人參組培過程中SERK和WUS基因的表達(dá)特性

齊海軍， 孫云軒, 李 昂， 陳雙越， 高 慧， 金東淳

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

人參組培過程中SERK和WUS基因的表達(dá)特性

齊海軍， 孫云軒, 李 昂， 陳雙越， 高 慧， 金東淳*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

為研究人參葉片、愈傷組織以及從愈傷組織誘導(dǎo)出來的芽中與體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)的基因的表達(dá)特性，在已報道的與植物愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚發(fā)育密切相關(guān)的2個標(biāo)志基因SERK和WUS，以actin為內(nèi)參基因，采用RT-PCR方法分析這2個基因在人參葉片、愈傷組織及從愈傷組織長出來的芽中的表達(dá)特性。結(jié)果表明：雖然SERK和WUS在所有樣品中均有表達(dá)，但在葉片和愈傷組織中的表達(dá)量無明顯差異，而愈傷組織中分化出來的芽當(dāng)中的表達(dá)量明顯高于葉片和愈傷組織。

人參；愈傷組織；SERK；WUS；半定量RT-PCR；基因表達(dá)差異

利用植物細(xì)胞的全能性，通過誘導(dǎo)愈傷組織及體細(xì)胞胚，進(jìn)而誘導(dǎo)、培育再生植株的組培方法在植物研究中廣泛應(yīng)用。在組織培養(yǎng)中，誘導(dǎo)愈傷組織和體細(xì)胞胚發(fā)生過程經(jīng)歷胚性的獲得、干細(xì)胞分裂、分化到器官發(fā)生、發(fā)育及植株再生的一系列過程。

植物的體細(xì)胞胚的發(fā)生有經(jīng)過愈傷組織階段或不經(jīng)過愈傷組織，直接從組織或細(xì)胞發(fā)育成胚的2種途徑。過去幾十年, 人們圍繞著植物組織培養(yǎng)機(jī)理方面做了大量研究，也發(fā)現(xiàn)了AGL15(AGAMOUS-Like15)、BBM(BABYBOOM)、LEC2(LEAFYCOTYLEDON2)、SERK(SOMATICEMBRYOGENESISRECEPTORKINASE)和WUS(WUSCHEL)等與愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)的基因[1-7]；其中，SERK基因被認(rèn)為是體細(xì)胞胚發(fā)生的標(biāo)志性基因，廣泛存在于雙子葉植物、單子葉植物及裸體植物中[8]。自從Schmidt 等[5]首次從胡蘿卜(Daucuscarota)下胚軸懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞中分離出第1個SERK基因(DcSERK)以來，已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、玉米(Zeamays)[10]、水稻(Oryzasativa)[11-12]、苜蓿(Medicagotruncatula)[13]、向日葵(Helianthusannuus)[14]、鴨茅(Dactylis glomerata)[15]、可可(Theobromacacao)[8]、蜜柑(Citrusunshiu)[16]以及草地早熟禾(Poapratensis)[17]等植物中分離到不同的SERK基因。SERK基因被證明不僅在胚性組織中表達(dá),還參與植物胚胎發(fā)育、雄性發(fā)育、病害防御和信號傳導(dǎo)等活動。

WUS基因是一個典型的干細(xì)胞決定基因。自從Laux[18]等在擬南芥中鑒定出WUS基因以來，已在大豆(GlycinemaxL.Merr)[19]、狗薔薇(Rosacanina)[20]、蘿卜(Raphanussativus)[21]、毛白楊(Populustomentosa)[22]、小麥(TriticumaestivumL.)[23]、玫瑰(RosamultifloraThunb.)[24]、馬銀花(Rhododendronovatum)[25]和龍眼(DimocarpuslonganLour.)[26]等植物中克隆到WUS基因。研究表明，WUS基因主要在植物干細(xì)胞組織中心表達(dá)，被認(rèn)為是決定細(xì)胞命運(yùn)的基因[27-28]。

本研究采用RT-PCR方法分析SERK和WUS基因在人參葉片、愈傷組織以及愈傷組織中誘導(dǎo)出來的芽當(dāng)中的表達(dá)特性及其差異，旨在為了解和解釋人參組培機(jī)理、提高組培效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為來自于同一棵植株的人參葉片、愈傷組織以及來自同一批愈傷組織中誘導(dǎo)出來的芽(圖1)。

