半仿生酶法提取柿葉中總黃酮的工藝篩選及優(yōu)化Δ

薛璇璣，羅 俊，張新新，錢春香，趙 晶，郭增軍（西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061）

·制劑與工藝·

半仿生酶法提取柿葉中總黃酮的工藝篩選及優(yōu)化Δ

薛璇璣＊，羅 俊，張新新，錢春香，趙 晶，郭增軍#（西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061）

目的：篩選提取柿葉中黃酮的方法及最優(yōu)提取工藝。方法：以浸膏質(zhì)量、黃酮含量為指標(biāo)，比較乙醇回流法、酶法（纖維素酶、β-葡聚糖酶及二者等量混合組成的復(fù)合酶）、半仿生法和半仿生酶法（同前3種酶）提取柿葉中總黃酮的效果。以黃酮含量為指標(biāo)，以料液比、回流溫度和回流時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化半仿生酶法提取柿葉中黃酮的工藝條件，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：在4種提取方法中，以半仿生酶法得到的浸膏質(zhì)量和黃酮含量最高，并以復(fù)合酶效果最好；優(yōu)化的半仿生酶法提取工藝條件為料液比1∶14、回流溫度50℃、回流時(shí)間2.0 h；驗(yàn)證試驗(yàn)中3次黃酮提取率分別為5.9%、5.8%、5.9%（RSD＝0.98%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化后的半仿生酶法提取柿葉中黃酮，提取率高且工藝穩(wěn)定。

半仿生酶法；柿葉；黃酮；提??；正交試驗(yàn)；工藝優(yōu)化

柿葉為柿樹科柿樹屬植物柿（Diospryros kaki L.f.）的新鮮或干燥的葉，具有生津止渴、清熱解毒、潤(rùn)肺強(qiáng)心、鎮(zhèn)咳止血等功效[1-2]。柿葉中含有黃酮類、三萜類以及維生素類等成分，其中黃酮類為其主要成分，包括目前已發(fā)現(xiàn)的黃芪苷、紫云苷、異槲皮苷、槲皮素、異槲皮素、山柰酚、楊梅樹皮苷、蘆丁、金絲桃苷等[3-4]。近年來(lái)，黃酮類化合物因有降脂、抗血栓、抗心律失常等藥理作用，而且具有毒性低、資源豐富、易于工業(yè)化提取制備等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地用于醫(yī)藥食品等行業(yè)，極具開發(fā)價(jià)值[5]。

傳統(tǒng)提取黃酮類化合物的方法主要包括水煎煮法、堿提酸沉法和浸漬法，這些方法存在工作量大且提取率不高的不足[6]。如果在提取前加入合適的酶（果膠酶、纖維素酶等）對(duì)藥材進(jìn)行處理，可通過(guò)其溶解細(xì)胞壁組成成分果膠和纖維素來(lái)破壞藥材細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有效地加快提取進(jìn)程，提升提取效率[7]。半仿生酶法即是在酶法的基礎(chǔ)上，融入了半仿生法的優(yōu)勢(shì)，在模擬胃腸道環(huán)境的過(guò)程中，促進(jìn)中藥中活性成分的富集[8-9]。

目前，關(guān)于柿葉中總黃酮提取的文獻(xiàn)報(bào)道較多[2，10-12]，但對(duì)采用不同酶進(jìn)行提取的比較研究較少，且尚未有采用半仿生酶法提取的報(bào)道。為深入研究柿葉中總黃酮的提取工藝，提高其提取率，筆者以浸膏質(zhì)量和總黃酮含量為指標(biāo)[13-14]，對(duì)比分析了乙醇回流法、酶法、半仿生法及半仿生酶法對(duì)柿葉總黃酮的提取率；并以提取溫度、時(shí)間和料液比作為3個(gè)考察因素，采用正交試驗(yàn)考察半仿生酶法提取柿葉總黃酮的最優(yōu)工藝條件[15]，為柿葉總黃酮的提取提供一種新的高效方法。

