姜黃素對(duì)H22肝癌、S180肉瘤小鼠的抑瘤作用及機(jī)制研究

劉碧霞　　章紅燕

[摘要] 目的 探討姜黃素對(duì) H22肝癌、S180肉瘤小鼠的抑瘤作用及機(jī)制，為H22肝癌臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 采用ICR小鼠接種H22瘤株、S180肉瘤株分別建立腫瘤模型，采用姜黃素進(jìn)行干預(yù)，明確其抑瘤作用，分陽(yáng)性對(duì)照組（CTX化療組）、陰性對(duì)照組（生理鹽水組）、姜黃素低劑量組、姜黃素中劑量組、姜黃素高劑量組，每組12只。對(duì)比分析治療組各組用藥前后體重、抑瘤率的差異；動(dòng)物處死后，取腫瘤組織，采用熒光定量RT-PCR測(cè)定腫瘤組織中TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表達(dá)。 結(jié)果 姜黃素對(duì)肝癌和肉瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率為36.04%和41.27%，有明顯的抑瘤作用。與模型組比較，給藥組腫瘤組織NF-κB、CyclinD1、VEGF的表達(dá)水平下調(diào)，TGF-β1RⅡ的表達(dá)水平顯著升高。 結(jié)論 姜黃素通過上調(diào)腫瘤組織TGF-β1RⅡ，下調(diào)NF-κB、CyclinD1、VEGF表

肝癌是我國(guó)高發(fā)的、危害極大的惡性腫瘤。原發(fā)性肝癌（Primary liver cancer，PLC）的病因及分子機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為其發(fā)病是復(fù)雜過程。近年來傳統(tǒng)中醫(yī)中藥在肝癌綜合治療中有明顯優(yōu)勢(shì)[1-3]。中醫(yī)藥治療與手術(shù)、放療、化療、免疫治療一道被稱為當(dāng)前針對(duì)惡性腫瘤的五大類治療。近幾年來，從中藥中尋找結(jié)構(gòu)新穎和作用獨(dú)特的抗腫瘤活性成分或先導(dǎo)化合物是抗腫瘤藥物研究的一條重要途徑。目前上市的抗腫瘤藥很多來源于中藥的提取及開發(fā)，包括紫杉來源的紫杉醇、多西紫杉醇，三尖杉來源的高三尖杉酯堿，人參來源的人參皂甙 Rg3 等。

姜黃，又名黃姜、郁金、寶鼎香，為姜科植物姜黃的根莖，主產(chǎn)于浙江、福建、湖北、四川等地，為浙江省重要的本土中藥材。藥理研究表明，姜黃具有保肝、利膽、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗艾滋病、抗生育、降血脂、抗病原微生物及抗病原蟲、加快創(chuàng)傷愈合、抗突變等作用。姜黃素主要是從姜科植物郁金中提取的一種化合物[4]。1985年Kuttan等[5]首次提出姜黃素具有抗腫瘤的作用，此后有大量研究進(jìn)一步證實(shí)。吉鴻等[6]發(fā)現(xiàn)姜黃主要提取物姜黃素可通過抑制NF-γB-Snail信號(hào)途徑來抑制乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（EMT），進(jìn)而抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力。范德生等[7]發(fā)現(xiàn)用姜黃素處理鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2Z后，腫瘤細(xì)胞增殖明顯受到抑制，同時(shí)細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低，其機(jī)制可能與姜黃素下調(diào)EGFR的表達(dá)有關(guān)。宛傳丹等[8]發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。劉鵬等[9]通過對(duì)免疫抑制小鼠實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)，增加B細(xì)胞抗體產(chǎn)生能力，增強(qiáng)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增值，對(duì)固有免疫和適應(yīng)免疫均有一定的增強(qiáng)作用。李然等[10]在藥物毒性角度證實(shí)其安全性。介于其良好的安全性及廣泛的抗腫瘤作用，本研究探討其抗肝癌作用及具體的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng) S180瘤株、人肝癌HepG2細(xì)胞株引自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，將H22肝癌細(xì)胞株，S180瘤株接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.1.2 動(dòng)物 ICR小鼠，SPF級(jí)，年齡：4～6周，體重18～22 g。浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由常州卡文斯生物科技發(fā)展有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2011-0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2011-0036。

