紫外線誘導DNA損傷及修復研究的起因與發(fā)展

白冠軍 任衍鋼 宋玉奇 衛(wèi)紅萍

（陽泉師范高等?？茖W校 山西陽泉 045200）

截至目前，DNA是唯一一種在發(fā)生損傷以后可以被完全修復的分子，而其他生物大分子在受到損傷后會被降解和取代。DNA修復的發(fā)現(xiàn)首先歸結(jié)于紫外線誘導DNA突變的研究。早在1890年就有報道，陽光能夠殺死細菌，但當時人們并不知道其中的原因。1914年，亨利（V.Henri）發(fā)現(xiàn)紫外線能誘導細菌突變，但當時人們并沒有從基因水平上探討［1］。1941年，美國著名科學家霍蘭德（Alexander Hollaender）受 穆勒（Herman J.Muller，1946年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者）的啟發(fā)，重新發(fā)現(xiàn)了紫外線能誘導微生物突變［2］。在對紫外線誘導DNA損傷的研究中，科學家發(fā)現(xiàn)了DNA的修復現(xiàn)象。對DNA修復現(xiàn)象的研究又揭開了一系列DNA修復的機制。在這些研究中，DNA修復紫外線誘導DNA損傷始終是DNA修復研究的一條主線。

1 DNA直接修復的發(fā)現(xiàn)與揭示

DNA修復首先從DNA光修復（enzymatic photoreactivation，EPR）的發(fā)現(xiàn)開始。光修復發(fā)現(xiàn)于20世紀40年代末，揭開這個序幕的是2位年輕博士后。一位是在美國冷泉港著名科學家德梅雷茨（Milislav Demerec）實驗室工作的克拉爾（Albert Kelner），當他正嘗試通過紫外線（200～300 nm）照射誘導灰色鏈霉菌突變體以便產(chǎn)生對細菌更有效的抗體時，意外發(fā)現(xiàn)暴露在熒光下瓊脂板上的大腸桿菌和灰色鏈霉菌可減少死亡。著名科學家德爾布呂克（Max Delbruck，1969年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎獲得者）了解到這些情況后，建議克拉爾將這一現(xiàn)象命名為光復活（photoreactivation）［4］。 另一位是在伯明頓的印第安納大學盧里亞（Salvador Luria，1969年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者）實驗室工作的杜爾貝科（Renato Dulbecco，1975年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者），他發(fā)現(xiàn)放在架子頂部培養(yǎng)噬菌體的瓊脂板出現(xiàn)了許多噬菌斑，而在架子下部卻不存在，杜爾貝科敏銳地意識到，這是光對DNA復制產(chǎn)生了影響［3］，這種現(xiàn)象可能與酶有關，而光是其中一個重要因素。

為什么弱的藍光能誘導強的紫外光誘變DNA逆轉(zhuǎn)為正常狀態(tài)？20世紀50年代末這種似乎有悖于物理學規(guī)律的特殊現(xiàn)象引起了物理學家魯伯特（Claud Rupert）的興趣，他先用大腸桿菌作為實驗材料開始研究，但結(jié)果并不理想。1960年，魯伯特改用啤酒酵母粗提取液進行嘗試后發(fā)現(xiàn)，這種能使紫外線誘變的DNA逆轉(zhuǎn)為正常狀態(tài)的酶對藍光特別敏感，故命名這種酶為光復合酶（photoreactivating enzyme）［4］。 同年，荷蘭科學家伯凱爾（Rob Beukers）和貝倫茨（Wouter Berends）證實，紫外線引起DNA損傷的原因是DNA上相鄰的嘧啶以共價鍵相互結(jié)合形成胸腺嘧啶二聚體［5］。杜爾貝科通過一系列實驗證實，這種酶完全符合Michaelis－Menten動力學特征，并在此基礎上提出了2個胸腺嘧啶形成的環(huán)丁烷嘧啶二聚體可被光恢復的假說。該假說在1962年分別被伍爾夫（Daniel L.Wulff）和塞特盧（Richard B.Setlow）等通過啤酒酵母的實驗所證實。光復合酶的發(fā)現(xiàn)標志著DNA修復酶學研究的開始，并對后續(xù)的DNA修復研究起著重要的推動作用。同年，魯伯特在光修復化學動力學分析的基礎上，指出光修復酶首先在沒有可見光的條件下與紫外線照射的DNA形成穩(wěn)定的復合物，并且該酶促反應受到光強度的制約。此后，賽特盧和庫克（J.S.Cook）進一步證實，光修復酶使嘧啶二聚體再分解成2個單體，形成2個正常的胸腺嘧啶，使受損DNA得以修復。由于這個反應涉及到C-C鍵的斷裂，邁納特（S.Minato）和沃爾賓（H.Werbin）將這種酶重新命名為光裂解酶（photolyase）［4］。受魯伯特的影響，土耳其學者桑賈爾（A.Sancar）于1973年來到美國攻讀魯伯特的博士生，開始光修復研究，并于1976年成功地鑒定出光裂解酶，此后又在20世紀 70年代末克隆和純化了這種酶的基因［6］。桑賈爾進一步發(fā)現(xiàn)這種酶包含有2種吸收藍光的發(fā)色團：甲川四氫葉酸和黃素（FADH-），他在分析研究的基礎上于20世紀80年代末提出了黃素通過將電子轉(zhuǎn)送給嘧啶二聚體并使之恢復成2個單體的推測。1994年，桑賈爾與同事對大腸桿菌光裂解酶的分子結(jié)構(gòu)進行了鑒定，并于1995年在Science上發(fā)表了突破性的論文《大腸桿菌DNA光裂解酶的晶體結(jié)構(gòu)》［7］，從而揭開了光修復的分子機制［8］，在光照下，黃素（FADH-）通過捐出 1 個電子的形式裂解二聚物從而完成了DNA直接修復。但是該假說提出后仍然有一些問題需要解決。恰恰在這期間（1993年），科學家在植物中發(fā)現(xiàn)了與光裂解酶具有高同源性但卻沒有光裂解酶功能的物質(zhì)——隱花色素（cryptochrome）或稱藍光/紫外光-A受體［9］。1998年，科學家進一步發(fā)現(xiàn)隱花色素在動物體內(nèi)也普遍存在，并且具有參與調(diào)控生物鐘的功能［10］。這種色素對光敏感，使人們又重新回憶起大腸桿菌光裂解酶的作用機理，并將兩者結(jié)合起來。2004年，德國卡瑞爾（T.Carell）團隊的艾森（L.Essen）等在分析光裂解酶在DNA修復電子轉(zhuǎn)移技術上做出了新突破，他們觀察到了光裂解酶與DNA的結(jié)合處有胸腺二聚體的存在并發(fā)生反轉(zhuǎn)［6］。2011年，華裔科學家仲東平和桑賈爾等在前幾年運用飛秒光譜技術分析的基礎上進一步發(fā)現(xiàn)：從FADH-到胸腺二聚體轉(zhuǎn)移電子需要耗時 250×10－12s，C5-C5′鍵斷裂耗時小于10×10－12s，C6-C6′鍵斷 裂 耗時 90×10－12s［8］（如圖1所示）。

