姜黃素聯(lián)合順鉑對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株的影響

郭巍，強(qiáng)亞勇，賀曉龍，汪峰，張斌斌，馬亞東

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，延安 716000)

·基礎(chǔ)研究·

姜黃素聯(lián)合順鉑對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株的影響

郭巍，強(qiáng)亞勇，賀曉龍，汪峰，張斌斌，馬亞東

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，延安 716000)

目的 觀察姜黃素聯(lián)合順鉑(DDP)對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株抗腫瘤活性作用的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 采用MTT法檢測(cè)姜黃素單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株的抑制率；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度姜黃素和順鉑單藥、聯(lián)合處理后對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株凋亡率變化；RT-PCR檢測(cè)姜黃素單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株作用后P53的mRNA蛋白表達(dá)。結(jié)果 不同濃度的姜黃素組隨著藥物濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組明顯高于單一用藥組(P<0.05)，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用；姜黃素和順鉑均促進(jìn)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株凋亡，聯(lián)合用藥可顯著增加凋亡率；RT-PCR結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組能使P53 mRNA蛋白表達(dá)水平較單藥組上升。結(jié)論 姜黃素對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞株具有生長(zhǎng)抑制作用，且具有劑量和時(shí)間依賴性，其與順鉑聯(lián)合具有協(xié)同抑制作用，其協(xié)同作用可能與上調(diào)P53 mRNA表達(dá)有關(guān)。

前列腺腫瘤；順鉑；姜黃素；細(xì)胞凋亡

前列腺癌于60歲開始出現(xiàn)發(fā)病高峰，而我國(guó)人口老齡化持續(xù)增長(zhǎng)與代謝綜合征異常(肥胖、高血糖、高血壓等)兩大因素導(dǎo)致在未來的10年內(nèi)前列腺癌的發(fā)病率將逐步升高[1-2]。前列腺癌患者的生存率與疾病的臨床分期和治療方法有關(guān)，在我國(guó)，初診前列腺癌的患者僅有1/3為局限性病變[3]，造成手術(shù)治愈率不高。順鉑(DDP)是傳統(tǒng)抗腫瘤藥物，抗癌作用強(qiáng)但不良反應(yīng)明顯，易出現(xiàn)耐藥性。尋找到毒性低、抗癌作用強(qiáng)，并能與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物起到協(xié)同作用的藥物，在治療前列腺癌發(fā)面具有良好的前景。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株購自上海拜力生物公司。RPMI-1640培養(yǎng)基與胎牛血清購自GIBCO公司，姜黃素、MTT、DMSO及PI購自美國(guó)Sigma公司，Trizol與AnnexinV FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物公司，P53引物由北京三博遠(yuǎn)志生物公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 人前列腺癌PC-3細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)分組：(1)對(duì)照組：加5%血清培養(yǎng)液(2)單藥實(shí)驗(yàn)組：姜黃素的濃度分別為5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L，DDP的濃度分別為0.5、1、2、4 μg/mL。(3)聯(lián)合組：姜黃素濃度為2.5 μmol/L不變，聯(lián)合單藥濃度DDP。(4)空白組：在無細(xì)胞的孔中加5%培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔，溫育24 h、48 h。

1.2.2 MTT法 用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人前列腺癌PC-3細(xì)胞，以每孔為3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后分組。每孔加入濃度為5 mg/mL MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h。吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度值，空白組調(diào)零。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。采用金正均法判斷聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同作用，公式：q=(Ea+b)〔Ea+(1-Ea)/Eb〕。公式中(Ea+b)為聯(lián)合用藥的抑制率，Ea、Eb分別為DDP和姜黃素單藥的抑制率。q=0.85-1.15表示兩藥作用相加，q<0.85表示兩藥有拮抗作用，q>1.15表示兩藥有協(xié)同作用。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將PC-3細(xì)胞制成細(xì)胞懸液以2×105mL-1的密度接種6孔板內(nèi)并分4組，對(duì)照組加5%血清培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組為姜黃素組(5.0 μmol/L)、DDP組(1.0 μg/mL)及姜黃素與DDP聯(lián)合組。藥物作用48 h后收集細(xì)胞，嚴(yán)格遵守凋亡檢測(cè)試劑盒內(nèi)染色步驟染色，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 按照Trizol試劑盒說明書操作抽提實(shí)驗(yàn)組處理48 h的PC-3細(xì)胞總RNA,并合成cDNA于-80 ℃保存。按照RT-PCR試劑盒步驟操作并分析相對(duì)含量值。P53蛋白相對(duì)定量值為P53與β-actin灰度值的比值。引物序列、大小及退火溫度見表1。

