右美沙芬對(duì)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用

王俊燕+李玲+張燕+李云鴻+王銀

（1.寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004；2.銀川市第一人民醫(yī)院，寧夏 銀川 750004）

摘要：目的：研究右美沙芬（DM）對(duì)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的作用及熱休克蛋白60（HSP60）在DM神經(jīng)保護(hù)中的作用機(jī)制。方法：培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株，分為對(duì)照組，細(xì)菌脂多糖組，（LPS），實(shí)驗(yàn)組（DM）。Western-blot檢測(cè)DM對(duì)LPS激活的BV2細(xì)胞HSP60和Caspase 3的影響，ELISA檢測(cè)DM對(duì)HSP60釋放的作用。結(jié)果：LPS組中HSP60和Caspase 3的表達(dá)及釋放都比對(duì)照組顯著增加，加入DM后，這些因子的水平都明顯降低。結(jié)論：DM可能通過(guò)HSP60信號(hào)通路途徑阻止小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：熱休克蛋白60；右美沙芬；Caspase 3；小膠質(zhì)細(xì)胞

中圖分類號(hào)：G642.423 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2017）18-0277-02

熱休克蛋白是機(jī)體的一類應(yīng)激蛋白，在生理狀態(tài)下對(duì)機(jī)體起著保護(hù)功能。但是有研究發(fā)現(xiàn)，在病理情況下，很多細(xì)胞會(huì)大量表達(dá)熱休克蛋白60（HSP60），并將其釋放到胞外，引起細(xì)胞凋亡[1]。右美沙芬（Dextromethorphan，DM）是一種右旋嗎啡喃化合物[2]，對(duì)動(dòng)物因低血糖或腦缺血引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，DM被證明能有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并且可抑制細(xì)胞炎癥因子如TNF-α、IL-6，NO和超氧化自由基等[3]，但是右美沙芬的作用機(jī)制目前尚不清楚。

一、材料與方法

（一）材料

右美沙芬和LPS購(gòu)自Sigma公司；HSP60抗體購(gòu)自ENZO公司；Caspase 3及β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；蛋白定量BCA試劑盒購(gòu)自Thermo公司；ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛公司。

（二）方法

1.小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的培養(yǎng)。BV2細(xì)胞培養(yǎng)在DEME培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清。利用1μg/ml LPS處理30min后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入DM溶液（10μM），作用24小時(shí)后收集細(xì)胞及上清。

2.Western blot檢測(cè)蛋白含量。藥物處理完畢，提取各實(shí)驗(yàn)組的蛋白并收集上清液，10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉膜2小時(shí)。然后加入一抗，置于4℃過(guò)夜。利用TBST洗滌膜三次，洗去未結(jié)合的一抗。最后用二抗室溫孵育1 h，利用ECL試劑顯色成像。

3.ELISA試劑盒檢測(cè)HSP60的釋放。按照HSP60 ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，450nm處測(cè)定各孔光密度值（OD）。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS11.11進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用方差分析，進(jìn)一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

二、結(jié)果

（一）DM顯著抑制LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞HSP60的表達(dá)及釋放

LPS激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞中HSP60的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性。加入DM可顯著抑制LPS引起的HSP60的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)上清液進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示DM處理后，LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞HSP60的胞外釋放量明顯地被抑制了。

（二）DM抑制Caspase 3的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中Caspase 3的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，在DM處理的實(shí)驗(yàn)組中，Caspase 3的表達(dá)顯著下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

三、討論

熱休克蛋白是一類應(yīng)激蛋白，對(duì)機(jī)體主要起著保護(hù)作用。但是HSP60對(duì)細(xì)胞凋亡具有雙重作用。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中HSP60的表達(dá)和定位都發(fā)生了改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷或凋亡[4]。但是關(guān)于HSP60在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用的報(bào)道還很少見(jiàn)。

小膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?nèi)缋夏臧V呆癥、帕金森癥等的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究假設(shè)HSP60在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，并被釋放至胞外。胞外的HSP60激活凋亡因子Caspase 3，導(dǎo)致周圍其他神經(jīng)細(xì)胞的損傷或凋亡。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HSP60的表達(dá)顯著增高，胞外也檢測(cè)到HSP60，并增強(qiáng)了Caspase 3的表達(dá)。這些結(jié)果與心肌細(xì)胞中關(guān)于HSP60的研究結(jié)果的報(bào)道一致，說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞活化后釋放至胞外的HSP60可進(jìn)一步激活自身導(dǎo)致自身的凋亡。

右美沙芬可能是一種潛在的治療神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病的藥物[6]。本實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)了DM能有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，為一些神經(jīng)退行性疾病的防治提供了潛在的藥物治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gupta S，Knowlton A A. HSP60，Bax，apoptosis and the heart [R].J Cell Mol Med. 2005，9（1）：51.

[2]Craviso GL and Musacchio JM：High-affinity dextromethorphan binding sites in guinea pig brain. I. Initial characterization [J].Mol Pharmacol. 1983a；23：619–628.

[3]Prince DA and Feeser HR：Dextromethorphan protects against cerebral infarction in a rat model of hypoxia-ischemia [J].Neurosci Lett 1988；85：291-296.

[4]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A. Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis [J].Circ Res，2009；105：1186-1195.

[5]Gonzalez-Scarano F，Baltuch G. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases[J].Annu Rev Neurosci，1999；22：219-40.

[6]Mousavi SA，Saadatnia M，Khorvash F，et al：Evaluation of the neuroprotective effect of dextromethorphan in the acute phase of ischaemic stroke [J].Arch Med Sci. 2011；7：465-469.

收稿日期：2016-11-30

基金項(xiàng)目：2016年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610752010）

作者簡(jiǎn)介：王俊燕（1992-），女（漢族），寧夏銀川人，寧夏醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)本科生；李玲（1973-），女（漢族），寧夏銀川人，?？?，主治醫(yī)師，銀川市第一人民醫(yī)院高壓氧科，主要從事高壓氧神經(jīng)科學(xué)研究；張燕（1992-），女，寧夏銀川人，寧夏醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)本科生；

李云鴻（1972-），男（漢族），副教授，碩士，寧夏醫(yī)科大學(xué)，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究。

通訊作者：王銀（1973-），女（漢族），教授，博士，碩士生導(dǎo)師，寧夏醫(yī)科大學(xué)，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究。