抑瘤素M通過(guò)誘導(dǎo)衰老抑制肝癌細(xì)胞增殖*

張艷艷 駱 瑩 吳國(guó)珍 王 鵬 焦曉磊 李雅玥 高英堂 朱爭(zhēng)艷 楊斌

抑瘤素M通過(guò)誘導(dǎo)衰老抑制肝癌細(xì)胞增殖*

張艷艷①駱 瑩②③④吳國(guó)珍①王 鵬②③④焦曉磊②③④李雅玥②③④高英堂②③④朱爭(zhēng)艷②③④楊斌②③④

目的：通過(guò)分析抑瘤素M（oncostatin M，OSM）對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)，研究其影響細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。方法：OSM處理SMMC-7721和HepG2肝癌細(xì)胞系，觀察細(xì)胞的增殖速率和形態(tài)變化，結(jié)合特異性β-半乳糖苷酶染色和細(xì)胞周期分析，研究OSM是否通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)來(lái)抑制其增殖；進(jìn)一步通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期抑制蛋白p16、p21、p27和癌基因c-Myc的表達(dá)變化，分析OSM誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的原因。結(jié)果：OSM可以抑制肝癌細(xì)胞系生長(zhǎng)，且抑制率呈現(xiàn)一定劑量依賴(lài)性；細(xì)胞形態(tài)變化和β-半乳糖苷酶染色進(jìn)一步證實(shí)OSM可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。細(xì)胞周期分析表明OSM阻滯肝癌細(xì)胞于G0/G1期，并伴隨p21和p27周期抑制蛋白的表達(dá)增高。最后，通過(guò)分析STAT3信號(hào)途徑下游癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)錄與蛋白水平，表明OSM可能是通過(guò)癌基因的激活而誘導(dǎo)細(xì)胞的衰老。結(jié)論：由癌基因激活而導(dǎo)致的細(xì)胞衰老，是機(jī)體的一種防御機(jī)制。OSM通過(guò)激活STAT3信號(hào)途徑、上調(diào)癌基因c-Myc表達(dá)的同時(shí)，也加速了細(xì)胞的衰老，從而最終表現(xiàn)為對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

肝癌細(xì)胞抑瘤素M細(xì)胞衰老c-Myc增殖

抑瘤素M（oncostatin M，OSM）屬于白細(xì)胞介素-6家族成員，是由活化的T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的一種多功能的細(xì)胞因子［1］。OSM最初是在黑色素瘤中被發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并因此被命名，然而作為一種多功能的細(xì)胞因子，OSM在器官發(fā)育、組織損傷與再生等方面也起到重要的調(diào)控作用［2］。在分子途徑上，OSM通過(guò)與細(xì)胞膜受體gp130結(jié)合，激活下游STAT3、MAPK和PI3K等多種信號(hào)通路［3-4］。因此在不同的環(huán)境下，OSM對(duì)細(xì)胞增殖或分化可能起著不同甚至完全相反的作用。已有研究報(bào)道，在肝癌發(fā)展的早期，血清中OSM含量增高，肝組織中的OSM受體表達(dá)也升高［5-6］，然而這種OSM信號(hào)增強(qiáng)對(duì)腫瘤形成的具體作用亟需進(jìn)一步研究。本研究主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究OSM對(duì)肝癌細(xì)胞的效應(yīng)和機(jī)制，并據(jù)此提出OSM對(duì)早期肝癌的形成可能具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料2012年11月至2015年1月健康對(duì)照組和肝病患者88例均選自天津醫(yī)科大學(xué)第三中心醫(yī)院。其中健康對(duì)照組15例，年齡47（37～59）歲；乙型肝炎患者15例，年齡44（28～56）歲；肝硬化患者15例，年齡45（32～47）歲；肝癌患者43例，年齡54（30～71）歲。