1 材料

1.1 儀器

HH-恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；EYEL4系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；101-2干燥箱（上海昕?jī)x儀器儀表有限公司）；紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；AE240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ3200B超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

柿葉（2014年8月采自陜西藍(lán)田縣，經(jīng)本課題組郭增軍教授鑒定為柿樹科柿樹屬植物柿樹的干燥葉）；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707，純度：98%）；纖維素酶、β-葡聚糖酶（和氏璧生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GB11.006，酶活力：均為30 000 U/g）、復(fù)合酶（取纖維素酶、β-葡聚糖酶等量混勻自配）；95%乙醇、10%硝酸鋁溶液、5%亞硝酸鈉溶液、4%氫氧化鈉溶液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液均為分析純、自配；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 柿葉中總黃酮的提取

[7]方法提取。

2.1.1 乙醇回流法 取粉碎后的柿葉約5 g置于圓底燒瓶中，加入10倍量的70%乙醇，70℃加熱回流1 h，過(guò)濾；濾渣加入8倍量的70%乙醇，加熱回流2次，每次1 h，合并濾液；回收溶劑并于80℃真空干燥，得干浸膏。

2.1.2 酶法 取粉碎后的柿葉約5 g置于圓底燒瓶中，加入復(fù)合酶0.025 0 g[7]，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液50m L，調(diào)節(jié)pH為3.6左右，50℃水浴中酶解2 h，過(guò)濾；藥渣加入50m L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，70℃回流3次，每次1 h，合并濾液；回收溶劑并于80℃真空干燥，得干浸膏。

換用纖維素酶和β-葡聚糖酶重復(fù)操作，分別得干浸膏。

2.1.3 半仿生法 取粉碎后的柿葉約5 g置于圓底燒瓶中，加入50m L pH為2.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液為提取液，70℃下回流提取1 h，過(guò)濾；濾渣加入50m L pH為7.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液為提取液，70℃下回流提取1 h，過(guò)濾；濾渣加入50m L pH為8.3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液為提取液，70℃下回流提取1 h，過(guò)濾；合并3次濾液，回收溶劑并于80℃真空干燥，得干浸膏。

2.1.4 半仿生酶法 取粉碎后的柿葉約5 g置于圓底燒瓶中，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液50m L為浸取劑，調(diào)節(jié)pH為2.0，混勻，70℃水浴中回流1 h，過(guò)濾；濾渣加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為3.6，加入復(fù)合酶0.025 0 g，混勻，50℃水浴中浸泡2 h，過(guò)濾；濾渣加入50m L pH為7.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液為提取液，70℃下回流提取1 h，過(guò)濾；濾渣加入50m L pH為8.3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液為提取液，70℃下回流提取1 h；合并濾液，回收溶劑并于80℃真空干燥，得干浸膏。

換用纖維素酶和β-葡聚糖酶重復(fù)操作，分別得干浸膏。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

黃酮含量測(cè)定采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法。其原理是黃酮類化合物經(jīng)亞硝酸鈉還原后，與硝酸鋁絡(luò)合生成穩(wěn)定的紅橙色化合物，此化合物在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，然后以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)測(cè)定吸光度（A）計(jì)算含量[14]。

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取蘆丁對(duì)照品0.010 3 g置于50m L量瓶中，以60%乙醇溶液溶解定容，得質(zhì)量濃度為0.206mg/m L的蘆丁對(duì)照品溶液。依次取對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0m L至25m L量瓶中，分別每隔6m in加入5%亞硝酸鈉溶液1.0m L、10%硝酸鋁溶液1.0m L、4%氫氧化鈉溶液10.0m L，再以60%乙醇溶液定容。靜置15min后，在波長(zhǎng)為510 nm下測(cè)定A。以質(zhì)量濃度（c，mg/m L）為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝14.372c－0.007 6（R2＝0.999 6），得蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為8.24～57.68μg/m L。