表1 被檢測(cè)基因所使用的引物序列

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組相比，不同濃度的姜黃素、DDP對(duì)PC-3細(xì)胞作用24 h、48 h后均有抑制作用，PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用隨著姜黃素、順鉑藥物濃度增加，作用時(shí)間延長(zhǎng)，其產(chǎn)生的抑制作用越明顯，呈現(xiàn)出時(shí)間、劑量依賴性關(guān)系。不同濃度組、不同時(shí)間組之間抑制率相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。5.0 μmol/L 的姜黃素與不同濃度的DDP聯(lián)用均對(duì)PC-3細(xì)胞的增值有抑制作用，其聯(lián)合用藥組抑制作用明顯強(qiáng)于單藥組(P<0.01)，按照聯(lián)合用藥公式推算，姜黃素與DDP聯(lián)合q均大于1.14，兩者之間呈協(xié)同作用。

表2 不同濃度的姜黃素和順鉑對(duì)PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)的 抑制率

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；同一試劑濃度內(nèi)，與24 h時(shí)比較，bP<0.05

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，對(duì)照組PC-3細(xì)胞凋亡率為1.53%；姜黃素組、DDP組單藥作用PC-3細(xì)胞24 h的凋亡率分別為5.45%、9.66%(P<0.05)；而姜黃素 5.0 μmol/L與DDP 1.0 μmol/L 聯(lián)合作用24 h的凋亡率明顯升高，為28.39%(P<0.05)。聯(lián)合用藥后，可形成明顯的凋亡峰，顯著高于單藥組，表明姜黃素、DDP均可以有效誘導(dǎo)PC-3的凋亡率，在PC-3細(xì)胞中姜黃素與DDP存在協(xié)同作用。

2.3 RT-PCR檢測(cè)P53的mRNA表達(dá) 姜黃素誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞48 h后，P53蛋白對(duì)照組、姜黃素單藥組、DDP單藥組與聯(lián)合組的相對(duì)定量值為0.204、0.342、0.350和0.598。聯(lián)合組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，單藥組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示姜黃素與順鉑聯(lián)合能一定程度上能上調(diào)P53基因mRNA表達(dá)。

3 討論

姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種色素，具有多種藥理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過清除羥基自由基、清除過氧化反應(yīng)活性的自由基和增強(qiáng)抗氧化酶活性、減輕氧化應(yīng)激損傷等途徑來實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[4]；通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子、環(huán)氧化酶-2、干擾素等炎性介質(zhì)和調(diào)控皮質(zhì)類固醇途徑來實(shí)現(xiàn)抗炎作用[5-7]；通過對(duì)總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇成分的影響降低血脂及血糖[8-9]；可以抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化和誘導(dǎo)受損肝細(xì)胞凋亡來阻止肝纖維化的發(fā)生[10]；通過降低p300/CBP和乙?；M蛋白H3/乙?；M蛋白H4的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)性疼痛治療中發(fā)揮了積極作用[11]；可以產(chǎn)生有效的神經(jīng)保護(hù)作用防止由于脊髓損傷[12]；通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路和腫瘤相關(guān)因子發(fā)揮抗癌作用，并能增強(qiáng)化療藥物和放療的敏感性[13]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞[14]、胃癌細(xì)胞[15]、人成骨肉瘤細(xì)胞[16]等實(shí)驗(yàn)中都具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用。順鉑是一種廣譜的傳統(tǒng)抗癌藥物，在臨床應(yīng)用殺腫瘤細(xì)胞效果好，但治療中不僅不良反應(yīng)大，而且易產(chǎn)生耐藥性[17-18]。其通過兩方面導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[19]：(1)防止鉑類藥物與脫氧核糖核酸(DNA)的結(jié)合，從而防止腫瘤細(xì)胞DNA的破壞。(2)修復(fù)系統(tǒng)對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)并且腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)制的發(fā)生，使一直被破壞的細(xì)胞仍然不被殺滅。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素及順鉑對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制增殖的作用，并且對(duì)時(shí)間、劑量具有明顯的依賴性。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，姜黃素聯(lián)合順鉑可以對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞下調(diào)keapl-nrf2通路，使抗腫瘤作用增強(qiáng)[20]。本次研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合順鉑抑制PC-3細(xì)胞增殖起協(xié)同增效作用。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素的抗癌作用與對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)密不可分[21-22]。姜黃素促進(jìn)凋亡可能機(jī)制與姜黃素可以激活caspase-3、caspase-8、caspase-9[23]、調(diào)控Bax/Bcl-2比值[24]，并釋放細(xì)胞色素C等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素與順鉑兩藥聯(lián)合后，凋亡率明顯高于單藥組和對(duì)照組，表明姜黃素可以協(xié)同增強(qiáng)順鉑對(duì)PC-3細(xì)胞的凋亡途徑。

