膠束電動毛細管色譜法測定牛奶中脫氫乙酸

李疆 趙珊 張晶 丁曉靜

脫氫乙酸是廣譜性的一種低毒高效食品防腐劑，尤其對霉菌和酵母的抑菌能力強，為苯甲酸鈉的2～10倍，常以鈉鹽的形式用在果汁、腐乳、醬菜、糕點中進行防腐［1］，然而過量使用對人和動物都有一定的危害性，許多國家對該防腐劑的使用都有嚴格的規(guī)定，美國規(guī)定食品中最高殘留限量為65 mg/kg，日本和我國臺灣允許用于食品的最高殘留限量為0.5 g/kg，我國也規(guī)定了脫氫乙酸在黃油、糕點、熟肉制品和發(fā)酵豆制品等產(chǎn)品中添加量不得超過 0.3～1.0 g/kg［2］，而且禁止用于牛奶防腐。因此，為防止脫氫乙酸違規(guī)添加在牛奶中進行防腐，有必要建立牛奶中脫氫乙酸的分析方法。目前，測定脫氫乙酸最常用的方法包括分光光度法［1］、離子色譜法(IC)［3］、高效液相色譜法(HPLC)［4］、氣相色譜法(GC)以及高效毛細管電泳法(HPCE)［5－8］。其中，分光光度法、GC 法和 HPLC 法是在酸性條件下進行測定，樣品前處理較為繁瑣。IC法需固相萃取凈化，前處理程序冗長，操作復(fù)雜。本實驗室在上述文獻基礎(chǔ)上，建立了簡單、快速測定牛奶中脫氫乙酸的膠束電動毛細管色譜法，并用于牛奶樣品的測定，獲滿意結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑 Beckman P/ACE MDQ型毛細管電泳儀，具二極管陣列檢測器;Beckman P/ACE Station工作站(美國貝克曼庫爾特有限公司);未涂層熔融石英毛細管(30.2 cm×50 mm i．d．，河北永年瑞灃色譜器件有限公司)。KQ－100E醫(yī)用超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Elix/RiOs超純水儀(美國Millipore公司);F－50 A酸度計(北京屹源電子儀器科技公司);德國Hettich Universal 32離心機高速離心機;電子天平(AL 204-IC，METTLER TOLEDO公司，精度:0.1 mg);500 mL低密度聚乙烯塑料瓶(low-density polyethyl，LDPE，美國 Cole-Parmer公司)。1.5、15和 50 mL塑料離心管(Greiner，德國)。硼砂(Na2B4O7，分析純，中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站);硼酸(H3BO3，優(yōu)級純，鐵嶺地區(qū)開原化工廠);氫氧化鈉(NaOH，優(yōu)級純，北京化工廠);十二烷基硫酸鈉(SDS，純度≥99%，Sigma-Aldrich);冰醋酸(CH3COOH，純度≥99.8%，北京化學(xué)試劑公司);甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific，USA);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific，USA);標(biāo)準品:脫氫乙酸(DA，純度≥98%，Sigma-Aldrich)。6件樣品來自市售。

1.2 標(biāo)準儲備液的配制 準確稱取已折算純度的脫氫乙酸86 mg，置于15 mL塑料離心管中，用移液器加入8.6 mL乙腈，渦旋混勻，制得質(zhì)量濃度為10 g/L標(biāo)準儲備液，于4℃冰箱中冷藏保存。

1.3 電泳條件 毛細管:30.2 cm(有效長度:20 cm)×50 μm i．d．;分離電壓:13 kV;進樣壓力及時間:0.5 psi、4 s;操作溫度25℃;檢測波長:228 nm。分離緩沖溶液:15 mmol/L硼砂 +60 mmol/L H3BO3+100 mmol/L SDS;樣品提取液:將分離緩沖溶液用超純水稀釋10倍，并保證含5%乙腈，用于處理牛奶樣品。新毛細管在使用前分別用1 mol/L NaOH沖洗20 min，超純水沖洗5 min，分離緩沖液沖洗5 min。每次進樣前依次用1 mol/L NaOH沖洗1 min，超純水沖洗1 min，分離緩沖液沖洗1.5 min，以保證遷移時間和校正峰面積的重現(xiàn)性。

1.4 樣品前處理 牛奶樣品;稱取0.020 g，置于1.5 mL離心管中，加入樣品提取液980μL，超聲提取10 min，4°C 14 000 r/min 離心 10 min，取上清液直接進樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細管長度的選擇 本研究僅對脫氫乙酸單一成分進行分析，綜合考慮分離效果、分離時間，選用較短的石英毛細管30.2 cm(有效長度:20 cm)×50μm i．d．進行分析，3 min內(nèi)即可完成分離。

