采用固相萃取/高效液相色譜法測定保健食品中12種雙酚類化合物的遷移量

曹晨 李文斌 宋青 孫欣 任碩 程甲 陳迪 鄧曉軍

雙酚類化合物中比較典型的有雙酚A、雙酚F、雙酚S、雙酚一A二環(huán)氧甘油醚(BADGE)、雙酚一F二環(huán)氧甘油醚(BFDGE)、酚醛清漆甘油醚(NOGE)及其衍生物等，容易造成人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)異常，不僅具有“致癌、致突變、致畸”的危害，還會嚴(yán)重干擾人類的生殖遺傳功能。這些雙酚類物質(zhì)廣泛應(yīng)用于食品接觸材料的生產(chǎn)過程中，易通過食品包裝容器和塑料薄膜遷移至食品或飲料中，我國以BADGE和BFDGE為內(nèi)涂層的食品包裝為主要成分，當(dāng)與食品接觸時這些物質(zhì)就可能會遷移到食品中，對人體雌雄激素比例失調(diào)起著不容忽視的作用［1］。歐盟法規(guī)(EC/1985/2 005號指令)規(guī)定對雙酚A二縮水甘油醚(BADGE)及其衍生物雙酚A－雙(2，3－二羥基丙基甘油醚)(BADGE·H2O)、雙酚A－雙(2，3－二羥基丙基醚)(BADGE·2H2O)在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過9 mg/kg，單一各類在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過1 mg/kg［2］。同時我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定雙1酚S在食品或食品模擬物中的遷移限量為0.05 mg/kg［3］。目前對于環(huán)境、水樣、化妝品和食品接觸材料中雙酚類化合物檢測方法的報(bào)道較多，但是對于保健食品中雙酚殘留的研究較少。對于測定雙酚殘留可以采用氣相色譜－質(zhì)譜法［4］、液相色譜 － 質(zhì)譜法［5－8］，液相色譜法等［9－11］。其中氣相色譜－質(zhì)譜法前處理方法操作復(fù)雜，需要對雙酚衍生化后進(jìn)行測定;液相色譜－質(zhì)譜法靈敏度高，但儀器和實(shí)驗(yàn)耗材的成本高;液相色譜法作為常規(guī)檢測設(shè)備，采用熒光檢測方法檢測器結(jié)合前處理?xiàng)l件優(yōu)化后也可以獲得較好的靈敏度，因此被廣泛應(yīng)用于雙酚類等檢測。王延翠等［9］、汪輝等［11］采用該技術(shù)對水中雙酚A及雙酚S等雙酚類化合物進(jìn)行檢測。已有的文獻(xiàn)中尚無對于保健食品中的多種雙酚類化合物檢測方法的報(bào)道。于2016年10月開始采用乙腈水提取，固相萃取凈化，高效液相色譜配熒光檢測器測定保健食品中12種雙酚類化合物的遷移量，方法具備簡單、高效、檢測成本低，同時滿足歐盟等國家和地區(qū)的法規(guī)要求等特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 LC－20高效液相色譜儀:配有熒光檢測器(日本島津公司);ProElut CARB固相萃取小柱(100 mg/3 mL，Dikma公司);BPA和BPF標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞95%，日本TCI公司);BFDGE標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞95%，德國 Dr．Ehrenstorfer公司);BPS標(biāo)準(zhǔn)品(純度 ＞99%，美國 Admas公司);BADGE、BADGE-H2O、BADGE-2H2O、雙酚 A－(3－氯－2－羥丙基甘油醚)(BADGE-HCl)、雙酚 A－雙－(3－氯－2－羥丙基)甘油醚(BADGE－2HCl)、雙酚 A－(3－氯－2－羥丙基)(2，3－二羥丙基醚)(BADGE-H2OHCl)、雙酚 F－雙(2，3－二羥基丙基醚)(BFDGE－2H2O)、雙酚 F－雙 －(3－氯 －2－羥丙基)甘油醚(BFDGE－2HCl);乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Millipore系統(tǒng)處理的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.001 g)，分別用甲醇溶解配制濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于2～4℃冰箱內(nèi)，有效期6個月。用50%甲醇水溶液將各標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2H2O、BFDGE·2HCl 為5.0 μg/mL;BADGE、BADGE·H2O、BADGE·2H2O 為100.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保存于2～4℃冰箱內(nèi)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理 固體或粉狀樣品稱取0.5 g，加入2 mL水混勻，加入10 mL乙腈、2 mL 200 g/L乙酸鉛、2.0 g氯化鈉(膠囊類產(chǎn)品直接稱取0.5 g內(nèi)容物后，加入 10 mL乙腈)，振蕩 5 min，8 000 r/min離心2 min，收集上清液;向下層殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈，按照步驟重復(fù)提取一次，合并上清液;將上清液在35℃水浴下減壓蒸干，加入5 mL水，混勻，取1 mL待凈化。分別加入3 mL乙酸乙酯、3 mL甲醇、3 mL水，活化SPE小柱，棄去流出液，將待凈化液加入柱中，棄去流出液，向柱中加入3 mL 20%甲醇水，棄去流出液，抽干小柱，向柱中加入5 mL甲醇∶乙酸乙酯(1∶2)，收集洗脫液，在40℃下氮吹至干，用50%甲醇水定容至1 mL，過0.22μm濾膜，供HPLC分析。

