多指標(biāo)正交試驗優(yōu)化復(fù)方紅景天顆粒的提取工藝Δ

劉慶煥，王 宏，張 婷，張 巖，王文彤，陶遵威（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

多指標(biāo)正交試驗優(yōu)化復(fù)方紅景天顆粒的提取工藝Δ

劉慶煥＊，王 宏，張 婷，張 巖，王文彤，陶遵威#（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

目的：優(yōu)化復(fù)方紅景天顆粒的藥材提取工藝。方法：以藥效學(xué)指標(biāo)（學(xué)習(xí)記憶能力）對小鼠進行Y型水迷宮實驗，篩選復(fù)方紅景天顆粒藥材的水提、水提醇沉及醇提方法；以紅景天苷、阿魏酸提取量及出膏率的綜合評分為指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)化醇提工藝中乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溶劑用量和提取次數(shù)，并進行驗證試驗。結(jié)果：3種提取方法中以醇提方法所得產(chǎn)物對改善學(xué)習(xí)記憶能力效果最好；最優(yōu)醇提工藝為8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.0 h。驗證試驗中紅景天苷、阿魏酸的提取量及出膏率平均值分別為4.884mg/g、1.669mg/g、33.52%（RSD均小于2%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可靠、簡便、易行，可用于復(fù)方紅景天顆粒的工業(yè)化提取。

復(fù)方紅景天顆粒；提取工藝；藥效指標(biāo)；小鼠；紅景天苷；阿魏酸；正交試驗

提取工藝研究是中藥復(fù)方開發(fā)的關(guān)鍵步驟，傳統(tǒng)上僅以指標(biāo)成分含量高低來衡量提取工藝的優(yōu)劣是不全面的，結(jié)合相關(guān)藥效學(xué)指標(biāo)對工藝進行優(yōu)化的文獻報道逐漸增加[1-3]。阿爾茨海默?。ˋ lzheimer disease，AD）在中醫(yī)學(xué)中稱“呆病”，是一種以記憶和認(rèn)知功能進行性損害為特征的疾病，目前已成為嚴(yán)重威脅老年人生命健康和生活質(zhì)量的主要疾病之一[4]。復(fù)方紅景天顆粒為天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所在研的復(fù)方六類新藥，由紅景天、川芎、三七、遠志等6味中藥組成，具有益氣活血、化痰開竅的功效，主要用于治療氣虛血瘀、痰瘀阻絡(luò)之呆癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中君藥主要成分紅景天苷可改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶受損，通過綜合抗氧化應(yīng)激效應(yīng)起到治療AD的作用[5]；臣藥川芎主要成分阿魏酸對β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的AD模型細(xì)胞具有保護作用[6]。為確定復(fù)方紅景天顆粒合理的提取工藝，保證制劑質(zhì)量和療效，筆者首先通過AD模型小鼠藥效試驗篩選出提取方法，再以紅景天苷、阿魏酸的提取量及出膏率為評價指標(biāo)，以層次分析法（AHP）[7]確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)進行綜合評分，采用正交設(shè)計優(yōu)化提取方法的工藝參數(shù)，為該新藥后續(xù)制劑工藝研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB135-S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ520B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）。

1.2 動物

KM小鼠，♀♂各半，18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動物試驗中心提供，合格證號：SCXK-（軍）2014-0001。

1.3 藥材、對照品與試劑

紅景天、川芎、三七等藥材均購于天津市中藥飲片廠有限公司（批號：1409126、1509102、1508101），經(jīng)天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所夏光成研究員鑒定符合2015年版《中國藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定；氫溴酸東莨菪堿注射液（以下簡稱東莨菪堿，天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，批號：1501011，規(guī)格：0.3mg/m L）；紅景天苷、阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110818-201507、110773-201313，純度：99.8%、99.6%）；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥效學(xué)指標(biāo)篩選提取方法

2.1.1 3種提取方法樣品的制備 根據(jù)處方藥味有效成分的理化性質(zhì)，最終選取水提、水提醇沉、醇提等3種提取方法。按處方比例稱取紅景天、川芎、三七等藥材共3份，每份100 g。（1）水提組：投料后加入8倍量水，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮至含生藥量為0.3 g/m L。（2）水提醇沉組：投料后加入8倍量水，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮至比重為1.1（60℃），放冷；加入等量乙醇，充分?jǐn)嚢韬螅荛]冷藏24 h，濾過，濾液回收乙醇，加水稀釋至0.3 g/m L。（3）醇提組：投料后加8倍量70%乙醇，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮至無醇味后加水稀釋至0.3 g/m L，備用。

