臍帶血單個核細(xì)胞對大鼠帕金森病的治療效果觀察

陳超段婧申愛芳王偉宋昊蘆現(xiàn)杰王曉兵韓忠朝韓發(fā)彬

臍帶血單個核細(xì)胞對大鼠帕金森病的治療效果觀察

陳超1段婧1申愛芳2王偉1宋昊1蘆現(xiàn)杰1王曉兵2韓忠朝3,4韓發(fā)彬1

目的 探討人體臍帶血單個核細(xì)胞（HUCB-MNC）對大鼠帕金森?。≒D）的治療效果和作用機(jī)制。方法 6-OHDA誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠PD模型，隨機(jī)分為兩組，一組移植從新生兒臍帶血中分離HUCB-MNC細(xì)胞，另一組移植PBS作為對照，根據(jù)運(yùn)動轉(zhuǎn)圈數(shù)和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評估大鼠在細(xì)胞移植后不同時間的運(yùn)動行為情況，移植16周后取出大腦進(jìn)行冰凍切片，免疫熒光染色確定移植的細(xì)胞分化情況。動物行為采用Two-way ANOVA統(tǒng)計方法分析。結(jié)果 轉(zhuǎn)圈實(shí)驗(yàn)顯示，PD大鼠移植HUCB-MNC細(xì)胞4、8、12、16周后，注射阿樸嗎啡產(chǎn)生的轉(zhuǎn)圈比率分別為0.529±0.121、0.457±0.096、0.369±0.089、0.264±0.091，而對照組4、8、12、16周轉(zhuǎn)圈比率分別為0.843±0.158、0.812±0.156、0.736±0.103、0.714±0.160，與對照組相比，移植細(xì)胞組轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.377，5.561，6.835，6.071，P均＜ 0.01）；轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)顯示，移植細(xì)胞大鼠在4、8、12、16周棒上持續(xù)時間分別為（46.333±2.082）s、（63.667±4.041）s、（76.667±7.638）s、（126±12.166）s，而對照組相應(yīng)周數(shù)棒上持續(xù)時間分別為（29.250±5.560）s、（26.750±8.655）s、（34.250±10.905）s、（47.500±6.856）s，與對照組相比，移植細(xì)胞組棒上持續(xù)時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.966，6.189，5.707，10.990，P均 ＜ 0.01）。通過用人特異性細(xì)胞核抗體HNuc，神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物Tuj1，和多巴胺神經(jīng)元抗體TH染色，發(fā)現(xiàn)移植物HNuc、Tuj1、TH染色陽性。結(jié)論 HUCB-MNC細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元和多巴胺神經(jīng)元，減少PD大鼠阿樸嗎啡誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)圈數(shù)，延長大鼠在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時間，改善PD大鼠模型的運(yùn)動缺陷。

臍血干細(xì)胞移植； 單核細(xì)胞； 帕金森病； 細(xì)胞分化； 多巴胺； 神經(jīng)元

帕金森病（Parkinson's disease，PD）患者以黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元的缺失為病理特征。細(xì)胞的生物療法有望替代缺失的神經(jīng)元，并且恢復(fù)PD患者的運(yùn)動功能。過去研究表明使用胎腦神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSC）和胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESC）可以治療PD動物模型和PD患者[1-3]。近年來利用體細(xì)胞重編程技術(shù)產(chǎn)生的人體多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）已經(jīng)可以高效率地分化成神經(jīng)干細(xì)胞和多巴胺神經(jīng)元。iPS細(xì)胞移植到動物模型后可以分化成神經(jīng)干細(xì)胞和多巴胺神經(jīng)元，移植的神經(jīng)元可以存活，并且大鼠PD模型的運(yùn)動缺陷得到改善[4-5]。然而在臨床應(yīng)用中，hESC和NSC細(xì)胞存在倫理問題和免疫排斥反應(yīng)，iPS細(xì)胞由于外源基因的整合可能會有致瘤性。自體細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymal stem cells，BM-MSC）移植治療PD克服了免疫排斥和倫理學(xué)的障礙。研究表明，MSC細(xì)胞在治療動物PD模型和患者方面有良好的效果[6-7]。