1.1.2 主要試劑肝癌細(xì)胞系（SMMC-7721、HepG2）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所，用DMEM/F12（Gibco，美國(guó)）完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)；主要試劑包括：胰酶（Gibco，美國(guó)）；重組人抑瘤素M（Peprotech，美國(guó)）；鼠抗人單克隆β-actin（sigma，美國(guó)）；兔抗人單克隆p16、p21、p27和c-Myc抗體（Abcam，美國(guó)）；羊抗鼠單克隆抗體、羊抗兔單克隆抗體（cell signal technology，美國(guó)）；TriZol（Invitrogen，美國(guó)）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白示蹤上樣緩沖液（5×）、顯影定影試劑盒（康為世紀(jì)，北京）；PCR引物由北京曼特德曼生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)用人OSM酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（Elabscience）檢測(cè)血清。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將肝癌細(xì)胞系以5×103個(gè)/mL接種在96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，加入不同濃度OSM（2.5、10、50 ng/mL）培養(yǎng)6 d，將其置于長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀察儀（Incu Cyte Zoom，Essen BioScience，美國(guó)）中，每12 h拍照記錄1次細(xì)胞匯合度，生成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.3 免疫印跡提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取25 μg樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上進(jìn)行變性電泳；濕法轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗（1:1 000）后4℃過(guò)夜孵育，洗滌后加入相應(yīng)的二抗（1:4 000），室溫孵育1 h；采用ECL化學(xué)發(fā)光顯色，經(jīng)顯影、定影后掃描條帶。

1.2.4 細(xì)胞周期將肝癌細(xì)胞系以5×103個(gè)/mL接種在6孔板，待其24 h貼壁后，加入10 ng/mL OSM，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，并設(shè)置無(wú)藥對(duì)照組。收集細(xì)胞，PBS洗2次，70%乙醇4℃過(guò)夜固定，然后棄乙醇，PBS洗3次，加入4 μL RNase和0.4 mL碘化丙啶混合液，輕輕吹打混勻細(xì)胞，避光染色20 min，流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACSCanto II，USA）檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

1.2.5RT-qPCRTRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA參照試劑使用說(shuō)明書(shū)。熒光定量PCR反應(yīng)在ViiATM7 96孔板上進(jìn)行，擴(kuò)增體系為25 μL，包含20 μL SYBR Green PCR master mix、1 μL Ex Taq HS、2 μL cDNA模板、正反向引物各1 μL，DEPC水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：95℃3 min預(yù)變性；72℃10 s、95℃15 s、60℃32 s，共40次循環(huán)；PCR引物序列如表1所示；數(shù)據(jù)分析用2-ΔΔT法比較表達(dá)差異。

表1RT-PCR引物序列Table1 Primer sequences of RT‐PCR

1.2.6 衰老相關(guān)-β半乳糖苷酶染色使用衰老相關(guān)-β半乳糖苷酶染色試劑盒（cell signal technology），將培養(yǎng)細(xì)胞以5×103個(gè)/mL接種在6孔板中，用10 ng/mL OSM處理細(xì)胞7 d后加入固定液，在室溫下固定15 min。PBS沖洗培養(yǎng)板2次后，在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1 mL β-半乳糖苷酶染色液，干燥培養(yǎng)箱中37℃過(guò)夜孵育，顯微鏡下觀察染色情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將各組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。正態(tài)分布計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA測(cè)定血清中OSM濃度

利用多個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。然后采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩之間比較，結(jié)果如圖1所示：健康對(duì)照和乙型肝炎患者中的OSM水平無(wú)明顯差異（P=0.852），而在肝硬化、肝癌患者中均顯著升高（P＜0.001）。表明血清中OSM升高在肝癌的進(jìn)程中具有一定的階段特異性。

2.2 OSM抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)

為研究OSM對(duì)肝癌細(xì)胞的作用效應(yīng)，首先用系列濃度（2.5、10.0、50.0 ng/mL）的OSM處理肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HepG2，連續(xù)觀測(cè)6 d細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示OSM可抑制細(xì)胞增殖，并呈一定劑量依賴(lài)性（圖2）。

圖1 不同類(lèi)型肝病患者中血清OSM含量Figure1 OSM levels in the serum of patients with different liver diseases

圖2 OSM處理肝癌細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線(xiàn)Figure2 Growth curve of liver cancer cell lines treated with OSM

2.3 OSM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老

在OSM抑制細(xì)胞增殖的同時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)隨著OSM作用時(shí)間的延長(zhǎng)（3 d以后），隨著細(xì)胞增殖速率下降，其形態(tài)也逐漸發(fā)生變化，開(kāi)始呈現(xiàn)增大和扁平狀、胞質(zhì)內(nèi)顆粒狀物增多等細(xì)胞衰老的特征（圖3A）。進(jìn)一步通過(guò)衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)顯示，在OSM處理7 d的HepG2細(xì)胞中，呈深綠色陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)量明顯增加（圖3B）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，OSM抑制肝癌細(xì)胞增殖主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。

圖3 OSM誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞衰老（×400）Figure3 Senescence‐like characteristics induced by OSM in HepG2 cells (×400)