A：為正在生長的愈傷組織圖；B：長出芽的愈傷組織

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

在植物旺盛生長季節(jié)，按植株采取新鮮葉片，一部分葉片冷凍(-76 ℃超低溫冰箱)保管，另一部分葉片按齊海軍等[29]方法誘導(dǎo)愈傷組織和芽。

取100 mg來自同一棵人參植株的葉片、愈傷組織和芽，各取2份(2次重復(fù))，利用液氮研磨后，利用RNA提取試劑盒(Takara minibest plant RNA Extraction kit)，按產(chǎn)品說明書的步驟提取各樣品的RNA后，定量(Merinton-spectrophotometer)并在-20 ℃條件下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA第1鏈的合成

各取5 μg供試樣品總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GoScriptTMReverse Transcription System)，按產(chǎn)品說明書的步驟合成cDNA第1鏈后，進(jìn)行RT-PCR分析。

1.2.3 半定量RT-PCR

1) 半定量RT-PCR引物和內(nèi)參引物的合成 根據(jù)NCBI database中人參SERK、WUS基因的部分序列以及其他植物中的Actin序列，利用primer primer5軟件設(shè)計擴(kuò)增片段長度分別約為100 bp(SERK)， 120 bp(WUS)， 300 bp (Actin)引物，并在上海生工合成，其序列如表1。

表1 用于半定量RT-PCR分析的SERK、WUS 和Actin基因的引物、預(yù)期產(chǎn)物大小、退火溫度和循環(huán)數(shù)

2) 半定量RT-PCR條件的確定 以目的基因和內(nèi)參基因(Actin)的cDNA為模板，在異管同臺PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)數(shù)分別設(shè)置為30，35，40，45和50，篩選適宜的循環(huán)數(shù)，確定擴(kuò)增均處于線性期。PCR反應(yīng)程序參數(shù)為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,40～58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為25～50；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。篩選出的3個基因的退火溫度和PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)如表1。

1.3 PCR產(chǎn)物的檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含有溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)果在ZF-258全自動凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像，并用Gel-Pro 3.2軟件測定條帶的IOD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的檢測結(jié)果

樣品中提取的總RNA的D260/D280均為1.8～2.0，說明RNA樣品的純度較好。1%的瓊脂糖凝膠電泳測定結(jié)果顯示，總RNA的28 S和18 S條帶清晰、無降解，說明總RNA完整性好，可以用于后續(xù)試驗。

2.2 適宜的PCR退火溫度和循環(huán)數(shù)的確定

為確定各基因引物的最適宜的PCR退火溫度，利用梯度PCR儀，進(jìn)行梯度PCR。結(jié)果表明，內(nèi)參基因Actin在50 ℃時條帶最亮、清晰；而SERK和WUS在53.6 ℃時，其擴(kuò)增條帶最亮、清晰(圖2)。

由于平臺期效應(yīng)的影響，在半定量RT-PCR分析中確定每一個基因(包括內(nèi)參基因)的PCR循環(huán)數(shù)是影響半定量RT-PCR分析結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。為了確定每個基因的PCR循環(huán)數(shù)，設(shè)定30、35、40、45、50的不同的循環(huán)數(shù)，擴(kuò)增并電泳檢測結(jié)果，SERK,WUS,Actin的擴(kuò)增條帶(亮度)隨著循環(huán)數(shù)的增加而增強(qiáng)，到45循環(huán)時不再增加，進(jìn)入平臺期(圖3)。因此,本次半定量RT-PCR分析采用了35循環(huán)。

注：A為Actin的退火溫度梯度，從左到右依次為41.8、43.1、44.4、46.9、49.1和50 ℃；B為SERK的退火溫度梯度，從左到右依次為48、48.9、49.8、51.1、52.4、53.6、56.2和58 ℃；C為WUS的退火溫度梯度：從左到右依次為48、48.9、49.8、51.1、52.4和53.6 ℃

圖2 不同退火溫度條件下Actin、SERK、WUS的PCR擴(kuò)增效果

Fig.2 The PCR efficiency of Actin、SERK and WUS genes at different annealing temperature