2.1.2 不同提取方法樣品對東莨菪堿所致記憶障礙模型小鼠的影響 參考文獻[8-9]方法進行Y型水迷宮實驗。取50只小鼠，每只小鼠第1天訓(xùn)練10次，第2天測試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，記錄10次中一次性到達目的地的次數(shù)及所需時間。依測試成績均衡隨機分為對照組、模型組、水提組、水提醇沉組、醇提組，各組均ig給藥，根據(jù)臨床等效劑量折算，3個提取方法組給藥劑量均為3 g/kg（以生藥計），對照組和模型組ig給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。給藥第7天起進行行為學(xué)測試，每天測試前1 h給藥。測試前30min除對照組ip注射生理鹽水外，其余各組均ip東莨菪堿2mg/kg造模。第7天進行訓(xùn)練，先將小鼠放在起始區(qū)，用玻璃棒引導(dǎo)到終點區(qū)的出水臺階上，訓(xùn)練10次；第8～10天分組測試（不引導(dǎo)），記錄成績。以小鼠第8、9、10天一次性正確到達目的地的次數(shù)及所需時間（逃避潛伏期）的平均值作為學(xué)習(xí)記憶能力的考察指標(biāo)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠水迷宮實驗結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Results of water maze test of m ice in each group ofm ice（±s，n＝10）

表1 各組小鼠水迷宮實驗結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Results of water maze test of m ice in each group ofm ice（±s，n＝10）

注：與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.controlgroup，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.modelgroup，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組模型組水提組水提醇沉組醇提組10d 7.50±0.83 5.12±1.07##6.50±1.48＊6.03±1.45 6.75±1.31＊＊小鼠逃避潛伏期，s 8d 6.20±0.87 7.55±1.23#6.38±1.11＊7.53±1.05 6.14±1.57＊9d 5.85±1.14 7.94±1.43##6.42±1.29＊8.04±1.12 5.90±1.68＊10d 5.56±1.81 7.90±1.61##6.08±1.85＊7.77±2.02 5.58±1.47＊＊小鼠正確到達目的地的次數(shù)8d 7.33±0.82 5.58±0.75##6.67±1.49 6.25±1.55 6.77±1.25＊9d 7.25±0.99 5.00±1.05##6.50±1.48＊6.17±1.59 6.58±1.42＊

由表1可以看出，第8～10天，與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05或P＜0.01），正確到達目的地的次數(shù)顯著減少（P＜0.01），提示該造模方法成功。與模型組比較，水提組與醇提組均能顯著縮短小鼠逃避潛伏期（P＜0.05或P＜0.01）；水提組除第8天外，其余各檢測時間點小鼠正確到達目的地的次數(shù)顯著增加（P＜0.05）；醇提組第8～10天時小鼠正確到達目的地的次數(shù)均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；水提醇沉組的逃避潛伏期與正確到達目的地的次數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜合考慮，醇提組改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力效果更好，故正交試驗中對該提取方法的條件進行優(yōu)化。

