骨通貼膏對甲醛疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機制研究Δ

李妤菲，杜婕瑩，曾 森，王 璐，宋健平，王 琪，，葉俏波，張志堅，袁 捷，#（.廣州中醫(yī)藥大學科技產(chǎn)業(yè)園，廣州 505；.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州 5006；.桂林華潤天和藥業(yè)有限公司，廣西桂林500；.廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，廣東梅州 50）

骨通貼膏對甲醛疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機制研究Δ

李妤菲1＊，杜婕瑩2，曾 森3，王 璐3，宋健平1，王 琪1，4，葉俏波4，張志堅1，袁 捷1，2#（1.廣州中醫(yī)藥大學科技產(chǎn)業(yè)園，廣州 510445；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州 510064；3.桂林華潤天和藥業(yè)有限公司，廣西桂林541001；4.廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，廣東梅州 514021）

目的：研究骨通貼膏對甲醛疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機制。方法：60只SD大鼠隨機均分為空白組，模型組，骨通貼膏低、中、高劑量組（0.594、1.188、2.376 g/貼，含生藥0.48、0.96、1.92 g）與醋酸潑尼松組（ig給藥，0.005 4 g/kg，外貼基質(zhì)），采用甲醛法復制大鼠疼痛模型，造模后立即給藥。采用電子壓痛儀測定給藥1、2、3、4、6 h后各組大鼠痛閾值；給藥6 h后，于腹主動脈取血0.3m L并處死大鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定大鼠血漿中β-內(nèi)啡肽（β-EP）、前列腺素E2（PGE2）含量，分光光度法測定大鼠血清、炎癥組織中一氧化氮（NO）含量，放射免疫法檢測大鼠血清、炎癥組織及腦組織中P物質(zhì)含量。結果：與造模前比較，模型組大鼠各個時段痛閾值均降低（P＜0.05或P＜0.01）；與空白組比較，模型組大鼠PGE2、NO、炎癥組織和腦組織中P物質(zhì)含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，骨通貼膏各劑量組大鼠給藥后對應時間點的痛閾值升高，PGE2、炎癥組織與腦組織中P物質(zhì)含量降低（P＜0.05或P＜0.01），骨通貼膏中、高劑量組β-EP含量升高、炎癥組織中NO含量降低（P＜0.05或P＜0.01），骨通貼膏高劑量組血清中NO含量降低（P＜0.05）。結論：骨通貼膏具有一定的鎮(zhèn)痛抗炎作用，其作用機制可能與降低PGE2、NO、P物質(zhì)含量，升高β-EP含量有關。

骨通貼膏；大鼠；鎮(zhèn)痛作用；機制；β-內(nèi)啡肽；前列腺素E2；一氧化氮；P物質(zhì)

疼痛的產(chǎn)生機制尚不十分明確，現(xiàn)代醫(yī)學對此主要有疼痛特異性與閘門控制學說[1]。中醫(yī)理論則認為，疼痛主要是由氣血運行不暢，氣滯血瘀、痹阻經(jīng)絡所致。骨通貼膏含有丁公藤、麻黃、當歸、干姜、乳香、三七等活血化瘀、行氣止痛類藥物，主要用于寒濕阻絡兼血瘀證之局部關節(jié)痛癥、麻木腫脹、屈伸不利等，在臨床上治療各類痛癥均有較好效果[2-3]，但其具體作用機制尚未十分明確。因此，在本研究中，筆者擬建立大鼠甲醛疼痛模型，評價骨通貼膏的鎮(zhèn)痛作用，并探討其作用機制，以期為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

YLS-3E電子壓痛儀（北京中慧天誠科技有限公司）；Sunrise酶標儀（南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司）；TP-2101電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

骨痛貼膏（廣西桂林華潤天和藥業(yè)有限公司，批號：201505，規(guī)格：7 cm×10 cm）；醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：130615，規(guī)格：5mg/片）；甲醛（天津市大茂化學試劑廠，批號：20131015）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海閎巨實業(yè)有限公司，批號：201511）；β-內(nèi)啡肽（β-EP）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號：C6518790162/16）、前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒（批號：C2805790160/20）、P物質(zhì)檢測試劑盒（批號：T29016286/29）均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 動物

SPF級SD大鼠60只，♂♀各半，體質(zhì)量130～170 g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0034；實驗動物質(zhì)量合格證號：44005800002938]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