臍帶血單個核細(xì)胞（human umbilical cord blood mononuclear cells，HUCB-MNC）可以經(jīng)濟(jì)便捷地從人體臍帶血中分離出來，并且它富含多種干細(xì)胞，這些特點(diǎn)使得HUCB-MNC成為一種可以治療神經(jīng)退行性疾病很有潛力的細(xì)胞[8-9]。人體臍帶血分離得到的HUCB-MNC細(xì)胞含有很多種干細(xì)胞，比如造血干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞、小胚胎干細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞[10]。最新研究表明，HUCB-MNC可以治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，比如中風(fēng)和動物模型的外傷性腦損傷[11-13]。然而并沒有令人信服的證據(jù)表明移植的HUCB-MNC細(xì)胞分化成了神經(jīng)元。

一些研究表明，HUCB-MNC中還含有神經(jīng)樣干細(xì)胞，這顯示HUCB-MNC移植是一種治療神經(jīng)退行性疾病很有潛力的策略[14-15]。本研究把HUCB-MNC移植到大鼠PD模型并且研究了HUCB-MNC的治療效果。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

提供臍帶血的健康志愿者經(jīng)聊城市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號2012004）并填寫患者知情同意書。在無菌條件下，收集新鮮的新生兒臍帶血，立即放入血袋中送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。DMEM/F12、L-Glutamine、非必需氨基酸（Non-essential Amino Acid，NEAA）、胎牛血清（FBS）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，bFGF）、TrypLE購自美國Invitrogen公司；離心管購自美國Corning公司；流式抗體購自美國BD公司；免疫熒光抗體購自德國Millipore公司；其他試劑購自美國Sigma公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.HUCB-MNC分離培養(yǎng)：新鮮收集的臍帶血，在生物安全柜中用DMEM/F12進(jìn)行1：1稀釋。將離心機(jī)的升降速調(diào)為零，300×g離心10 min，去除上清液從而去除抗凝劑。用DMEM/F12對細(xì)胞沉淀進(jìn)行清洗，然后用DMEM/F12重懸。在新的離心管中加入淋巴細(xì)胞抽提液Ficoll，緩慢在上層加入細(xì)胞懸液，使Ficoll和細(xì)胞懸液的比例為1：2。將離心機(jī)的升降速調(diào)為零，室溫400×g離心35 min。離心后，小心吸取中間白膜層，再用DMEM/F12清洗1遍，室溫300×g離心20 min，去除上清液，用事先配好的培養(yǎng)基重懸后打入T75瓶中，37 ℃、5﹪ CO2培養(yǎng)。

2.HUCB-MNC流式細(xì)胞鑒定：取對數(shù)生長期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，PBS清洗2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/ml，取100 μl細(xì)胞懸液，對照組和實(shí)驗(yàn)組分別加入相應(yīng)抗體。實(shí)驗(yàn)組選用CD16、CD29、CD34、CD45、CD73和CD90，對照組選用相應(yīng)同型對照抗體。

3.使用6-OHDA制作PD大鼠模型：新鮮配制10﹪水合氯醛溶液，按0.3 g/kg的用量經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后，將大鼠固定至腦立體定位儀；將微量注射器PBS通針；于大鼠頭頂部皮膚劃1條長度2 ～ 3 cm的切口；暴露前后囟門，以前囟為基點(diǎn)，準(zhǔn)確記錄AP，ML，DV三軸的坐標(biāo)，分別AP-0.2，ML-0.2，DV-0.80定位大鼠黑質(zhì)位置，小心鉆顱；用微量注射器抽取0.1﹪抗壞血酸溶液稀釋成5 mg/ml的6-OHDA溶液，由鉆孔處進(jìn)針，達(dá)到計算位置；每只大鼠4 μl。進(jìn)液完成后留針6 ～10 min，同時觀察大鼠狀態(tài)；撤針縫皮，小心將大鼠平放入新籠中。

