藏山羊FGF21基因克隆及生物信息學(xué)分析

沈閱　林亞秋　梅寒　李想　張小玉

摘要：為探討藏山羊FGF21基因的分子結(jié)構(gòu)特征，利用RT-PCR技術(shù)對該基因進(jìn)行克隆、測序及相關(guān)生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：獲得藏山羊FGF21基因序列650 bp，ORF長度為634 bp，編碼209個氨基酸。氨基酸序列分析顯示，藏山羊FGF21編碼蛋白屬于不穩(wěn)定酸性蛋白，分子式為C₁₀₂₂H₁₅₉₆N₂₇₆O₂₉₆S₅，分子質(zhì)量為22.65 ku。預(yù)測該蛋白含有13個磷酸化位點(diǎn)，并與多種蛋白存在相互作用；無跨膜結(jié)構(gòu)域，有信號肽結(jié)構(gòu)。在47～164位氨基酸殘基存在FGF結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位顯示，F(xiàn)GF21蛋白大部分位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。同源性分析指出山羊FGF21氨基酸序列保守性較高，與GenBank中藏羚羊、牛、印度水牛及豬等的同源性在90%-99%。本研究結(jié)果為闡明FGF21基因在藏山羊中的作用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：藏山羊；FGF21基因；克??；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S827.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0044—04

成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是一類由FGF基因家族編碼的結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。人類的FGF家族包括22個成員，按種系和序列又分為7個亞科，大部分FGF因子對細(xì)胞的生長和分化具有調(diào)節(jié)作用。成纖維細(xì)胞生長因子FGF21（fibroblast growth factor 21）是FGF家族的一個新成員，屬于FGF家族中FGF19亞家族成員之一。FGF21主要在肝臟、脂肪和其他組織表達(dá)，它對機(jī)體的能量平衡調(diào)節(jié)和糖代謝具有重要作用，已經(jīng)成為全球糖脂代謝研究的熱點(diǎn)基因。

研究指出生酮飼喂小鼠可使小鼠體質(zhì)量減輕，并且用生酮飼喂FGF21基因敲除大鼠，則老鼠出現(xiàn)體質(zhì)量明顯上升現(xiàn)象。Coskun等報道FGF21過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠對多食誘導(dǎo)的肥胖有明顯的改善作用，并可逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性及胰島素抵抗，使體質(zhì)量下降約20%。學(xué)者在給患糖尿病的恒河猴注射FGF21后發(fā)現(xiàn)其不僅對血糖有控制作用，還具有輕度的減重作用。研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者空腹血清FGF21表達(dá)水平顯著高于正常對照組，F(xiàn)GF21表達(dá)水平與腰圍以及WHR、FPG、HbA1c、FINS、TG、hsCRP的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，與HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)。上述研究結(jié)果都反映出，F(xiàn)GF21在脂肪代謝和控制體質(zhì)量方面都起了非常重要的作用，但上述研究均集中在人和小鼠等動物及細(xì)胞系上進(jìn)行，在動物脂肪沉積方面的研究尚不深入。在山羊上尚未見相關(guān)報道，僅見山羊FGF21的預(yù)測序列，因此需要進(jìn)行更深入的研究。

藏山羊是我國青藏高原特有畜種，又稱為“克什米爾”山羊，其肌肉細(xì)嫩、風(fēng)味好，是藏族同胞重要的生產(chǎn)和生活資料。且藏山羊一般不需要專門肥育，是研究山羊優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成的理想材料。因此本研究以藏山羊?yàn)檠芯繉ο?，?yīng)用RT—PCR技術(shù)獲得FGF21基因序列，同時進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究FGF21基因在藏山羊脂肪代謝及能量平衡中的作用機(jī)制，對提高藏山羊的育肥效率、提高肉品質(zhì)提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動物與組織的采集 以四川省若爾蓋種羊場飼養(yǎng)的成年健康公藏山羊?yàn)樵囼?yàn)動物，現(xiàn)場屠宰，迅速采集背最長肌組織樣本，立即置于液氮中保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2主要試劑 Trizol試劑盒、熒光定量試劑盒SYBR@Premix Ex TaqTM（2×）、pMD-19T Vector均購自大連TaKa-Ra公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA SynthesisKit均購于Thermo公司，Taq聚合酶、膠回收試劑盒與E.ColiDH5a感受態(tài)細(xì)胞均購于天根生化科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA合成按照Trizol試劑盒說明書提取藏山羊背最長肌的總RNA，測定D_260nm與D_280nm比值在1.8～2.0之間，檢測RNA濃度和質(zhì)量，然后取2μg按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書來合成cDNA第一鏈，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上山羊FGF21基因預(yù)測序列（XM_005692688），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR克隆引物（正：5′-ACTGATGGGCTGGGACGA-3′；反：5′-TGCACAGCGGACGTCTTC-3′），產(chǎn)物長度為650 bp。引物送交四川成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