2.2 提取方法指標(biāo)的考察

2.2.1 紅景天苷、阿魏酸的含量測定 （1）色譜條件。參考文獻[10]條件。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A為甲醇-水（15∶85），檢測波長為223 nm（紅景天苷）；流動相B為甲醇-1%醋酸水溶液（30∶70），檢測波長為321 nm（阿魏酸）；流速為1.0m L/min；柱溫為30℃；進樣量為10μL。（2）對照品溶液的制備。精密稱取紅景天苷和阿魏酸對照品適量，加70%甲醇制成二者質(zhì)量濃度分別為202.6、32.08μg/m L的對照品貯備液。分別精密量取5m L貯備液置于10m L量瓶中，加70%甲醇制成二者質(zhì)量濃度分別為101.3、16.04μg/m L的對照品溶液。（3）供試品溶液的制備。分別精密吸取正交試驗所得1～9號提取液各5m L，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，用70%甲醇將殘渣轉(zhuǎn)移至10m L量瓶中并定容至刻度，過0.45μm微孔濾膜，即得，記為供試品溶液S1～S9。（4）陰性樣品溶液的制備。按處方比例分別稱取除紅景天、川芎的藥材共2份，按供試品溶液制備方法分別制成不含紅景天陰性樣品溶液、不含川芎陰性樣品溶液。（5）專屬性考察。分別吸取上述“（2）～（4）”項下溶液，進樣測定，結(jié)果供試品色譜在與對照品色譜在相同的保留時間處出峰，陰性樣品無干擾。各峰之間分離度均大于1.5。（6）線性關(guān)系及定量限考察。按相關(guān)方法進行操作，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制紅景天苷和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算二者的回歸方程分別為y＝13 307.6x+26 690（r＝0.999 7）、y＝53 861.5x－6 724（r＝1.000 0），檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為20.26～202.6、3.208～32.08μg/m L，定量限分別為0.68、0.21μg/m L。（7）精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度考察。按相關(guān)方法進行考察。結(jié)果精密度試驗中紅景天苷與阿魏酸峰面積的RSD分別為0.65%、0.34%（n＝6）；24 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗中二者含量的RSD分別為0.54%、0.42%（n＝6）；重復(fù)性試驗中二者含量的RSD分別為1.71%、0.86%（n＝6）；準(zhǔn)確度試驗中二者的平均加樣回收率分別為97.98%、98.02%（RSD分別為1.43%、1.01%，n＝6）。

2.2.2 出膏率測定 參考文獻[11]方法測定。精密吸取提取液20.0m L，置于已恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥至恒質(zhì)量，置于干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算出膏率（出膏率＝干膏質(zhì)量×25/藥材質(zhì)量×100%）。

2.2.3 提取量的計算 根據(jù)公式（提取量＝提取液中指標(biāo)成分含量×提取液體積/投料藥材質(zhì)量）計算出每1 g紅景天/川芎中紅景天苷/阿魏酸的提取量。

2.2.4 綜合評分指標(biāo)的確定 根據(jù)復(fù)方“君臣佐使”配伍規(guī)律，參照文獻[7]采用層次分析法對紅景天苷、阿魏酸提取量和出膏率3項指標(biāo)建立綜合權(quán)重，計算歸一化權(quán)重系數(shù)分別為0.581 5、0.309 0、0.109 5，隨機一致性比率（CR）為0.003 1＜0.1，表明3項指標(biāo)優(yōu)先比較矩陣滿足一致性要求，其相應(yīng)求得的權(quán)重有效。最終得到的綜合評分公式為：綜合評分＝（紅景天苷提取量/紅景天藥材中紅景天苷含量）×100×0.581 5+（阿魏酸提取量/川芎藥材中阿魏酸含量）×100×0.309 0+（出膏率/最大出膏率）×100×0.109 5。在此公式中，采用《中國藥典》方法測得2種藥材中有效成分的含量分別為5.45、1.98mg/g。

2.3 正交試驗設(shè)計優(yōu)化醇提法工藝

2.3.1 因素與水平的確定 在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，以綜合評分為指標(biāo)，對醇提法中的乙醇體積分?jǐn)?shù)（A，%）、提取時間（B，h）、溶劑倍數(shù)（C）、提取次數(shù)（D）進行考察，因素與水平見表2。

表2 因素與水平Tab 2 Factorsand levels

2.3.2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果 按處方比例稱取紅景天、川芎等藥材共9份，每份100 g，按照正交試驗設(shè)計進行試驗，合并提取液，濾過，濾液濃縮，定容至500m L，記為1～9號，每項試驗重復(fù)2次。由于正交表中4個因素均填滿，故進行重復(fù)試驗并以第二類離差作為誤差估計值進行方差分析。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3直觀分析可知，各因素對提取效果影響大小為D＞C＞B＞A；表4結(jié)果表明，因素C、D對試驗結(jié)果具有極顯著影響，因素A、B對試驗結(jié)果無顯著影響。綜合考慮實際生產(chǎn)情況及各水平間的差距，最終確定最優(yōu)提取工藝為A2B1C2D3，即8倍量70%的乙醇提取3次，每次1.0 h。

2.3.3 驗證試驗 按處方比例稱取藥材3份，每份100 g，加8倍量70%乙醇提取3次，每次1.0 h，測定提取液中紅景天苷、阿魏酸的提取量及出膏率。結(jié)果紅景天苷和阿魏酸的平均提取量分別為4.884、1.669mg/g，平均出膏率為33.52%，RSD分別為0.49%、1.93%、1.69%（均小于2%，n＝3），提示優(yōu)化的工藝穩(wěn)定、可行。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 3 Design and resultof orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Resultsof varianceanalysis