4.移植細(xì)胞：注射過6-OHDA的大鼠，經(jīng)阿樸嗎啡誘導(dǎo)后在30 min內(nèi)轉(zhuǎn)圈數(shù)超過200圈，即為PD模型，用于之后的移植實(shí)驗(yàn)。共選擇16只PD大鼠用于移植實(shí)驗(yàn)，分兩組：隨機(jī)抽取8只接受了紋狀體處的HUCB-MNC移植（移植組，實(shí)驗(yàn)過程中1只死亡），另外8只則用PBS代替HUCB-MNC實(shí)行了同樣的操作（對照組，實(shí)驗(yàn)過程中1只死亡）。成模大鼠，按上述方法麻醉后，將大鼠固定至腦立體定位儀；將微量注射器PBS通針后；于大鼠頭頂部皮膚劃1條長度2 ～ 3 cm的切口；暴露前后囟門，以前囟為基點(diǎn)，準(zhǔn)確記錄AP，ML，DV三軸的坐標(biāo)，選取兩處移植位點(diǎn)，坐標(biāo)分別為：以前囟為基點(diǎn)，AP +0.07/-0.2，ML -0.3/-0.4，DV -0.5/-0.55，小心鉆顱；混勻細(xì)胞懸液，用微量注射器抽取所需劑量，由鉆孔處進(jìn)針，達(dá)目的位置；每孔注射細(xì)胞4 ～ 5 μl，同時觀察大鼠狀態(tài)；撤針縫皮，小心將大鼠平放入新籠中。從移植前2 d開始一直到移植實(shí)驗(yàn)結(jié)束，所有實(shí)驗(yàn)PD大鼠每天都要注射相應(yīng)劑量的環(huán)孢菌素以減少機(jī)體對移植物的排斥反應(yīng)。

5.行為評估：轉(zhuǎn)圈實(shí)驗(yàn)（rotation）是將阿樸嗎啡皮下注射3 min后，大鼠被放到一個塑料盆里并記錄它們的轉(zhuǎn)圈數(shù)量；轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（Rotarod）是把動物放在一個轉(zhuǎn)動的木棒（Columbus Instruments，Columbus，USA）上，看動物堅持的時間。先將動物放在低速旋轉(zhuǎn)的木棒上（2 ～ 4轉(zhuǎn)/min），3 ～ 4次訓(xùn)練后，將轉(zhuǎn)數(shù)提高到9轉(zhuǎn)/min，并檢測動物持續(xù)時間。計算移植組和對照組在移植后第4周、第8周、第12周和第16周的單位時間轉(zhuǎn)圈比率和轉(zhuǎn)棒持續(xù)時間，看兩者之間是否存在顯著性差異。

6.免疫組化：免疫組化實(shí)驗(yàn)流程參見Suzuki的文章[16]，細(xì)胞移植16周后大鼠被處死，腦組織用4﹪多聚甲醛浸泡并固定24 h后，于30﹪蔗糖溶液中脫水24 ～ 48 h，然后包埋在Tissue-Tek OTC中并用低溫切片機(jī)切成20 μm的薄片。切片分別用人細(xì)胞核抗體hNUC、人神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志分子Tuj1抗體、多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志分子TH抗體以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子GFAP抗體4 ℃過夜孵育。用PBS沖洗之后，用熒光標(biāo)記的二抗Alexa Fluor 488或者Cy3室溫孵育3 ～ 4 h，然后用細(xì)胞核抗體Hoechest 33258孵育2 ～ 5 min。用熒光顯微鏡或者激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。流式細(xì)胞表達(dá)率采用±s表示，動物行為采用Two-way ANOVA和非配對t檢驗(yàn)統(tǒng)計方法分析。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HUCB-MNC流式細(xì)胞分析

HUCB-MNC含有多種不同類型的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞，檢測HUCB-MNC的表面標(biāo)志物，來確定細(xì)胞組成。分離HUCB-MNC后，立即將細(xì)胞分成兩部分，一部分凍存于液氮，另一部分做流式檢測，檢測了3份不同的臍血樣品。CD16，CD29，CD34，CD45，CD73，和CD90的值分別是（31.90± 3.67）﹪，（71.50±0.56）﹪，（3.05±1.06）﹪，（91.65± 9.69）﹪，（18.90±4.38）﹪，和（43.70±0.42）﹪，提示大部分細(xì)胞為表達(dá)CD45，CD29和CD90的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，另外還有低表達(dá)CD34的造血干細(xì)胞（圖1）。

圖1 三種HUCB-MNC樣本表面標(biāo)記物平均表達(dá)率的流式檢測

二、HUCB-MNC移植對6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森大鼠模型的影響

研究發(fā)現(xiàn)PD大鼠移植HUCB-MNC細(xì)胞4周、8周、12周、16周后，注射阿樸嗎啡產(chǎn)生的轉(zhuǎn)圈比率，與對照組相比，移植細(xì)胞組轉(zhuǎn)圈比率明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01，表1）；轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)顯示移植細(xì)胞大鼠在4周、8周、12周、16周棒上持續(xù)時間，與對照組相比，移植細(xì)胞組棒上持續(xù)時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01，表2）。