1.1.3 藥物 姜黃素購(gòu)自Sigma公司，分子質(zhì)量368.38，以二甲基亞楓（DMSO）溶解，配制成100 mmol/L儲(chǔ)存液，使用時(shí)用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，稀釋后的DMSO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)<5%，置于-20℃避光保存。注射用環(huán)磷酰胺：200 mg/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.1.4 主要儀器 生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS IX51）；臺(tái)式低速離心機(jī)（中國(guó)上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠80-2）；PCR儀器（美國(guó)ABI公司 9700型）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 H22肝癌小鼠模型制備與分組 收集培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG-2懸液，濃度為1×107個(gè)/mL，以每只0.1 mL接種于60只體重（20±2）g ICR小鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、姜黃素低劑量組（10 μmol/L）、姜黃素中劑量組（20 μmol/L）、姜黃素高劑量組（40 μmol/L）、陽(yáng)性對(duì)照組、每組12只。

1.2.2 S180肉瘤小鼠模型制備與分組 取雄性60只ICR小鼠。無菌條件下取接種S180瘤株6～7 d的小鼠的腹水，以生理鹽水稀釋，調(diào)細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL。按0.2 mL每只接種于小鼠前肢右腋皮下。接種后隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、姜黃素低劑量組（10 μmol/L）、姜黃素中劑量組（20 μmol/L）、姜黃素高劑量組（40 μmol/L）、陽(yáng)性對(duì)照組（CTX組），每組12只。

1.2.3 給藥 接種24 h后，陰性對(duì)照組灌胃生理鹽水，劑量為0.2 mL/10 g，每天1次；姜黃素低、中、高濃度組分別給予10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L， 給藥劑量0.2 mL/10 g，每天1次；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射CTX，20 mg/kg，每天1次。觀察14 d停藥，稱重，處死并剝離皮下瘤體稱重。

1.2.4 數(shù)據(jù)收集 使用測(cè)量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察受試樣品的抗腫瘤效應(yīng)。給藥前各組鼠稱重（第1次），并在給藥2周后分別稱重，給藥結(jié)束后，處死，手術(shù)剝?nèi)×鰤K稱重。

1.2.5 抑瘤研究 抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)：腫瘤生長(zhǎng)抑制率（%），計(jì)算公式如下：

1.2.6 熒光定量RT-PCR測(cè)定腫瘤組織中TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表達(dá)的影響 （1）腫瘤組織總mRNA提?。喊闯Ｒ?guī)進(jìn)行。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按試劑盒說明操作進(jìn)行。反應(yīng)條件：37℃ 60 min，95℃ 3 min。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：按試劑盒說明操作進(jìn)行。反應(yīng)條件：93℃→3 min變性，然后按93℃ 45 s→55℃ 60 s，共做40個(gè)循環(huán)。（4）PCR引物序列設(shè)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS（Staffstical Package for the Social Science）19.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)荷H22肝癌瘤小鼠的抑瘤作用

姜黃素低、中、高劑量組對(duì)肝癌的腫瘤抑制率分別為12.15%、36.04%、19.84%、以中劑量組抑瘤作用最好，陽(yáng)性對(duì)照組的腫瘤抑制率48.99%。姜黃素低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組瘤重相比均有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果顯示姜黃素對(duì)荷H22肝癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng)都有明顯的抑制作用，見表1，圖1。

2.2 姜黃素對(duì)荷S180肉瘤小鼠的抑瘤作用

與陰性對(duì)照組比較，姜黃素對(duì)荷S180肉瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)都有明顯的抑制作用，其中低、中、高劑量組的抑瘤率分別為34.13%、41.27%、22.23%，給藥組以中劑量抑瘤作用最好，CTX化療組的抑瘤率55.56%。與陰性對(duì)照組相比，姜黃素低、中劑量組瘤重，均有顯著差異（P<0.05）；CTX組的瘤重有非常顯著差異（P<0.01）。見表2，圖1。

2.3熒光定量結(jié)果

2.3.1 TGF-β1RⅡ熒光定量結(jié)果 與陰性對(duì)照組比較，中、高劑量姜黃素組和CTX組的TGF-β1RⅡ的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；低劑量組TGF-β1RⅡ的表達(dá)水平略高，但無顯著性差異；與CTX化療組比較，中、高劑量姜黃素組和CTX組的TGF-β1RⅡ表達(dá)水平顯著升高。

2.3.2 NF-κB熒光定量結(jié)果 與生理鹽水比較，低、中、高劑量姜黃素組和陽(yáng)性對(duì)照組（CTX）NF-κB的表達(dá)水平均有明顯降低，且均有顯著差異（P<0.01），其中以高劑量的姜黃素組降低水平最為明顯。與CTX化療組相比，高劑量組更有明顯的療效趨勢(shì)，結(jié)果有顯著性差異（P<0.01）。見表4。

