℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共進(jìn)行30個循環(huán);最后在72℃下再延伸5 min。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣,充分混勻后使用20 g/L的瓊脂糖電泳純化PCR產(chǎn)物,利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量,混合后測序。

質(zhì)量控制:采用Prinseq軟件(PRINSEQ-lite 0.19.5)對所得測序序列的3′端進(jìn)行質(zhì)控,截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù);通過FLASH 1.2.7軟件融合雙末端序列,使其形成一條序列;采用PRINSEQ-lite 0.19.5軟件對各個樣品進(jìn)行去引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列、低質(zhì)量序列。

非靶區(qū)域序列及嵌合體的去除:采用集成于Mothur中的Pre.cluser軟件對測序校正,校正過程中允許的最大錯配為1/150;采用UCHIME軟件,以SILVA數(shù)據(jù)庫中序列作為模版去除嵌合體。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用UCLUST 1.1.579軟件將序列按照序列相似性為97%的閾值進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)聚類。對OTU進(jìn)行Coverage(Good's coverage)和稀缺型曲線分析,以及豐富度指數(shù)(ACE和Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Simpson指數(shù))分析。選擇OTU里的一條代表序列(默認(rèn)豐度最高),采用RDP classifier軟件進(jìn)行物種分類,分類閾值默認(rèn)為0.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參腸壁微生物群落多樣性及相關(guān)性分析

利用Mouthur軟件計算在97%相似水平上的每個樣品的OTU數(shù)量,此數(shù)量可代表樣品物種的豐度[9]。由表1可知,各樣品中,OTU數(shù)量最多可達(dá)2908,最少為1210。這表明刺參幼參腸壁的菌群豐度很高,且各樣品中的豐度差異較大。同時,綜合各項(xiàng)多樣性指數(shù)分析,G1組的細(xì)菌多樣性最高(ACE值和Chao1值最高,Simpson指數(shù)最低),對照組多樣性最低(ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)最低, Simpson指數(shù)最高),說明投喂殼寡糖飼料后,刺參腸壁微生物多樣性高于對照組。根據(jù)序列數(shù)及其所代表的OTU數(shù)量構(gòu)建稀缺性曲線(圖1),結(jié)果表明,各樣品稀缺性曲線趨于平緩,指數(shù)基本達(dá)到飽和,證明有效序列數(shù)量已經(jīng)能夠較好地覆蓋細(xì)菌多樣性。本研究中,當(dāng)測序數(shù)相同時,殼寡糖添加組刺參的腸壁菌群OTU數(shù)量均比對照組高,表明殼寡糖添加組刺參的腸壁菌群多樣性高于對照組。其中G1組刺參的腸壁菌群OTU數(shù)量最高。

表1 刺參腸壁樣品高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.1 Data on intestinal wall samples of sea cucumber by the high-through sequencing technique

圖1 刺參腸壁稀缺性曲線Fig.1 Rare fraction of intestinal samples of sea cucumber

2.2 刺參腸壁菌群結(jié)構(gòu)分析

在腸壁樣品檢測分類結(jié)果中,檢測到的細(xì)菌可歸屬于30門、60綱、121目、232科、834屬。主要門類為變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes、疣微菌門Verrucomicrobia、浮霉菌門Planctomycetes、放線菌門Actinobacteria等(圖2)。另外,有24個門的細(xì)菌在水樣樣品中的檢測量不足1%。各組腸壁樣品中68.79%以上均由變形菌門和厚壁菌門組成。由圖2可知:G2組刺參腸壁中變形菌門含量最高,所占相對比例為70.08%,對照組最低,為55.12%; G3組腸壁厚壁菌門比例最高,為30.23%,G4組最低,為11.51%,對照組腸壁厚壁菌門所占比例僅比G4組高。由圖3可知:厚壁菌門平均相對豐度隨著殼寡糖添加量的增大,呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢;優(yōu)勢菌門和次優(yōu)勢菌門的相對豐度比值呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢,G1、G2、G4組優(yōu)勢菌門和次優(yōu)勢菌門的相對豐度比值均大于對照組, G3組最小,G4組最大。

在樣品中選取菌群豐度最高的10個屬并計算在各樣品中所占的相對比例(表2)。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn),主要隸屬于變形菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、疣微菌門和厚壁菌門。各組樣品中共有且相對比例較高的菌屬分別為希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬和芽孢桿菌屬。這4種優(yōu)勢菌屬在各組中所占比例為G0組42.64%,G1組42.45%,G2組42.06%,G3組33.62%,G4組19.28%,其中G4組各菌屬比例均較低。這4種共有菌屬中,殼寡糖添加組與對照組相比,優(yōu)勢菌屬發(fā)生了較大改變。對照組中比例最高的為希瓦氏菌屬,為17.23%,而殼寡糖添加組中希瓦氏菌屬比例均為最低,最高比例也僅為7.29%;對照組中比例最低的芽孢桿菌屬僅為5.97%,而殼寡糖添加組中此均屬比例升高,成為優(yōu)勢菌屬,最高達(dá)15.06%;假單胞菌屬比例則隨殼寡糖添加量的增大逐漸降低,對照組中比例最高;不動桿菌屬相對比例隨殼寡糖添加量的增大呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。