表1 兩組PD大鼠移植后不同時間點(diǎn)轉(zhuǎn)圈比率比較（±s）

表1 兩組PD大鼠移植后不同時間點(diǎn)轉(zhuǎn)圈比率比較（±s）

分組 只數(shù) 4周 8周 12周 16周對照組 7 0.843±0.158 0.812±0.156 0.736±0.103 0.714±0.160移植組 7 0.529±0.121 0.457±0.096 0.369±0.089 0.264±0.091 t 值 4.377 5.561 6.835 6.071 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表2 兩組PD大鼠移植后不同時間點(diǎn)棒上持續(xù)時間比較（s，±s）

表2 兩組PD大鼠移植后不同時間點(diǎn)棒上持續(xù)時間比較（s，±s）

分組 只數(shù) 4周 8周 12周 16周對照組 7 29.250±5.560 26.750±8.655 34.250±10.905 47.500± 6.856移植組 7 46.333±2.082 63.667±4.041 76.667± 7.638 126.000±12.166 t 值 4.966 6.189 5.707 10.990 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖2 熒光顯微鏡下臍帶血單個核細(xì)胞移植術(shù)后16周的PD大鼠腦內(nèi)免疫組化分析（×100）

三、HUCB-MNC在大鼠腦內(nèi)的存活和神經(jīng)分化能力

為了研究HUCB-MNC在大鼠體內(nèi)的分化和遷移情況，將移植HUCB-MNC 16周后的大鼠處死，并將其大腦相應(yīng)部位進(jìn)行冰凍切片和免疫熒光染色分析。通過用人特異性細(xì)胞核抗體HNuc，神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物Tuj1，和多巴胺神經(jīng)元抗體TH染色，發(fā)現(xiàn)移植物HNuc、Tuj1、TH染色陽性，HUCB-MNC在大鼠體內(nèi)成功的分化成了神經(jīng)細(xì)胞以及多巴胺能神經(jīng)元（圖2）。

討 論

分離HUCB-MNC并移植到6-OHDA損傷的PD模型，發(fā)現(xiàn)HUCB-MNC能夠明顯改善PD大鼠的運(yùn)動障礙行為，表明HUCB-MNC能夠作為治療帕金森病的潛在細(xì)胞來源。

研究報道，HUCB-MNC細(xì)胞含有很多種干細(xì)胞，比如造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞、小胚胎干細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。為了解HUCB-MNC的細(xì)胞組成情況，本研究用流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)HUCB-MNC細(xì)胞表達(dá)CD45，CD29和CD90，但表達(dá)CD34的造血干細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比較低。最近的研究表明外周血中表達(dá)CD45的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞（PB-IPCs）能夠被誘導(dǎo)成神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，這類獨(dú)特的CD45+細(xì)胞可能對于神經(jīng)退行性疾病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到一定的保護(hù)作用[17]，進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的可重復(fù)性。盡管沒有研究表明造血干細(xì)胞能夠在體外分化為神經(jīng)細(xì)胞，但是一些研究表明造血干細(xì)胞在補(bǔ)充了促血小板生成素、flt-3配體以及c-kit配體的培養(yǎng)基（TPOFLK）中能夠分化為神經(jīng)干細(xì)胞[18]。另有研究報道HUCB-MNC中含有一定數(shù)目的神經(jīng)干細(xì)胞和小胚胎干細(xì)胞[11]，可能對于HUCB-MNC移植后的神經(jīng)分化起一定作用。