1.2.3藏山羊FGF21基因克隆 利用RT-PCR技術(shù)克隆臧山羊FGF21基因序列，PCR反應(yīng)總體系為：2×Taq PCRMaster Mix 12.5μL，模板cDNA 1μL，上、下游引物各1μL（10μmol/L），最后加水至25μL。擴(kuò)增條件：94℃4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，36個循環(huán)；72℃10 min。然后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收試劑盒純化目的片段，然后再將產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定后送至四川成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4藏山羊FGF21基因和蛋白的生物信息學(xué)分析 Prot-Param（http：∥web.expasy.org/protparam/）分析蛋白理化性質(zhì)；ProtParam（http：∥Web.expasy.org/protparam/）分析蛋白理化性質(zhì)；NetPhos 2.0分析預(yù)測磷酸化位點(diǎn)；Signal P 4.1Server信號肽預(yù)測；TMHMM預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；NPS預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；NCBI在線程序CDD預(yù)測保守功能域；通過PSORTⅡ進(jìn)行亞細(xì)胞定位，利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索蛋白相互作用分析；NCBI中Blast在線比對同源性分析，Clustalx 1.83和MEGA 5.0構(gòu)建進(jìn)化樹；

2結(jié)果與分析

2.1山羊FGF21基因的克隆

用藏山羊背最長肌組織cDNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得FGF21目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測與預(yù)期相符（圖1），測序后經(jīng)Blast比對后確定其為藏山羊FGF21基因序列650 bp，分析表明FGF21基因序列起始密碼子ATG位于5 bp處，終止密碼子位于634 bp處，其中核苷酸序列的堿基組成分別為：A 17.2%，C 34.3%，G 29.8%，T 18.6%。

2.2藏山羊FGF21生物信息學(xué)分析

2.2.1蛋白理化性質(zhì)分析 蛋白理化性質(zhì)分析表明，藏山羊FGF21蛋白由209個氨基酸殘基組成（圖2），分子式為C₁₀₂₂H₁₅₉₆N₂₇₆O₂₉₆S₅，分子質(zhì)量為22.65 ku。帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為22個，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為20個，即該蛋白質(zhì)可能帶負(fù)電荷。結(jié)合不穩(wěn)定系數(shù)（52.g7）、理論等電點(diǎn)（6.08）和平均疏水指數(shù)（0.293）可知，F(xiàn)GF21蛋白為不穩(wěn)定、酸性不溶類蛋白。且分析顯示藏山羊FGF21的47～164位氨基酸序列殘基存在FGF結(jié)構(gòu)域（圖2、圖3）。

2.2.2蛋白磷酸化位點(diǎn)分析 經(jīng)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，在76、79、122、152、195、200、204和206位共有8個絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)，在68和98位共有2個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)，在132、201和207位共有3個絡(luò)氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)。

2.2.3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析信號肽 分析結(jié)果指出山羊FGF21蛋白無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。在1～28位氨基酸處存在信號肽。