1～5為SERK基因；6～10為WUS基因；10～15為Actin基因

2.3 供試樣品的半定量RT-PCR結(jié)果

以同一來源(同一棵植株)人參的葉片、愈傷組織以及愈傷組織中長出來的芽為材料，以管家基因Actin為內(nèi)參基因，采用半定量RT-PCR方法分析不同樣品當(dāng)中SERK、WUS基因的表達(dá)差異結(jié)果(圖4)。

1～2來自葉片；3～4來自愈傷組織；5～6來自芽

由圖4(Actinline)可知，Actin在不同樣品當(dāng)中的表達(dá)穩(wěn)定，說明Actin是人參半定量RT-PCR研究中的一個理想的內(nèi)參基因。從RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖(圖4)可知，2個目的基因(SERK和WUS)在葉片、愈傷組織和芽當(dāng)中均表達(dá)；但在葉片和愈傷組織中的表達(dá)量沒有差異，而在愈傷組織中長出來的芽當(dāng)中的表達(dá)量明顯高于葉片和愈傷組織中的表達(dá)量。到目前為止，認(rèn)為SERK和WUS基因是體細(xì)胞胚發(fā)生或細(xì)胞胚性的獲得以及干細(xì)胞決定基因，至于這2個基因在葉片中表達(dá)，而且與愈傷組織當(dāng)中的表達(dá)量沒有差異這一點有待于進(jìn)一步研究；而這2個目的基因在來自愈傷組織的芽當(dāng)中表達(dá)量高于葉片和愈傷組織中的表達(dá)量，這一結(jié)果符合SERK和WUS基因的本質(zhì)特性。

根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳圖譜和每條帶的IOD值，比較各樣品SERK和WUS與Actin的相對表達(dá)量(表2)。

表2 SERK、WUS、Actin相應(yīng)RT-PCR條帶的IOD值及相對表達(dá)量

注：R1為SERK、WUS的表達(dá)量；R2為Actin的表達(dá)量；R1/R2是SERK、WUS相對于Actin的表達(dá)量。

3個樣品間SERK的表達(dá)量均有差異，分別為2.13(葉片)、1.96(愈傷組織)、3.58(芽)，而且芽當(dāng)中的表達(dá)量最高；同樣，3個樣品間WUS的表達(dá)量均有差異，分別為1.09(葉片)、1.12(愈傷組織)和1.49(芽)，而且芽當(dāng)中的表達(dá)量最高。

3 討論與結(jié)論

如今，RT-PCR方法廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測[30-32]、動物[33-37]和植物[38-43]基因的克隆與表達(dá)研究。而半定量RT-PCR方法比定量RT-PCR法具有靈敏度高(比雜交法高1 000～10 000倍)、專一性好、快速簡便、所需樣品量少及耗費較低等諸多優(yōu)點。在影響半定量RT-PCR法的諸多因素中選擇何種內(nèi)參基因是決定其結(jié)果的關(guān)鍵因素。本研究中選用的內(nèi)參基因Actin，在預(yù)備實驗中，在人參的不同組織中的表達(dá)量基本一致，穩(wěn)定表達(dá)。認(rèn)為Actin是人參基因表達(dá)研究中的理想的內(nèi)參基因。