圖2 刺參腸壁樣品中基于門水平的菌群相對豐度Fig.2 Relative abundance of phylum-level bacterial communities in intestinal wall samples of sea cucumberApostichopus japonicus

圖3 刺參腸壁樣品中優(yōu)勢菌門和次優(yōu)勢菌門相對豐度比較Fig.3 A comparison of relative abundance of phylumlevel bacterial communities in intestinal wall samples of sea cucumberApostichopus japonicusbetween two dominant bacterial phyla

3 討論

本研究中利用Illu mina MiSeq平臺的高通量測序技術(shù)分析了樣品刺參腸壁的菌群多樣性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),除共有的幾個門類細(xì)菌外,還檢測到廣古細(xì)菌門Euryarchaeota、脫鐵桿菌門Deferribacteres、硝化螺旋菌門Nitrospira、纖維桿菌門Fibrobacteres、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、產(chǎn)水菌門Aquificae等菌群,但在各樣品中的檢出量均不足1%[10],表明測序結(jié)果能夠有效反映細(xì)菌群落。

3.1 殼寡糖對刺參腸壁菌群結(jié)構(gòu)的影響

綜合各項(xiàng)多樣性指數(shù)和稀缺性曲線分析結(jié)果可知,刺參腸壁樣品中,殼寡糖添加量為0.25%的組菌群多樣性和菌落豐度最高,對照組最低,殼寡糖添加組菌群多樣性和菌落豐度均優(yōu)于對照組。由此可推斷,飼料中添加殼寡糖能夠?qū)Υ虆⒛c壁菌群多樣性和結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生有益影響,但腸壁菌群的多樣性并非隨著殼寡糖添加量的增大而升高,殼寡糖添加量為0.25%時作用最佳。蔡雪峰等[8]研究表明,殼寡糖能夠影響虹鱒幼魚的腸道菌落組成; Qin等[11]研究發(fā)現(xiàn),殼寡糖能夠減少羅非魚腸道中病原菌的數(shù)量,并改善腸道菌群的數(shù)量和組成。樊英等[12]指出,黨參免疫增強(qiáng)劑能夠顯著增加刺參腸道的異養(yǎng)菌數(shù)量,抑制弧菌的數(shù)量。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相類似。本研究中主要針對刺參腸壁的菌群進(jìn)行研究,與以上學(xué)者的研究對象存在一定區(qū)別。

本研究結(jié)果顯示,樣品刺參腸壁中的優(yōu)勢菌門為變形菌門,與李建光等[13]在不同養(yǎng)殖季節(jié)對刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的檢測結(jié)果一致。王姣姣等[14]也發(fā)現(xiàn),不同養(yǎng)殖月份刺參腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群均為γ-變形菌。本研究中發(fā)現(xiàn),樣品刺參腸壁中的次優(yōu)勢菌門為厚壁菌門,厚壁菌門平均相對豐度隨著殼寡糖添加量的增大呈現(xiàn)先升高后下降趨勢,殼寡糖添加量為0.75%組的厚壁菌門的平均相對豐度最大,1.00%殼寡糖添加組最低,比對照組低15.80%。由此推斷,隨著殼寡糖添加量的增加,對厚壁菌門也會產(chǎn)生抑制現(xiàn)象。

3.2 殼寡糖對刺參腸壁優(yōu)勢菌屬的影響

通過對比各樣品刺參腸壁中菌群豐度前10的優(yōu)勢菌屬發(fā)現(xiàn),各組腸道優(yōu)勢菌屬有所變化且比例不同,其中有4種優(yōu)勢菌屬為各樣品所共有,其在對照組和殼寡糖添加組中所占比例不同,對照組中比例最高的希瓦氏菌屬和假單胞菌屬,在殼寡糖添加組中的比例均有所下降且所占比例較低。希瓦氏菌屬和假單胞菌屬屬于致病菌,腐敗活性強(qiáng),能夠引起冷藏鮮魚的腐敗[15]。秦蕾等[16]研究發(fā)現(xiàn),腐敗希瓦氏菌作為一種潛在的病原可能對異育銀鯽的養(yǎng)殖造成影響。Kozi?ska等[17]也發(fā)現(xiàn),希瓦氏菌屬能夠引起鯉和鱒的病害。本研究中,刺參腸壁中不動桿菌屬的比例也發(fā)生了變化,除殼寡糖添加量1.00%組外,其余組較對照組的比例均有升高。不動桿菌屬是一群致病力較低的條件致病菌,引起的感染很少見。大西洋鮭腸道的優(yōu)勢菌屬就有不動桿菌屬,且為原駐菌群[18]。對照組中比例較低的芽孢桿菌屬,反而在殼寡糖添加組中相對比例升高,在殼寡糖添加量為0.25%組中,該菌為優(yōu)勢度最高菌屬且所占比例最大(15.06%)。在殼寡糖添加組中,芽孢桿菌屬比例隨殼寡糖添加量逐漸減小。芽孢桿菌屬和革蘭氏陽性菌對水產(chǎn)動物病原菌具有一定的拮抗作用[19]。另有研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌能夠調(diào)節(jié)宿主的腸道菌群平衡,加速食物的消化和吸收[20]。芽孢桿菌屬是厚壁菌門的主要菌屬,具有良好的脫氮去磷活性,還能促進(jìn)消化酶活性[21]。