2.4 OSM阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期

除形態(tài)變化外，衰老細(xì)胞的另一個(gè)重要特征是逐漸退出細(xì)胞周期，永久性停滯于G0期。為分析OSM作用肝癌細(xì)胞后的周期變化趨勢(shì)，用OSM（10 ng/mL）處理SMMC-7721、HepG2細(xì)胞6 d后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果表明，經(jīng)藥物處理過(guò)后G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量升高，而S期的細(xì)胞量減少，即OSM可以將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖（圖4）。

2.5 OSM上調(diào)周期依賴(lài)性激酶抑制劑p21、p27表達(dá)

細(xì)胞周期的阻滯常會(huì)伴隨周期依賴(lài)性激酶（cy?clin-dependent kinases）抑制劑的激活，主要包括p16、p21和p27等蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。本研究中，OSM可促進(jìn)p21和p27在轉(zhuǎn)錄和蛋白兩個(gè)層次都呈現(xiàn)表達(dá)升高，特別是p21的表達(dá)還呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性（圖5）。由于p21是重要抑制基因p53下游的靶基因，p21表達(dá)增高提示OSM可能間接激活p53蛋白的抑癌功能。

圖4 OSM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G0/G1期阻滯Figure4 Prolonged cycle arrest at G0/G1induced by OSM in live cancer cells

圖5 細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)Figure5 Expression of genes regulating cell cycle

2.6 OSM上調(diào)癌基因c-Myc的表達(dá)

細(xì)胞衰老的一個(gè)內(nèi)在因素是癌基因的異常激活，這種形式的衰老也稱(chēng)作癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老（oncogeneinduced senescence）。為了探尋OSM促進(jìn)細(xì)胞衰老的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究分析OSM可能激活的MAPK、STAT3和PI3K信號(hào)途徑，其中癌基因c-Myc是STAT3下游的一個(gè)重要靶基因。進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)OSM處理SMMC-7721和HepG2細(xì)胞，均促進(jìn)了c-Myc蛋白的積累（圖5）和mRNA表達(dá)，且后者的增高程度還呈現(xiàn)一定的OSM劑量依賴(lài)性（圖6）。上述研究結(jié)果提示，OSM處理導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞衰老，可能是細(xì)胞對(duì)癌基因c-Myc激活的應(yīng)答，而這一過(guò)程是通過(guò)p53-p21信號(hào)途徑來(lái)介導(dǎo)的。

圖6 RT-qPCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)Figure6 c‐Myc expression quantified by RT‐qPCR in liver cancer cells

3 討論

抑瘤素M曾因能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)而得名，但隨后的研究逐漸表明，這一細(xì)胞因子的效應(yīng)并非是單一的：對(duì)有些類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為抑制，而對(duì)另一些類(lèi)型則表現(xiàn)為促進(jìn)增殖。這些現(xiàn)象反映出OSM作用機(jī)制的復(fù)雜性，但隨著研究的積累，也發(fā)現(xiàn)OSM這兩種完全相反的效應(yīng)與癌癥的發(fā)展階段或惡性程度具有一定的相關(guān)性?？傮w來(lái)說(shuō)，對(duì)于正常上皮細(xì)胞和一些早期腫瘤，OSM發(fā)揮抗增殖、抑制癌癥進(jìn)展的作用［7］；而對(duì)于惡性程度或轉(zhuǎn)移性較高的腫瘤，OSM表達(dá)的增高卻與不良預(yù)后相關(guān)［8］。這種現(xiàn)象與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）對(duì)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)極為相似［9］。本研究中OSM抑制肝癌增殖中的分子機(jī)制，可以為上述兩種不同效應(yīng)提供一種可能的解釋。

OSM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)，類(lèi)似現(xiàn)象在OSM處理正常乳腺上皮細(xì)胞中也會(huì)出現(xiàn)［10］。引起細(xì)胞衰老的內(nèi)在因素之一是癌基因激活，而OSM所激活STAT3信號(hào)途徑下游一個(gè)重要的癌基因就是c-Myc［11］。c-Myc是促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要轉(zhuǎn)錄因子，而且與Ras癌基因?qū)е录?xì)胞衰老一樣［12］，c-Myc的異常增強(qiáng)表達(dá)同樣可以通過(guò)這一途徑抑制細(xì)胞的增殖［13］。但是，癌基因激活而導(dǎo)致細(xì)胞衰老是需要一定前提條件的。其中一個(gè)最重要的條件就是需要細(xì)胞具有激活p53或（和）Rb這類(lèi)周期負(fù)調(diào)控蛋白的能力［14］。然而對(duì)已處于進(jìn)展期的癌細(xì)胞，這些蛋白的基因往往會(huì)發(fā)生突變或失活。如約50%的癌癥患者中都存在p53的功能喪失。這也就解釋了為何OSM對(duì)于已發(fā)展成為晚期階段的腫瘤大多表現(xiàn)為進(jìn)一步的促進(jìn)增殖。這一機(jī)制在肝癌細(xì)胞中也得到了有力的證實(shí)：OSM抑制正常肝細(xì)胞的增殖，但是如果通過(guò)轉(zhuǎn)入人乳頭瘤病毒（HPV）的E6、E7基因，抑制細(xì)胞的p53和Rb蛋白活性，肝細(xì)胞則會(huì)在OSM刺激下持續(xù)增殖［15］。