SERK基因廣泛存在于植物界, 在不同的植物中有特定的表達(dá)方式。SERK基因一般都參與體細(xì)胞胚的發(fā)生，如DcSERK[5]、OsSERK1[12]，而有些植物中不僅參與體細(xì)胞胚的發(fā)生，還在雌配子體、孢子體原基周圍細(xì)胞層、表皮細(xì)胞及成熟的根莖葉維管組織中少量表達(dá)[16，11]。WUS基因是植物干細(xì)胞的決定基因，該基因的表達(dá)與干細(xì)胞的形成和器官的發(fā)生有密切關(guān)系[44],在植物器官和組織的生長過程中對干細(xì)胞的維持和分化的調(diào)控起到極為重要的作用[27，45-53]。最近的研究結(jié)果表明：不同環(huán)境中的細(xì)胞對WUS信號感應(yīng)性(competence)有差異，WUS的存在讓細(xì)胞啟動多潛能性，這些多潛能性細(xì)胞根據(jù)周圍環(huán)境的差異向著不同的方向分化,在營養(yǎng)生長時期的莖尖就啟動葉的產(chǎn)生，在生殖生長的莖尖啟動花芽產(chǎn)生，在花芽內(nèi)就啟動花器官的產(chǎn)生，在胚珠中時誘導(dǎo)合點細(xì)胞啟動珠被，在根部分別啟動葉原基、體細(xì)胞胚(有外源生長素時)、花芽(在有LFY共存時),如WUS基因在番茄花的形態(tài)發(fā)育、器官鑒別、花離層區(qū)和器官脫落過程以及控制番茄小室的數(shù)量中起到重要調(diào)控作用[54-55]。這些研究結(jié)果表明：不同植物的SERK、WUS基因有特定的表達(dá)方式。本研究中SERK、WUS2個目的基因在人參葉片、愈傷組織和芽當(dāng)中均表達(dá)，在葉片和愈傷組織中的表達(dá)量沒有差異，而在愈傷組織中長出來的芽當(dāng)中的表達(dá)量明顯高于葉片和愈傷組織中的表達(dá)量。這一結(jié)果預(yù)示，在人參中SERK、WUS基因不僅在具有胚性的愈傷組織不同發(fā)育階段表達(dá)，同時在非胚性組織、器官中也有表達(dá)，如葉片。

研究表明,SERK基因的表達(dá)受激素的調(diào)控[13-14]；SERK基因的異位表達(dá)，表明SERK是體細(xì)胞胚發(fā)生必不可少的基因[8]，同時可以提高外植體成胚率[9]。也有研究表明，SERK基因并非單純參與體細(xì)胞胚發(fā)生的誘導(dǎo)或維持, 可能在不同植物中起不同的作用, 也可能廣泛參與植物培養(yǎng)時的各種形態(tài)發(fā)生途徑。Hu等[12]認(rèn)為OsSERK可能作用于體細(xì)胞胚的發(fā)生, 但它更重要的效果是促進(jìn)水稻愈傷出芽。WUS基因的表達(dá)同樣受激素的調(diào)控，與其他因子相互作用決定植物細(xì)胞的命運(yùn)，高效啟動體細(xì)胞胚的發(fā)生[56]，而WUS的異位表達(dá)，促進(jìn)葉狀器官、綠色愈傷組織和胚胎的發(fā)生[57]。前人相關(guān)研究表明，在組織培養(yǎng)過程中合理搭配利用激素，結(jié)合調(diào)控SERK、WUS基因表達(dá)，能夠誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)育。人參等難以誘導(dǎo)再生植株，或誘導(dǎo)頻率低的植物中，通過誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)育，誘導(dǎo)再生植株和提高誘導(dǎo)率在理論研究和實際應(yīng)用方面具有重大意義。本研究中，在人參葉片、愈傷組織以及愈傷組織中誘導(dǎo)出來的芽當(dāng)中SERK、WUS基因的表達(dá)特性分析結(jié)果，為進(jìn)一步探討SERK、WUS基因在人參俞傷組織形成過程中的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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Expression patterns ofSERKandWUSgenes during tissue culture inPanaxginseng

QI Haijun, SUN Yunxuan, LI Ang, CHEN Shuangyue, GAO Hui, JIN Dongchun*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In order to elucidate expression patterns of the genes related with somatic embryogenesis in leaf, callus and callus shoot ofPanaxginseng, two genes ofSERK(SOMATICEMBRYOGENESISRECEPTORKINASE) andWUS(WUSCHEL) were selected from the genes which closely related with callus formation and somatic embryogenesis reported. And,actingene as internal expression control standard, the expression properties ofSERKandWUSgenes in leaf, callus and callus shoot ofPanaxginsengwere detected by RT-PCR. The results showed thatSERKandWUSwere expressed in all the samples. The expression levels of both genes between leaf and callus were not significantly different, but their expression levels in callus shoot were obviously higher than in leaf and callus.

Panaxginseng;SERK;WUS; RT-PCR; gene expression pattern

2017-02-04 基金項目：韓國農(nóng)村振興廳國立園藝特作研究院國際合作研究項目(41309001)

齊海軍(1989—)，男，山西孝義人，在讀碩士，研究方向為生物技術(shù)在作物遺傳育種中的應(yīng)用。金東淳為通信作者，E-mail:jdc1200@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0016-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.003

S567.51

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