2.2.2 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)。精密量取供試品溶液5m L至25m L量瓶中，同“2.2.1”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定A，重復(fù)6次。結(jié)果RSD＝0.45%（n＝3），表明方法精密度良好。（2）重復(fù)性試驗(yàn)。精密量取樣品溶液5m L至25m L量瓶，同“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定A，重復(fù)6次。結(jié)果RSD＝0.31%（n＝3），表明方法重復(fù)性良好。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取樣品溶液分別于放置0、2、4、6、8、12、24 h后同“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定A，結(jié)果RSD＝0.83%（n＝3），表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。（4）準(zhǔn)確度試驗(yàn)。精密量取樣品溶液5m L及2m L對(duì)照品溶液（0.412mg）至25m L量瓶中，同“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，平行制備6份，測(cè)定A，計(jì)算平均回收率為98.20%（RSD＝0.56%，n＝3），表明方法準(zhǔn)確度高。

2.2.3 樣品含量測(cè)定方法 精密稱取樣品浸膏0.050 0 g，溶解定容至50m L量瓶中，得到樣品溶液。精密量取5.0m L至25m L量瓶中，加入1.0m L 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6m in；加入1m L 10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6m in；加入4%氫氧化鈉10m L，用60%乙醇定容至刻度，靜置15min。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A，將各組A數(shù)據(jù)代入回歸方程中計(jì)算黃酮含量。

2.3 不同方法提取柿葉總黃酮結(jié)果比較分析

對(duì)乙醇回流法、半仿生法、酶法和半仿生酶法所提取的浸膏稱質(zhì)量并測(cè)定其總黃酮含量，計(jì)算黃酮提取率（%）＝浸膏中黃酮總量（g）/藥材稱量（g）×100%，結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法的比較Tab 1 Com parison of differentextractionm ethods

由表1可知，從浸膏總質(zhì)量和黃酮提取率分析，半仿生酶法＞半仿生法＞酶法＞乙醇回流法。半仿生法通過(guò)模擬藥物在人體的pH梯度，能夠有效提高提取率，比傳統(tǒng)的乙醇回流法提高了67.6%。酶法通過(guò)破壞中草藥的細(xì)胞壁，增大了內(nèi)容化學(xué)成分的溶出；在3種酶中，最適宜柿葉中黃酮提取的酶為復(fù)合酶，其提取率比傳統(tǒng)方法提高了61.8%。半仿生酶法結(jié)合了酶法與半仿生法的優(yōu)勢(shì)，取得了更好的提取效果。使用復(fù)合酶的半仿生酶法比傳統(tǒng)提取法的提取率提高了76.5%，比半仿生法提高了5.3%，比酶法提高了9.1%。由此表明，半仿生酶法在上述幾種提取柿葉黃酮的方法中效率較高，且以采用復(fù)合酶最優(yōu)。

2.4 半仿生酶法提取柿葉中黃酮的工藝優(yōu)化

通過(guò)上述對(duì)提取方法的比較，初步選擇半仿生酶法（復(fù)合酶）為提取方法。以回流溫度（A）、回流時(shí)間（B）和料液比[C，即每次回流提取時(shí)藥材量（g）與提取液量（m L）之比]作為考察的3個(gè)因素，以黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)半仿生酶法進(jìn)行條件優(yōu)化。因素與水平見表2；正交試驗(yàn)結(jié)果見表3；方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factorsand levels

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Resultsoforthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Analysis resultof variance

由表2、表3可知，極差分析和方差分析結(jié)果一致，因素影響大小排序?yàn)镃＞A＞B。由于隨著回流溫度的升高，黃酮提取率呈先升高再降低的趨勢(shì)，提示溫度升高有利于黃酮被充分提取，但回流溫度＞70℃時(shí)可能部分有效成分被破壞。由A因素的P＞0.05可知，溫度對(duì)提取率影響不顯著，故選擇較低的50℃為回流溫度，既節(jié)省能源又可避免高溫對(duì)化合物的破壞。等量原料下，隨著提取溶劑的增加，黃酮提取率呈先下降再升高的趨勢(shì)，可能的原因?yàn)樵诹弦罕?∶12時(shí)，黃酮未被充分提取而且被稀釋；而在料液比為1∶14時(shí)提取率最大，表明提取出的黃酮已抵消了稀釋帶來(lái)的影響，故選擇此料液比較為合理。隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率呈逐漸上升趨勢(shì)，故選擇2 h較為合理。綜上，最優(yōu)工藝為A1B3C3，即料液比1∶14、回流溫度50℃、回流時(shí)間2.0 h。