2.2 分離緩沖溶液及濃度的選擇 磷酸鹽緩沖體系和硼砂緩沖體系因紫外吸收低而成為毛細管電泳分析中最常用的分離緩沖體系。本實驗室以前的研究表明硼砂緩沖體系可實現(xiàn)食品中10種防腐劑的分離與測定［9］，故本研究仍采用該緩沖體系。分離緩沖溶液中100 mmol/L SDS，60 mmol/L H3BO3(pH 8.31)不變，對硼砂的濃度(10，15和20 mmol/L)進行了研究，隨硼砂濃度的增加，遷移時間延長。綜合考慮遷移時間與分離度，15 mmol/L硼砂為最佳。

2.3 分離緩沖溶液pH值的選擇 分離緩沖溶液pH值不僅影響分析物的遷移時間和分離效率，而且對分析物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，可能造成峰變形。保持分離緩沖液中其余組分濃度不變，本研究考察了硼酸濃度分別為30、60及90 mmol/L，相應(yīng) pH分別為8.56、8.31及8.15時對分離和峰形的影響，pH為8.31即60 mmol/L硼酸時，脫氫乙酸的峰沒有變形。

2.4 分離緩沖溶液中SDS濃度的選擇 保持分離緩沖溶液中15 mmol/L硼砂及60 mmol/L硼酸(pH 8.31)不變，考察了分離緩沖溶液中 50、80和100 mmol/L SDS對脫氫乙酸遷移時間的影響。隨著SDS濃度的增加，遷移時間逐漸延長，但靈敏度越來越高，當(dāng) SDS濃度為100 mmol/L時效果最佳。故SDS最佳濃度為100 mmol/L

2.5 分離電壓的選擇 分離電壓對遷移時間、靈敏度和分離度等產(chǎn)生影響，但是過高的電壓會導(dǎo)致工作電流增加，因此產(chǎn)生過多的焦耳熱，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。除此之外，本實驗采用了高濃度的表面活性劑SDS，電壓過高會導(dǎo)致斷電，為避免斷電，本實驗采用13 kV電壓(35μA)進行分離。

2.6 進樣時間的選擇 進樣時間對待測物的分離效果和靈敏度有顯著影響。受毛細管柱容量的限制，高濃度大體積進樣易造成超載，使峰形展寬，分離度減小，然而小體積進樣時將導(dǎo)致靈敏度太低。本實驗考察了進樣時間分別為2、4、6和8 s時的分離效果，隨進樣時間的增長，各峰靈敏度明顯升高。進樣時間為6 s時的峰開始展寬，因此最終選擇進樣時間為4 s。

2.7 標(biāo)準曲線、線性范圍及檢出限 在上述最佳電泳條件下，將脫氫乙酸標(biāo)準儲備液(10 g/L)用乙腈逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為 30、60、100、200、500、1 000、2 000，然后取每個質(zhì)量濃度的混標(biāo)10μL，再加入190μL樣品提取液;將以上質(zhì)量濃度的脫氫乙酸標(biāo)準分別稀釋成 1.5、3、5、10、25、50、100 mg/L 的工作液，確保每個質(zhì)量濃度的標(biāo)準溶液中含5%乙腈。采用校正峰面積外標(biāo)法定量，校正峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x，mg/L)線性回歸方程A=78.6x+31.99，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9，具有良好線性關(guān)系。檢出限(LOD)0.5 mg/L，定量限(LOQ)1.5 mg/L。

2.8 加標(biāo)回收率 本實驗用不含脫氫乙酸的牛奶樣品做加標(biāo)回收率實驗的本底。分別在低、中、高三個質(zhì)量濃度水平進行加標(biāo)回收率試驗。脫氫乙酸分別加標(biāo)10、50和100 mg/L(每個加標(biāo)濃度的樣品平行處理5份)，回收率在95.2% ～98.6%，相應(yīng)相對標(biāo)準偏差為2.6%～3.4%。加標(biāo)電泳圖見圖1，由圖可見:3.5 min之內(nèi)即可實現(xiàn)脫氫乙酸的分離測定，加上進樣前的清洗時間為3.5 min，則每個樣品僅需7 min即可完成分析。

圖1 脫氫乙酸加標(biāo)電泳圖

2.9 實際樣品分析 按1.4樣品前處理方法對市場采購6件牛奶樣品進行處理，均未檢測到脫氫乙酸。

3 結(jié)論

本文建立的膠束電動毛細管色譜法，具有樣品前處理簡單、分離效率高，試劑消耗少，檢測結(jié)果準確可靠，適用于牛奶樣品中脫氫乙酸的快速測定。

參考文獻

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