1.4 液相色譜條件 Platisil PH(反相色譜苯基柱)，250 mm×4.6 mm，5μm。流動相A為水，流動相B為乙腈;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20μL;柱溫30℃;激發(fā)波長:227 nm;發(fā)射波長:313 nm。梯度洗脫:0～10 min，60%A;10～27 min，60% ～40%;27 ～30 min，40% ～60%;30～75 min，60%。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇: 選擇Platisil PH柱是因?yàn)榕cC8、C18類型的色譜柱比較后發(fā)現(xiàn)，其疏水性較弱于其他兩個類型的色譜柱，且表面含有的苯基基團(tuán)與含苯基化合物容易發(fā)生π-π相互作用，對于雙酚類化合物具有獨(dú)特的選擇性。另外，表面的高密度鍵合和獨(dú)有的封端技術(shù)，增強(qiáng)了柱子的穩(wěn)定性。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對12種雙酚類化合物都能做到基線分離且穩(wěn)定性良好，12種標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示。

圖1 12種標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

2.1.2 流動相及洗脫條件的選擇: 分別考察了甲醇—水和乙腈—水的流動相系統(tǒng)對于目標(biāo)化合物分離程度的影響。以乙腈為有機(jī)相時12種目標(biāo)物響應(yīng)值比較穩(wěn)定，分離度能夠達(dá)到方法學(xué)要求;而以甲醇為有機(jī)相時多個目標(biāo)物的相應(yīng)值明顯降低，無法滿足基線分離的要求。除考察流動相組成外，還比較了流動相梯度變化對化合物分離程度及峰型的影響。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在27 min后必須通過降低有機(jī)相比例，使試樣中的雜質(zhì)峰對前面的目標(biāo)化合物的分離度及峰型的影響降低，特別是對于油脂含量較高的樣品。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取液的優(yōu)化: 根據(jù)雙酚類化合物易溶于乙腈、丙酮、甲醇等有機(jī)溶液的特性，比較了甲醇和乙腈兩種試劑對保健品中雙酚類化合物的提取效果。如圖2所示，乙腈可以從基質(zhì)中充分提取目標(biāo)化合物，故而最終選擇乙腈溶液作為提取溶液。同時對于蛋白粉等固體保健食品，需要用水溶解樣品，在氯化鈉存在下采用乙腈提取，利用乙腈與鹽飽和水溶液分層的特性，充分提取化合物及除掉水溶性雜質(zhì)。對于膠囊油類樣品，采用有機(jī)溶劑直接提取，乙腈與油類樣品可完全乳化，可充分提取樣品中目標(biāo)化合物。