稱定60只大鼠的體質(zhì)量并采用電子壓痛儀測定大鼠右后肢踝關節(jié)處給藥前的痛閾值（以大鼠初始嘶叫或掙扎為標準），根據(jù)給藥前痛閾值、體質(zhì)量、性別將60只大鼠分層隨機分為空白組，模型組（外貼基質(zhì)），骨通貼膏低、中、高劑量組（外貼給藥，0.594、1.188、2.376 g/貼，含生藥0.48、0.96、1.92 g，中劑量貼膏為臨床等效使用劑量），醋酸潑尼松組（陽性對照，ig，0.005 4 g/kg，同時外貼基質(zhì)，給藥劑量根據(jù)文獻[4]確定），每組10只。除空白組外，各組大鼠均于右后足足跖iv 5%甲醛溶液0.1m L，誘發(fā)局部急性炎癥，引發(fā)持續(xù)性疼痛，復制甲醛炎癥疼痛模型。造模后，各組大鼠立即給藥1次，模型組、醋酸潑尼松組大鼠外貼基質(zhì)于致炎部位[4-6]。

2.2 疼痛相關指標檢測

采用電子壓痛儀測定給藥1、2、3、4、6 h后各組大鼠右后肢踝關節(jié)處痛閾值。給藥6 h后，以5%水合氯醛麻醉大鼠并于腹主動脈分別以普通管和乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采血3m L，4℃靜置24 h后，離心（離心半徑為8 cm，3 000 r/m in）10m in，取上清液；處死大鼠并解剖取右后肢踝關節(jié)處局部炎癥組織及中腦備用。ELISA法測定大鼠血漿中β-EP、PGE2含量；分光光度法檢測血清、炎癥組織中一氧化氮（NO）含量；放射免疫法檢測血清、炎癥組織及腦組織中P物質(zhì)含量。操作步驟均嚴格按照各試劑盒說明書進行。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。所有數(shù)據(jù)采用±s表示。定量資料組間比較采用單因素方差分析；當組間差異性顯著時，則采用LSD檢驗進行各組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠痛閾值測定結果

與造模前比較，模型組大鼠痛閾值在各個時間點均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，骨通貼膏各劑量組與醋酸潑尼松組大鼠在給藥后相應時間點痛閾值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），詳見表1。

表1 各組大鼠痛閾值測定結果（±s，n＝10，g）Tab 1 Determ ination resultsof thresholds in ratsof each group（±s，n＝10，g）

表1 各組大鼠痛閾值測定結果（±s，n＝10，g）Tab 1 Determ ination resultsof thresholds in ratsof each group（±s，n＝10，g）

注：與造模前比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.beforemodeling，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

組別模型組骨通貼膏低劑量組骨通貼膏中劑量組骨通貼膏高劑量組醋酸潑尼松組給藥6 h后111.71±15.03Δ152.30±26.19##158.28±25.65##158.56±14.40##155.99±17.45##造模前133.54±30.66 133.79±37.34 133.27±26.90 133.02±10.00 133.26±19.48給藥1 h后97.32±15.11ΔΔ149.63±30.66##160.17±33.09##176.37±29.81##159.47±21.80##給藥2 h后114.34±21.74Δ142.08±25.65##139.64±16.28#159.93±24.76##143.51±15.13##給藥3 h后97.4±12.65ΔΔ149.07±18.93##143.63±30.64##161.87±46.38##152.14±37.80##給藥4 h后113.41±17.92Δ143.97±29.53#154.62±34.19##162.18±25.19##146.90±25.94##

3.2 各組大鼠血漿中PGE2、β-EP含量測定結果

與空白組比較，模型組大鼠PGE2含量顯著升高（P＜0.05），β-EP含量有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，骨通貼膏各劑量組與醋酸潑尼松組大鼠PGE2含量均顯著降低（P＜0.05），骨通貼膏中、高劑量組與醋酸潑尼松組大鼠β-EP含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），詳見表2。

3.3 各組大鼠血清與炎癥組織中NO含量測定結果

表2 各組大鼠血漿中PGE2、β-EP含量測定結果（±s，n＝10，pg/m L）Tab 2 Determ ination results of content of PGE2，β-EP in the blood plasma in rats of each group（±s，n＝10，pg/m L）

表2 各組大鼠血漿中PGE2、β-EP含量測定結果（±s，n＝10，pg/m L）Tab 2 Determ ination results of content of PGE2，β-EP in the blood plasma in rats of each group（±s，n＝10，pg/m L）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組骨通貼膏低劑量組骨通貼膏中劑量組骨通貼膏高劑量組醋酸潑尼松組PGE24.92±2.59 10.20±9.01＊4.97±4.70#5.12±2.78#4.95±5.52#4.82±1.86#β-EP 149.82±121.13 82.74±41.34 156.35±101.94 193.80±74.66#234.29±220.50##194.96±100.14#