2.2.4亞細(xì)胞定位及蛋白相互作用分析 通過PSORTⅡ預(yù)測，主要在細(xì)胞質(zhì)（55.6%）和細(xì)胞核（22.2%）發(fā)揮生物學(xué)作用，少量作用于液泡（11.1%）和線粒體（11.1%）。利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索FGF21蛋白相互作用，條件限制在10個蛋白以內(nèi)。搜索結(jié)果表明，F(xiàn)GF21蛋白可能和FGFR1、IGF1R、FGFR2、INSR、FGFR、PPARA、CSF1R、CYP7A1、FGFR3和FGFR4蛋白存在相互作用。構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

2.2.5蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過SOPMA在線軟件預(yù)測藏山羊FGF21蛋白二級結(jié)構(gòu)（圖5），結(jié)果顯示，在藏山羊FGF21的209個氨基酸中，33個（15.7%）氨基酸可能形成α-螺旋（h），48個（22.97%）氨基酸可能形成β-折疊占（e），19個（9.09%）氨基酸可能形成β-轉(zhuǎn)角（t），109個（52.15%）氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲（c）。通過I-TSSER軟件預(yù)測山羊FGF21蛋白三級結(jié)構(gòu)（圖6），該三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.3藏山羊FGF21預(yù)測的氨基酸序列與其他物種同源性比較

通過NCBI中BlastN程序和BlastP程序分別進(jìn)行同源性在線分析，結(jié)果表明，藏山羊FGF21推測的氨基酸序列與藏羚羊（XP_005955412）、牛（XP_005895443）、印度水牛（XP_006050969）、豬（NP_001156882）、馬（XP_001489202）、人（NP_061986）、小鼠（NP_064397）、大鼠（NP_570108）、家犬（XP_541510）和野駱駝（XP_006173890）的同源性分別為99%、99%、99%、91%、86%、85%、75%、74%、90%和90%，表明藏山羊與藏羚羊的親緣關(guān)系最近（圖7）。

3討論與結(jié)論

FGF21是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與糖脂代謝關(guān)系密切的內(nèi)源性脂肪細(xì)胞因子，有助于脂肪的代謝，是饑餓時抑制生長的重要因子。并且體外研究表明它可以降低血糖、抑制胰高血糖素的分泌、改善脂代謝。Varady等指出FGF21在豬的脂肪控制中具有調(diào)控作用，并且生長激素可以直接刺激牛肝臟中FGF21的表達(dá)?；诖?，畜牧工作者對FGF21在動物脂代謝中的作用也非常關(guān)注。因此本試驗(yàn)通過克隆得到藏山羊FGF21基因序列，為后續(xù)在山羊中的研究奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)克隆得到藏山羊FGF21基因序列650 bp，編碼209個氨基酸，具有FGF家族典型的結(jié)構(gòu)。推測的氨基酸序列與藏羚羊的同源性最近，這符合物種的進(jìn)化規(guī)律。同時利用生物信息學(xué)分析了藏山羊的磷酸化位點(diǎn)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、二級和三級結(jié)構(gòu)以及蛋白相互作用等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏山羊FGF21沒有跨膜結(jié)構(gòu)，具有信號肽結(jié)構(gòu)，含有13個磷酸化位點(diǎn)，并主要發(fā)生在絲氨酸殘基上（8個），推測其翻譯后修飾主要是通過此來進(jìn)行的。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)在藏山羊FGF21氨基酸序列主要有33個α-螺旋、48個β-折疊、19個β-轉(zhuǎn)角和109個無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，并且三級結(jié)構(gòu)預(yù)測也證明了二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，有利于進(jìn)一步闡明藏山羊FGF21的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過蛋白質(zhì)相互作用分析預(yù)測與藏山羊FGF21相互作用的蛋白可能是FGFR1、IGF1R、FGFR2、INSR、FGFR、PPARα、CSF1R、CYP7A1、FGFR3和FGFR4等。

有研究指出FGF21的啟動子上有PPARα結(jié)合位點(diǎn)，具有上調(diào)FGF21表達(dá)的功能，禁食和飼喂可以通過PPARα促進(jìn)FGF21在肝臟中的大量表達(dá)，本試驗(yàn)的預(yù)測結(jié)果與之一致。但關(guān)于FGF21在藏山羊中的具體的作用機(jī)制需要試驗(yàn)來進(jìn)一步證明。