圖2 使用不同提取溶劑的前處理方法對目標(biāo)化合物回收率的影響

2.2.2 固相萃取柱的選擇: 固相萃取法因其操作步驟簡單，溶劑用量少，提取效率高的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于樣品的前處理過程中，根據(jù)雙酚類化合物的特點(diǎn)，常用的固相萃取柱有C18柱、HLB柱、活性炭柱等。保健食品因?yàn)楫a(chǎn)品類型多，基質(zhì)比較復(fù)雜，為了能夠找到同時滿足膠囊類、口服液類、固體粉劑類3種基質(zhì)提取凈化要求的固相萃取柱，分別比較了C18柱、HLB柱、活性炭CARB柱的凈化效果。經(jīng)過對3種基質(zhì)的加標(biāo)回收試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C18柱對于口服液類樣品的提取效果明顯，但是油脂含量較高的樣品例如膠囊類產(chǎn)品的提取效果不好;HLB柱屬于反向吸附劑，因其兼具親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)，對極性和非極性的化合物都有很好的保留效果，但是對BADGE物質(zhì)出峰位置有雜質(zhì)峰干擾，影響結(jié)果分析。CARB小柱可吸附具有平面結(jié)構(gòu)的色素、芳香烴等物質(zhì)，經(jīng)CARB處理后的樣品，BADGE出峰位置雜質(zhì)峰明顯減少，且3種基質(zhì)的樣品的回收率均滿足實(shí)驗(yàn)要求，故最終選擇石墨化炭黑型ProElutCARB固相萃取柱。如圖3中所示為膠囊類樣品中添加BADGE、BADGE-H2O、BADGE-2H2O 3種化合物1.0 mg/kg、BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2 H2O、BFDGE·2HCl 9種0.05 mg/kg的色譜圖，27 min之后的4 個化合物 BPS、BFDGE、BADGE －2HCl、BADGE-HCl，能夠達(dá)到基線分離的要求。

圖 3 膠囊類保健品(BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2H2O、BFDGE·2HCl 9 種0.05 mg/kg;BADGE、BADGE·H2 O、BADGE·2H2 O 3 種 1.0 mg/kg)添加回收色譜圖

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 檢出限(LOD)和定量線(LOQ): 空白基質(zhì)溶液中加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積對應(yīng)的濃度作圖。表1結(jié)果表明，12種化合物在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均＞0.999。分別以3倍信噪比(S/N＞3)和10倍信噪比(S/N＞10)計(jì)算得到12種雙酚類化合物的檢出限(LOD)及定量限(LOQ)分別為0.02～0.3 mg/kg及0.05～1.0 mg/kg。12種雙酚類化合物的相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限見表1，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

表1 12種雙酚類化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表2 4種基質(zhì)中雙酚類添加回收率范圍

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度:選擇4種不含雙酚類的樣品類型(魚油膠囊、膠原蛋白口服液、維生素片、乳基蛋白粉)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，添加12種雙酚類標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行3個水平的標(biāo)準(zhǔn)添加回收實(shí)驗(yàn)。根據(jù)現(xiàn)行的歐盟法規(guī)要求確定了 BADGE、BADGE·H2O、BADGE·2H2O 3種化合物的添加水平為1.0、2.0和20 mg/kg，其他9種化合物的添加水平為0.05、0.1和1.0 mg/kg［2］。3個水平的平均回收率在71.3% ～118%(n=6)之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.6% ～12.8%(n=6)，方法的回收率和精密度良好(表2)。

2.3.3 實(shí)際樣品檢測 采用本方法對市場上購買的口服液、膠囊和粉狀等3種不同類型基質(zhì)共計(jì)37個保健食品進(jìn)行檢測。在1個膠囊類的保健品中檢出BPA、BADGE·2HCl殘留，含量分別為0.08 mg/kg和0.12 mg/kg，說明雙酚類化合物有存在通過食品包裝材料遷移到保健品中風(fēng)險，但含量較低，未超過雙酚類化合物的遷移總量要求。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取/高效液相色譜法同時測定保健食品中12種雙酚類化合物的遷移量方法。方法的定量限(LOQ)為0.05～1.0 mg/kg。方法操作簡單、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，滿足現(xiàn)行法規(guī)要求的同時，可實(shí)現(xiàn)保健食品中雙酚類化合物遷移量的快速檢測。

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