與空白組比較，模型組大鼠血清和炎癥組織中NO含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，骨通貼膏高劑量組、醋酸潑尼松組大鼠血清與炎癥組織，骨通貼膏中劑量組大鼠炎癥組織中NO含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），詳見表3。

表3 各組大鼠血清與炎癥組織中NO含量測定結果（±s，n＝10，μmol/L）Tab 3 Determ ination results of content of NO in serum and inflammatory tissue in rats of each group（±s，n＝10，μmol/L）

表3 各組大鼠血清與炎癥組織中NO含量測定結果（±s，n＝10，μmol/L）Tab 3 Determ ination results of content of NO in serum and inflammatory tissue in rats of each group（±s，n＝10，μmol/L）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

炎癥組織1 221.24±108.85 1 357.86±87.03＊＊1 269.70±107.97 1 209.17±103.16##1244.49±117.51#1 229.90±123.20#組別空白組模型組骨通貼膏低劑量組骨通貼膏中劑量組骨通貼膏高劑量組醋酸潑尼松組血清88.89±14.34 107.56±12.52＊91.72±29.80 91.55±12.87 88.40±23.11#83.46±21.70#

3.4 各組大鼠血清、炎癥組織與腦組織中P物質(zhì)含量測定結果

與空白組比較，模型組大鼠炎癥組織和腦組織中P物質(zhì)含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，骨通貼膏各劑量組和醋酸潑尼松組大鼠炎癥組織與腦組織中P物質(zhì)含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；各組大鼠血清中P物質(zhì)含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表4。

4 討論

中醫(yī)理論認為疼痛的產(chǎn)生主要是由于風、寒、濕、熱等外邪侵襲或跌打損傷導致人體內(nèi)氣血瘀滯、痹阻經(jīng)絡，如《黃帝內(nèi)經(jīng)·舉痛論》中提出“寒氣入經(jīng)而稽遲”“客于脈中則氣不通，故卒然而痛”，治療以行氣活血、通絡止痛為主[7]。中藥經(jīng)皮給藥制劑具有毒副作用小、療效穩(wěn)定、使用方便等優(yōu)點[8]。骨通貼膏由諸多活血化瘀、行氣止痛類中藥組成，并采用新型聚異丁烯材料作為貼膏基質(zhì)，在前期實驗中，已證實其對皮膚未見毒性和致敏性、使用安全、性質(zhì)穩(wěn)定、藥物釋放性好[9]，適于臨床使用。

表4 各組大鼠血清、炎癥組織與腦組織中P物質(zhì)含量測定結果（±s，n＝10，pg/m L）Tab 4 Determ ination results of substance P in the serum，inflammatory tissue and brain tissue in ratsof each group（±s，n＝10，pg/m L）

表4 各組大鼠血清、炎癥組織與腦組織中P物質(zhì)含量測定結果（±s，n＝10，pg/m L）Tab 4 Determ ination results of substance P in the serum，inflammatory tissue and brain tissue in ratsof each group（±s，n＝10，pg/m L）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組骨通貼膏低劑量組骨通貼膏中劑量組骨通貼膏高劑量組醋酸潑尼松組腦組織305.95±148.14 438.44±197.33＊296.31±148.32#284.59±147.39#256.12±130.57##145.84±59.57##血清138.15±39.01 166.65±16.63 157.48±70.71 155.27±59.80 151.44±56.08 151.62±34.99炎癥組織77.95±72.45 205.88±86.40＊＊143.42±66.76#135.36±62.20#110.31±67.08##139.47±55.15#

甲醛誘導的疼痛模型因其操作簡單、病變直觀，且造模周期短、效果顯著，注射后可立即導致實驗動物產(chǎn)生持續(xù)性疼痛，從而適用于鎮(zhèn)痛藥物的篩選與疼痛機制的研究[10]。本實驗采用經(jīng)典的以5%甲醛溶液注射于大鼠足跖皮下的方法復制模型，大鼠在注射后迅速出現(xiàn)舔足、縮腿、抬腳等反應，與文獻[11-12]記載相符合。醋酸潑尼松屬于糖皮質(zhì)激素，有較強的抗炎作用，可有效減少組織炎癥反應與炎癥介質(zhì)的合成與釋放，故本研究選其為陽性對照藥物。本實驗結果表明，骨通貼膏各劑量均可有效提高甲醛致大鼠足跖腫脹痛閾值，表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛作用。