本研究對(duì)OSM抑制肝癌細(xì)胞現(xiàn)象和機(jī)制探討，具有兩點(diǎn)臨床意義。首先，如果將肝硬化作為肝癌發(fā)展的前期階段，這一時(shí)期OSM的升高除了作為提示疾病發(fā)展的潛在標(biāo)志物外，同時(shí)在生理上也可能起到抑制早期癌變的作用。其次，OSM雖然在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的抑制，但由于其同時(shí)也激活了癌基因c-Myc的表達(dá)，因此要作為一種治療手段還存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

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（2016‐11‐30收稿）

（2017‐04‐06修回）

（編輯：鄭莉校對(duì)：孫喜佳）

Inflammatory cytokine oncostatin M suppresses growth of liver cancer cells by inducing senescence

Yanyan ZHANG1,Ying LUO2,3,4,Guozhen WU1,Peng WANG2,3,4,Xiaolei JIAO2,3,4,Yayue LI2,3,4,Yingtang GAO2,3,4,Zhengyan ZHU2,3,4,Bin YANG2,3,4

1Clinical School of Tianjin Medical University at Tianjin Third Central Hospital;2Hepatobiliary Disease Institute,Tianjin Third Central Hos‐pital;3Tianjin Key Laboratory of Artificial Cells;4Artificial Cell Engineering Technology Research Center of National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China,Tianjin 300170,China

Zhengyan ZHU;E‐mail:zhuzhengyan59@163.com

Objective:To provide a possible mechanism underlying oncostatin M(OSM)‐induced tumor growth by investigating the ef‐fects on growth of liver cancer cells and its molecular pathway.Methods:Cell growth rates were analyzed after OSM treatment in hu‐man liver cancer cell lines‐SMMC‐7721 and HepG2.Cellular senescence based on growth arrest and morphologic phenotype of cells was detected by senescence‐associated β‐galactosidase(SA‐β‐gal)staining.Cell cycle profile was examined by flow cytometry.The ex‐pression of key regulators of cell proliferation including cyclin‐dependent kinase inhibitors(p16,p21,and p27)and c‐Myc were ana‐lyzed at the level of mRNA and protein.Results:OSM suppressed cell proliferation in a dose‐dependent manner.Upon drug treatment, morphological changes of cells notably implicated a senescent phenotype,which was further supported by the positive SA‐β‐gal stain‐ing.Meanwhile,OSM induced an increased proportion of cells at G0/G1phase,which corresponded to the elevated expression of p21 and p27 at mRNA and protein levels.Unexpectedly,oncogene c‐Myc was also dramatically upregulated upon OSM treatment.Conclusion:As a key regulator of cell proliferation and survival,c‐Myc can be upregulated though the OSM‐activated STAT3 pathway.While in short term,such hyperactive oncogene would induce cellular senescence as a barrier to transformation in cells with intact p53 machin‐ery.These findings suggest that the elevated OSM during the earliest stages of liver cancer might serve as a tumor suppressor.

liver cancer cells,oncostatin M,senescence,c‐Myc,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.08.382

①天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)（天津市300170）；②天津市三中心醫(yī)院，天津市肝膽疾病研究所；③天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；④衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心

*本文課題受天津市科委應(yīng)用基礎(chǔ)與前言技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：15JCQNJC45700，15JCQNJC11500）和天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：12KG107，12KG108）資助

朱爭(zhēng)艷zhuzhengyan59@163.com

This work was supported by the Municipal Key Project of Tianjin Health Bureau(No.112KG107,12KG108)and the Application Founda‐tion and Advanced Technology Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission(No.15JCQNJC45700,15JCQN‐JC11500)

張艷艷專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)研究。

E-mail：yyzhang1113@163.com