細(xì)胞移植后大鼠轉(zhuǎn)圈比率隨時間呈現(xiàn)穩(wěn)定的下降的趨勢，且在轉(zhuǎn)棒上持續(xù)時間逐漸延長，與對照相比具有顯著性差異，提示HUCB-MNC細(xì)胞移植對于治療大鼠PD模型具有比較顯著的效果。但由于對照組大鼠的個體差異產(chǎn)生的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)差較大，因此在選擇PD模型大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，應(yīng)當(dāng)盡可能選擇轉(zhuǎn)圈數(shù)基本相似的分為同一實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HUCB-MNC細(xì)胞移植后能夠在大鼠腦內(nèi)存活并分化成神經(jīng)細(xì)胞和多巴胺神經(jīng)元，提示HUCB-MNC中的細(xì)胞組分具有神經(jīng)分化能力。為排除多巴胺神經(jīng)元來自于宿主大鼠，用人體特異的HNuc抗體和多巴胺神經(jīng)元抗體TH對組織切片進(jìn)行共染分析，證實(shí)多巴胺神經(jīng)元來自于移植的人體細(xì)胞。其他的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，分化的細(xì)胞和移植存活細(xì)胞的比例一般在20﹪～ 30﹪[4]，提示如何提高移植細(xì)胞的存活率和分化效率，仍是細(xì)胞移植治療亟待解決的問題。有研究報道，HUCB-MNC在動物腦內(nèi)的神經(jīng)分化，可能受到宿主腦內(nèi)局部微環(huán)境的影響[19]。在中風(fēng)[20]、多系統(tǒng)萎縮[21]、脊髓損傷[22]等疾病模型的研究中發(fā)現(xiàn)，HUCB-MNC可以遷移到受損的大腦區(qū)域，通過替代受損的神經(jīng)元、改善局部的大腦微環(huán)境、降低炎癥、促進(jìn)血管和神經(jīng)再生發(fā)揮治療作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，HUCB-MNC可以分化為神經(jīng)元和多巴胺神經(jīng)元，對PD大鼠具有一定的治療作用。此研究提示，針對PD等神經(jīng)退行性疾病而言，HUCB-MNC移植是一種有潛力的細(xì)胞治療策略。

1 Lindvall O, Kokaia Z.Prospects of stem cell therapy for replacing dopamine neurons in Parkinson's disease[J].Trends PharmacolSci, 2009, 30(5)：260-267.

2 周春輝, 王曉晴, 張劍寧.干細(xì)胞移植治療帕金森病的研究進(jìn)展[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 2(6)：341-343,347

3 Barker RA, Barrett J, Mason SL, et al.Fetal dopaminergic transplantation trials and the future of neural grafting in Parkinson's disease[J].Lancet Neurol, 2013, 12(1)：84-91.

4 Han FB, Wang W, Chen BX, et al.Human induced pluripotent stem cell-derived neurons improve motor asymmetry in a 6-hydroxydopamine-induced rat model of Parkinson's disease[J].Cytotherapy, 2015, 17(5)：665-679.

5 Hargus G, Cooper O, Deleidi M, et al.Differentiated parkinson patientderived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in parkinsonian rats[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(36)：15921-15926.

6 Venkataramana NK, Kumar SK, Balaraju S, et al.Open-labeled study of unilateral autologous bone-marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in Parkinson's disease [J].Transl Res, 2010, 155(2)：62-70.

7 Blandini F, Cova L, Armentero M, et al.Transplantation of undifferentiated human mesenchymal stem cells protects against 6-Hydroxydopamine neurotoxicity in the rat[J].Cell Transplant, 2010, 19(2)：203-217.

8 Hows JM, Marsh JC, Bradley BA, et al.Human cord blood： a source of transplantable stem cells[J].Bone Marrow Transplant, 1992, 9(1)：105-108.

9 Yang WZ, Zhang Y, Wu F, et al.Safety evaluation of allogeneic umbilical cord blood mononuclear cell therapy for degenerative conditions[J].J Transl Med, 2010, 8：75.

10 Weiss ML, Troyer DL.Stem cells in the umbilical cord [J].Stem Cell Rev, 2006, 2(2)：155-162.

11 Karlupia N, Manley NC, Prasad K, et al.Intraarterial transplantation of human umbilical cord blood mononuclear cells is more efficacious and safer compared with umbilical cord mesenchymal stromal cells in a rodent stroke model[J].Stem Cell Res Ther, 2014, 5(2)：45.

12 Rodrigues LP, Iglesias D, Nicola FC, et al.Transplantation of mononuclear cells from human umbilical cord blood promotes functional recovery after traumatic spinal cord injury in Wistarrats[J].Braz J Med Biol Res, 2012, 45(1)：49-57.

13 Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al.Intravenous administration of humanumbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J].Stroke, 2001, 32(11)：2682-2688.

14 Domanska-Janik K BL, Lukomska B.A novel, neural potential of nonhematopoietic human umbilical cord blood stem cells[J].Int J DevBiol, 2008, 52(2/3)：237-248.

15 Zangiacomi V, Balon N, Maddens S, et al.Human cord blood-derived hematopoietic and neural-like stem/progenitor cells are attracted by the neurotransmitter GABA [J].Stem Cells Dev, 2009, 18(9)：1369-1378.