2.3.3 VEGF熒光定量結(jié)果 與陰性對(duì)照組比較（生理鹽水），低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組（CTX）VEGF的表達(dá)水平有明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；與CTX化療組相比，高劑量組無顯著性差異（P>0.05），見表5。

2.3.4 CyclinD1熒光定量結(jié)果 與陰性對(duì)照組相比，高劑量組差異非常顯著（P<0.01）；與陰性對(duì)照組相比，低劑量組、中劑量組和CTX化療組有顯著差（P<0.05）。見表6。

3討論

姜黃素是從中藥姜黃、郁金、莪術(shù)、菖蒲等植物的根莖中提取的一種天然黃色酚類色素，其抗腫瘤效應(yīng)近年來備受關(guān)注，有研究證實(shí)姜黃素有確切的抗腫瘤、抗氧化、抗轉(zhuǎn)移、抗血管生成等作用[11]。姜黃素因其廣泛的藥理作用，在中國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用；而在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，姜黃素儼然成為研究的熱點(diǎn)。因其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的抗癌作用和逆轉(zhuǎn)耐藥性，且毒副作用小、安全性高[12-16]，因此姜黃素是一種具有前景的抗癌藥物，但其抗癌作用的更具體的機(jī)制需進(jìn)一步研究。目前已發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)多種惡性腫瘤如乳腺癌、宮頸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌[17]等均有抑制生長(zhǎng)的作 用，美國(guó)國(guó)立腫瘤所已將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥[18，19]，但其作用機(jī)制及療效還需進(jìn)一步研究證實(shí)。大量研究證明姜黃素具有廣泛的生理活性作用，不但能保護(hù)受損的正常細(xì)胞，也能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在抗腫瘤藥物中比較有發(fā)展前景，但其療效因口服吸收率低而受到限制[20-21]。這就要求我們也要不斷發(fā)現(xiàn)姜黃素中更易于吸收、更有效的成分。相信在未來的研究中，通過聯(lián)合藥物治療、基因治療、分子靶向治療可進(jìn)一步提高惡性腫瘤治療水平。

本項(xiàng)目通過姜黃素干預(yù)移植瘤模型，進(jìn)行體內(nèi)抑瘤作用研究；采PCR檢測(cè)腫瘤組織TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表達(dá)的水平。本研究完成了既定的研究?jī)?nèi)容，取得了預(yù)期的研究成果：①明確姜黃素對(duì)H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用研究；②明確姜黃素對(duì)H22肝癌腹水瘤小鼠的生存時(shí)間的延長(zhǎng)作用；③明確姜黃素對(duì)腫瘤組織TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表達(dá)影響。

國(guó)內(nèi)外在抗腫瘤藥物篩選過程中通常選擇各種體型實(shí)腫瘤，這類腫瘤生長(zhǎng)速度快，增殖比率高，體積倍增時(shí)間短。腫瘤體積和腫瘤體重是評(píng)價(jià)藥物抗腫瘤活性的重要指標(biāo)，給藥后，各組小鼠腫瘤持續(xù)增長(zhǎng)。給藥一周后給藥組與CTX組比較，出現(xiàn)顯著性差異（P<0.01）。

根據(jù)國(guó)家新藥研究規(guī)定，當(dāng)抑制率>30%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則評(píng)定該受試藥物有一定的抗胖瘤活性，可見，本研究的姜黃素具有良好的抗肝癌異種移植瘤活性。

腫瘤的生長(zhǎng)過程中，機(jī)體內(nèi)血液對(duì)營(yíng)養(yǎng)的供給能力是影響腫瘤生長(zhǎng)以及荷瘤機(jī)體維持正常生理功能的中藥影響因素。紅細(xì)胞是外周血中起到運(yùn)送氧氣和二氧化碳的作用，血紅蛋白是紅細(xì)胞中結(jié)合氧氣和二氧化碳的活性成分，白細(xì)胞在機(jī)體中起到防御和免疫功能，淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞的20%～30%，分為T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等不同類型，分別起到細(xì)胞免疫和體液免疫功能，血小板在機(jī)體的炎癥過程中起到一定作用。血相的變化可以在一定意義上反映機(jī)體功能是否正常。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)還將進(jìn)一步開展研究姜黃素對(duì)移植瘤小鼠的脾臟和血小板、血紅蛋白、淋巴細(xì)胞等血細(xì)胞的影響，評(píng)價(jià)抗癌扶正協(xié)定方對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)，此外，還從增效減毒角度探討姜黃素是否具備逆轉(zhuǎn)或緩解CTX等化療藥物的骨髓抑制，減少化療藥物對(duì)機(jī)體的損傷作用。

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（收稿日期：2016-12-06）