現(xiàn)階段，中醫(yī)藥的鎮(zhèn)痛機制研究多以中醫(yī)理論結合現(xiàn)代醫(yī)學方法的模式展開，采用現(xiàn)代化分析技術，對與疼痛產(chǎn)生機制相關的指標進行檢測[13-14]。PGE2是在機體受到刺激時釋放的一種炎癥介質(zhì)，在大量釋放時可直接引起疼痛或使神經(jīng)根痛閾下降而引起疼痛；β-EP是一種具有嗎啡樣活性的神經(jīng)多肽，也具有一定的鎮(zhèn)痛活性。研究證實，調(diào)節(jié)PGE2與β-EP水平可有效緩解疼痛，如復方南星止痛膏通過增加外周血中β-EP水平、減少PGE2的含量而表現(xiàn)出提高大鼠足跖腫脹壓痛痛閾值的作用[5]；NO作為神經(jīng)遞質(zhì)和信息傳遞分子，在中樞和外周神經(jīng)中均起著重要的痛覺調(diào)節(jié)作用；P物質(zhì)則是在傷害性傳入神經(jīng)末梢時釋放，能傳遞痛覺信息致疼痛產(chǎn)生的興奮性遞質(zhì)。本實驗結果表明，骨通貼膏能夠有效調(diào)節(jié)上述各指標水平，增加β-EP，抑制PGE2、NO與P物質(zhì)的合成與釋放，這可能是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機制之一。本研究為骨通貼膏在臨床的應用提供了一定的理論依據(jù)，但其更具體確切的機制則還需要進一步研究探討。

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Study on the Analgesic Effect and M echanism of Gutongtie Paste on M odel Rats w ith Formaldehyde-induced Pain

LIYufei1，DU Jieying2，ZENG Sen3，WANG Lu3，SONG Jianping1，WANG Qi1，4，YE Qiaobo4，ZHANG Zhijian1，YUAN Jie1，2（1.Sci-tech Industrial Park，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510445，China；2.School of TCM，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510064，China；3.Guilin Huarun Tianhe Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangxi Guilin 541001，China；4.Guangdong Artepharm Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangdong Meizhou 514021，China）

OBJECTIVE：To study the analgesic effect and mechanism of Gutongtie paste on model rats w ith formaldehyde-induced pain.METHODS：60 SD rats were random ly divided into blank group，model group，Gutongtie paste low-dose，medium-dose，high-dose groups（0.594，1.188.2.376 g/paste，containing crude drug 0.48，0.96，1.92 g）and prednisone acetate group（ig，0.005 4 g/kg，external bonding matrix）.Model rats w ith pain was induced by formaldehydemethod and immediately adm inistrated aftermodeling.Electronic tenderness instrumentwas adopted to determ ine the pain threshold of rats’ankle joint after administration of 1，2，3，4，6 h.After 6 h，blood sample 0.3 m L was taken from abdominal aorta then rats were sacrificed.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to determ ine theβ-endorphin（β-EP），prostaglandin E2（PGE2）contents；spectrophotometry was used to determine nitric oxide（NO）content in rats’serum and inflammatory tissue；and radioimmunoassay was adopted to detect the substance P content in rats’serum，inflammatory tissue and brain tissue.RESULTS：Compared w ith before modeling，pain thresholds in model group at each period were significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared w ith blank group，PGE2，NO of rats，substance P content in inflammatory tissue and brain tissue in model group were significantly increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared w ith model group，pain thresholds in Gutongtie paste groups at corresponding time points were increased，PGE2and substance P contents in inflammatory tissue and brain tissue were decreased（P＜0.05 or P＜0.01）；β-EP and NO contents in serum in Gutongtie pastemedium-dose，high-dose groups（P＜0.05 or P＜0.01），NO contents in serum in Gutongtie paste high-dose group were decreased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Gutongtie paste has a certain analgesic and anti-inflammatory effect，and themechanism may be related to reducing PGE2，NO，substance P contents，increasingβ-EP content.

Gutongtie paste；Rats；Analgesic effect；Mechanism；β-endorphin；Prostaglandin E2；Nitric oxide；Substance P

R285.5

A

1001-0408（2017）13-1766-04

2016-10-24

2017-03-13）

（編輯：劉明偉）

廣東省省級科技計劃項目（No.2013B090800024，2014B040404066）

＊碩士研究生。研究方向：重大疾病的中醫(yī)藥防治。電話：020-87479792。E-mail：416627382@qq.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：中藥新藥開發(fā)。電話：020-87479792。E-mail：466754442@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.11