16 Suzuki M, Mchugh J, Tork C, et al.GDNF secreting human neural progenitor cells protect dying motor neurons, but not their projection to muscle, in a rat model of familial ALS [J].PLoS One, 2007, 2(8)：e689.

17 Li H, Li J, Sheng WH, et al.Astrocyte-like cells differentiated from a novel population of CD45-positive cells in adult human peripheral blood [J].Cell BiolInt, 2015, 39(1)：84-93.

18 Mcguckin CP, Forraz N, Allouard Q, et al.Umbilical cord blood stem cells can expand hematopoietic and neuroglial progenitors in vitro[J].Exp Cell Res, 2004, 295(2)：350-359.

19 Chen N, Kamath S, Newcomb J, et al.Trophic factor induction of human umbilical cord blood cells in vitro and in vivo [J].J Neural Eng, 2007, 4(2)：130-145.

20 Newcomb JD, Ajmo CT, Sanberg CD, et al.Timing of cord blood treatment after experimental stroke determines therapeutic efficacy[J].Cell Transplant, 2006, 15(3)：213-223.

21 宮殿榮, 于海燕, 趙敏, 等.寰枕間隙側(cè)方穿刺移植臍血單個核細(xì)胞治療多系統(tǒng)萎縮的臨床觀察[J].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版), 2016, 4(6)：115-120.

22 Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al.Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury： engraftment and beneficial influence on behavior[J].J Hematother Stem Cell Res, 2003, 12(3)：271-278.

Effects of human umbilical cord blood mononuclear cells in a rat model of Parkinson's disease

Chen Chao1, Duan Jing1, Shen Aifang2, Wang Wei1, Song Hao1, Lu Xianjie1, Wang Xiaobing2, Han Zhongchao3,4, Han Fabin1.1Center for Stem Cells and Regenerative Medicine,2Department of Gynecology and Obstetrics, the Liaocheng People's Hospital, Affiliated Liaocheng Hospital, Taishan Medical University, Liaocheng 252000, China;3the State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Hospital of Blood Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union of Medical College, Tianjin 300020, China;4National Engineering Research Center of Cell Products, Tianjin 300020, China

Han Fabin, Email: fhan2013@126.com

Objective To explore whether human umbilical cord blood mononuclear cells（HUCB-MNC）transplantation could treat Parkinson's disease（PD）.Methods 6-OHDA-lesioned PD rats were divided into two groups randomly： one group was treated with HUCB-MNCs, which were isolated from umbilical cord and the other group was treated with PBS as control.Apomorphineinduced rotation test was used to evaluate the motor behavior of the rats at different times after celltransplantation.Immunochemistry was conducted to confirm the differentiation of the grafted cells in the brain.Results The rates of apomorphine-induced rotation were 0.529±0.121, 0.457±0.096, 0.369 ±0.089, and 0.264±0.091 at 4, 8, 12, and 16 weeks after transplantation respectively, which were significantly lower than those of the control group（0.843±0.158, 0.812±0.156, 0.736±0.103, and 0.714±0.160 respectively）.And the duration time on rotation rod of the treatment group were（46.333 ±2.082）s,（63.667±4.041）s,（76.667±7.638）s, and（126±12.166）s respectively for each time points, while those of the control group were（29.250±5.560）s, （26.750±8.655）s,（34.250 ±10.905）s, and（47.500±6.856）respectively.Immunochemistry assay showed that the grafted HUCB-MNC expressed neuron maker Tuj1 and dopamine neuron maker TH.Conclusion Our study shows that transplanted HUCB-MNCs may differentiate into neurons and dopamine neurons and alleviate motor dysfunction of PD rats.

Cord blood stem cell transplantation; Monocytes; Parkinson disease; Cell differentiation; Dopamine; Neurons

2016-09-24）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.002

山東省科技發(fā)展計劃（2012 GSF11808）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2015HL045）

252000 聊城市人民醫(yī)院 泰山醫(yī)學(xué)院聊城臨床學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室1，婦產(chǎn)科2；300020天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3；300020 天津，國家干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心4

韓發(fā)彬，Email：fhan2013@126.com

陳超，段婧，申愛芳，等.臍帶血單個核細(xì)胞對大鼠帕金森病的治療效果觀察[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（2）：71-76.