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

取粉碎后的柿葉約100 g，共3份，采用優(yōu)化的工藝條件分別進(jìn)行提取，測(cè)定黃酮含量并計(jì)算其提取率。結(jié)果，3次試驗(yàn)黃酮提取率分別為5.9%、5.8%、5.9%（RSD＝0.98%，n＝3），與正交試驗(yàn)結(jié)果最高值相當(dāng)，表明優(yōu)化的工藝提取率較高，且工藝穩(wěn)定、方法可行。

3 討論

柿葉為柿樹科柿樹屬植物柿樹的葉，含有大量以黃酮類化合物為代表的具有藥理活性的化學(xué)成分，目前已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療和保健行業(yè)，具有廣闊的應(yīng)用前景和開發(fā)價(jià)值。本文從提取柿葉中總黃酮的角度出發(fā)，在半仿生法的基礎(chǔ)上加入了纖維素酶和果膠酶以破壞細(xì)胞壁、加快有效成分溶出，并對(duì)比分析了乙醇回流法、半仿生法、酶法及半仿生酶法的浸膏得率和黃酮提取率，發(fā)現(xiàn)半仿生酶法提取率較高。因此，在前期確定的最優(yōu)酶用量的基礎(chǔ)上[7-8，16]，進(jìn)一步設(shè)置了回流溫度、回流時(shí)間和料液比3個(gè)參數(shù)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化半仿生酶法提取柿葉中黃酮的工藝條件。本試驗(yàn)為柿葉中黃酮的提取以及半仿生酶法的推廣提供了一定的依據(jù)。

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Screening and Optim ization of the Extraction Technology of Total Flavonoids in Persimmon Leaves by Sem i-bionic-enzyme M ethod

XUE Xuanji，LUO Jun，ZHANG Xinxin，QIAN Chunxiang，ZHAO Jing，GUO Zengjun（School of Pharmacy，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

OBJECTIVE：To screen themethod for extracting total flavonoids in persimmon leaves and optim ize extraction technology.METHODS：Using extract quality and flavonoids content as indexes，the effects of extracting total flavonoids in persimmon leaves by ethanol refluxing method，enzymemethod（cellulase，β-glucanase and complex enzymemixed by equal amounts of both），sem i-bionic method and sem i-bionic-enzyme method（the same enzymes）were compared.Using flavonoids content as index，solid-liquid radio，reflux temperature，reflux time as factors，orthogonal testwas designed to optimize the extraction technology conditions of flavonoids in persimmon leaves by sem i-bionic-enzyme method，and the verification test was conducted.RESULTS：The extract quantity and flavonoids content by semi-bionic-enzymemethod was the highest among the 4 extraction methods，and the complex enzyme was themost suitable；the optim ized extracting condition of sem i-bionic-enzymemethod were as follows as solid-liquid radio of 1∶14，reflux temperature of 50℃，reflux time of 2.0 h；extraction rates of flavonoids in 3 verification tests were 5.9%，5.8%，5.9%（RSD＝0.98%，n＝3）.CONCLUSIONS：The optimized semi-bionic-enzyme method is efficient and stable in extracting flavonoids in persimmon leaves.

Semi-bionic-enzymemethod；Persimmon leaves；Favonoids；Extraction；Orthogonal test；Technology optimization

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1813-04

2016-08-23

2016-09-21）

（編輯：劉 萍）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81172957）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.2016JM 8075）

＊博士研究生。研究方向：天然藥物。電話：029-82655133。E-mail：xuanji0423@126.com

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥及天然藥物資源及活性成分。電話：029-82655133。E-mail：guozj@mail.xjtu. edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.24