P53蛋白是一種可以抑制細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用有[25]：(1)對(duì)細(xì)胞周期的G1期和G2/M期有阻止作用；(2)可以調(diào)控Bax/ Bcl-2、Fas/Apol等蛋白影響細(xì)胞凋亡；(3)參與DNA重組和修復(fù)功能。Binhua等[26]學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素作用肺癌A549細(xì)胞48 h后，能夠調(diào)節(jié)P53，Bax、Bcl-2，Caspase-3的表達(dá)水平，抑制肺癌細(xì)胞的增殖；Weir等[27]學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素通過激活Caspase-3、 PARP降解、促進(jìn)p53的磷酸化和細(xì)胞凋亡來抑制順鉑耐藥的人卵巢癌細(xì)胞的增殖；另有馮冰霜等[28]發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合順鉑可能通過增加p53基因的表達(dá)來增加宮頸癌Hela細(xì)胞化療敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素與順鉑兩藥聯(lián)合后與單藥相比，可以協(xié)同增強(qiáng)促凋亡基因P53的表達(dá)，提示姜黃素可能通過P53途徑調(diào)節(jié)PC-3細(xì)胞的增殖、凋亡作用和提高順鉑的敏感性。

姜黃素有多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤免疫和腫瘤藥物耐受有著密切的關(guān)系，對(duì)傳統(tǒng)化療藥來說可能是一種可靠的增敏藥。

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The influence of Curcumin combined with Cisplatin on human prostate cancer cell line PC-3

GuoWei,QiangYayong,HeXiaolong,WangFeng,ZhangBinbin,MaYadong

(DepartmentofUrology，theAffiliatedHospitalYan′anUniversity，Yan′an716000,China)

Objective To observe the effect of Curcumin combined with Cisplatin (DDP) on human prostate cancer cell line PC-3 and explore the mechanism.Methods MTT assay was used to detect the inhibition rate of Curcumin alone or combination with Cisplatin on human prostate cancer cell line PC-3.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate.RT-PCR method was used to analyze the mRNA expression level of p53.Results The cell inhibition rate increased with the increase of concentration and action time of Curcumin.The effect of the combined treatment group was significantly higher than that of each single medication group (P<0.05).The combination had a synergistic effect.Both Curcumin and Cisplatin induced the apoptosis of human prostate cancer cell line PC-3,and the combination could significantly increase the apoptosis rate (P<0.05).RT-PCR results showed that the expression level of P53 mRNA was increased more in the combination group compared with that in the single drug group (P<0.05).Conclusion Curcumin can inhibit the growth of human prostate cancer cell line PC-3 with a dose- and time-dependent manner.The combination with Cisplatin have a synergistic inhibitory effect,which may be related to the upregulation of P53 expression.

Prostatic neoplasms；Cisplatin；Curcumin；Apoptosis

郭巍，副主任醫(yī)師，Email：15756560@qq.com

R737.25

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.02.019

2016-05-26)