3 討論

3.1 含量測定方法

在處理供試品溶液時，若在測定指標(biāo)成分含量時直接用提取液進樣，由于溶劑效應(yīng)導(dǎo)致峰變寬、分離效果差。故宜將提取液蒸干后用70%甲醇溶解，既能保證浸膏可全部溶解，又能避免溶劑效應(yīng)。在測定紅景天苷與阿魏酸的含量時，筆者曾考慮同時測定二者含量。但由于阿魏酸為酸性成分，需在流動相中加酸以避免峰拖尾，而當(dāng)使用含酸流動相時，紅景天苷與方中極性大的成分的色譜峰難以達到基線分離；此外，二者的含量差異較大，故參照2015年版《中國藥典》分別對二者進行測定，經(jīng)方法學(xué)驗證表明該法簡便、易行、重復(fù)性好。

3.2 考察指標(biāo)的確定

紅景天和川芎作為本方的君藥和臣藥，其有效成分紅景天苷和阿魏酸對AD模型具有保護作用[5-6]。以紅景天為主的復(fù)方制劑的提取大多僅以紅景天中的成分為指標(biāo)，同時考慮其他藥味成分的較少[12]。在前期試驗中，筆者對復(fù)方紅景天顆粒3種提取方法中的指標(biāo)成分的提取率進行了考察，其結(jié)果與本文小鼠水迷宮實驗的結(jié)果一致，即醇提組優(yōu)于水提組并優(yōu)于水提醇沉組，表明所選取的指標(biāo)成分是本方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成部分。

在正交試驗設(shè)計中采用層次分析法對紅景天苷、阿魏酸的提取量以及出膏率3個指標(biāo)賦權(quán)重并進行綜合評分來優(yōu)化醇提工藝參數(shù)，體現(xiàn)了復(fù)方配伍特點。

綜上，本文對提取工藝的優(yōu)化研究兼顧了藥效與指標(biāo)成分的提取效率，較單純以成分為指標(biāo)進行評價更為合理。最終優(yōu)化的提取工藝中紅景天苷和阿魏酸的提取量均較高，表明優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可行。建立的提取工藝可為該制劑的進一步開發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)，同時也為以紅景天、川芎為基本組方的制劑的提取工藝研究提供了參考。

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Optim ization of Extraction Technology of Compound Rhodiolae crenulatae Granule by M ulti-index Orthogonal Test

LIU Qinghuan，WANG Hong，ZHANG Ting，ZHANG Yan，WANG Wentong，TAO Zunwei（Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China）

OBJECTIVE：To optim ize the extraction technology of Compound Rhodiolae crenulatae granule.METHODS：The pharmacodynam ic index of learning and memory ability was used to screen the water extraction，water extraction and alcohol precipitation and alcohol extractionmethods for Compound R.crenulatae granule inmice by Y-type watermaze test.Using the comprehensive scores of salidroside，ferulic acid extraction amount and extraction yield as indexes，orthogonal test was used to optim ize the ethanol volume fraction，extraction time，solvent amount and extraction times，and verification testwas conducted.RESULTS：Products by alcohol extraction can significantly improve learning and memory ability in the 3 methods；the optimal extraction tech-nology was confirmed to 8-fold 70%ethanol reflux extracting for 3 times，1.0 h each time.In verification test，average extraction amount of salidroside and ferulic acid were 4.884 mg/g and 1.669 mg/g，and average extraction yield was 33.52%（all RSD＜2%，n＝3）.CONCLUSIONS：The optim ized extraction technology is stable，reliable，simple and feasible，which can be used for industrial extraction of Compound R.crenulatae granule.

Compound Rhodiolae crenulatae granule；Extraction technology；Efficacy index；M ice；Salidroside；Ferulic acid；Orthogonal test

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1830-04

2016-08-14

2016-10-24）

（編輯：劉 萍）

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃資助項目（No.14JCYBJC28700）

＊助理研究員，碩士研究生。研究方向：中藥制劑與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：liuqinghuan@126.com

#通信作者：研究員，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥物化學(xué)與新藥研發(fā)。E-mail：taozunweitj@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.29