本研究表明,殼寡糖對刺參腸壁菌群組成產(chǎn)生了影響,且這種影響與殼寡糖含量有關(guān),這與對門水平的菌群研究相一致,1.00%殼寡糖添加量對芽孢桿菌屬產(chǎn)生抑制現(xiàn)象。從樣品腸壁菌群豐度前10的菌屬可以看出,殼寡糖添加量為1.00%組刺參腸壁中各類菌屬的比例均較低,由此推測,各菌屬比例并未隨殼寡糖添加量的增大而升高,較高添加量反而抑制腸壁菌群結(jié)構(gòu)。蔡雪峰等[8]也指出,在體外抑菌試驗(yàn)中,殼寡糖在較高濃度時會產(chǎn)生抑菌作用。本研究發(fā)現(xiàn),刺參飼料中添加殼寡糖在一定范圍內(nèi)影響菌群結(jié)構(gòu),但并未發(fā)生菌群整體結(jié)構(gòu)的異常變化,只是優(yōu)勢菌屬的相對比例發(fā)生改變。

綜上所述,投喂殼寡糖飼料能夠增加刺參腸壁菌群的多樣性和豐度,改善腸壁菌群結(jié)構(gòu),但對刺參腸壁菌群整體結(jié)構(gòu)并不會產(chǎn)生異常變化,故飼料中添加殼寡糖作為刺參免疫增強(qiáng)劑是可行的。

表2 刺參腸壁樣品中優(yōu)勢度最高的10個屬Tab.2 The top ten genera in dominance in each intestinal wall samples of sea cucumberApostichopus japonicus

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Effect of dietary chitosan oligosaccharide on bacterial community in intestinal wall of sea cucumber Apostichopus japonicus

SI Bin1,WANG Yi-nan1,LIU Hai-ying2,CAO Hai-long3,ZHANG Jian-qiang4, Lü Hui-qian1,SUN Meng-lei1,JIANG Zhi-qiang1
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.College of Marine Science and Environment,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;3.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China;4.Dalian Fisheries Industry Technology Innovation Association,Dalian 116023,China)

The bacterial community in intestinal wall was investigated in sea cucumber Apostichopus japonicus(5.03 g±0.03 g)fed diets containing chitosan oligosaccharide(COS)at dose of 0(G0,as control group),0.25%(G1), 0.50%(G2),0.75%(G3)and 1.00%(G4)for 50 days by high-through sequencing technique in order to evaluate the effect of dietary COS on the bacterial community structures.The results showed that there were higher bacterial diversity and abundance in the intestinal wall of the sea cucumber fed the diets containing COS than the sea cucumber fed the control diet,with dominant Proteobacteria and Firmicutes,indicating that composition of intestinal bacteria was affected by COS.The dominant genus Shewanella was observed in the intestinal wall of the sea cucumber in the control group,while the proportion of Shewanella was found to be reduced in the intestinal wall of the sea cucumber fed the diets containing COS.It was found that Bacillus was increased in amount even became the dominant bacteria in the intestinal wall of the sea cucumber fed the diets containing COS compared with the sea cucumber fed the control diet.In group G4,however,there was lower relative proportion of various bacterial genera, high dose of COS showing inhibitory effect of bacterial diversity.The findings suggest that only optimal dose of dietary COS improve bacterial diversity and abundance in the intestinal wall of the sea cucumber.

Apostichopus japonicus;high-through sequencing technique;chitosan oligosaccharide;bacterial community

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.02.008

2095-1388(2017)02-0167-05

S963.7;S96

:A

2016-10-14

國家海洋局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201405003);大連市科技計劃項(xiàng)目(2012B11NC049)

司濱(1991—),男,碩士研究生。E-mail:18804209975@163.com

姜志強(qiáng)(1960—),男,教授。E-mail:zhqjiang@dlou.edu.cn