圖1 光裂解酶修復胸腺嘧啶二聚體

光修復由于不需要切斷和切除部分核苷酸和堿基，故稱直接修復。除光修復外，研究人員在20世紀70年代和80年代初還發(fā)現(xiàn)了一種不需要光而是在烷基轉(zhuǎn)移酶（alkyltransferases）作用下的直接修復。這種酶的特點是將O6-甲基鳥嘌呤上烷化基團轉(zhuǎn)移到自身，從而消除了對DNA分子的損傷［11］。

2 DNA切除修復的發(fā)現(xiàn)與揭示

早在1958年，在多倫多約克角大學工作的科學家希爾（Ruth Hill）就發(fā)現(xiàn)，即使不經(jīng)可見光的照射，大腸桿菌同樣能夠修復由紫外線造成的損傷。這說明DNA中還存在著暗修復。20世紀60年代科學家開始了暗修復機制的研究。

2.1 核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER） 1964年，有3篇學術論文首次描述了核苷酸的切除修復［12］。首先是美國國家橡樹嶺研究所的塞特盧和甘瑞葉（William Carrier）小組及耶魯大學的霍華德-佛蘭德斯（Paul Howard-Flanders）及其博士生博伊斯（Richard Boyce）小組分別發(fā)現(xiàn)，紫外線照射下引起大腸桿菌突變形成的胸腺二聚體是以寡核苷酸的形式從DNA中被切除?；羧A德-佛蘭德和博伊斯還發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的3個突變體系中有些突變體只有進行可見光照射后才能修復，有些則不需要［13］。大約在同一時間，哈納沃特（Philip Hanawalt）和佩蒂約翰（David Pettijohn）通過用5-溴尿嘧啶的追蹤實驗報道了大腸桿菌會以非半保留復制的形式進行核苷酸的切除修復［14］。核苷酸切除修復如何完成？1983年，桑賈爾等運用克隆DNA基因的方法發(fā)現(xiàn)，當受到紫外線照射時，DNA中出現(xiàn)的二聚體會促使細胞產(chǎn)生一種信號，誘導出 UVrA、UVrB、UVrC 3種蛋白，這些蛋白形成復合體（亦叫UVrABC），在損傷的部位雙向內(nèi)切，并將含二聚體的片段切除下來。這3種蛋白分子被美國科學雜志提名為1984年“年度分子”［2］。

2.2 堿基切除修復（base excision repair，BER）20世紀70年代，瑞典科學家林達爾（Tomas Lindahl）在博士后期間便開始關注DNA穩(wěn)定性的維持及其相關機制問題。他在研究DNA尿嘧啶切除的機制時，發(fā)現(xiàn)一種酶能切除含有嘧啶二聚體的一段寡核苷酸，進一步研究發(fā)現(xiàn)其作用與核苷酸切除修復不同，而是催化DNA的尿嘧啶-糖鍵分裂，為此，該酶被命名為糖基化酶。由于這種切除機制發(fā)生在堿基上，這種修復被稱之為堿基切除修復［15］。1986年，堿基切除修復分子機制的全過程得到揭示。1996年，林達爾成功地在試管中完成了人類DNA的堿基切除修復［16］。

3 DNA的SOS修復

早在 1944年，威特金（Evelyn Witkin）在冷泉港實驗室德梅雷茨指導下攻讀博士學位時發(fā)現(xiàn)，紫外線能誘導出比親本耐受高100倍的抗紫外線或X線的突變菌株,更為奇怪的是那些被殺死的非突變菌株在死亡之前要生長成通常長度50～100倍的蛇樣細絲，而突變體則不受影響，這意味著非突變菌株在紫外線作用下停止細胞分裂［17］。為什么對非突變體會出現(xiàn)這種現(xiàn)象，而對突變體卻無此影響？1953年，瑞士科學家韋格爾（Jean Weigle）等用UV照射細菌和λ噬菌體進行了以下更清晰的實驗，如表1。

表1

在這4個實驗中，實驗1是對照實驗，實驗2說明UV能使突變增加，這都屬于正?，F(xiàn)象。實驗3卻有一個奇怪的現(xiàn)象，細菌不僅死亡較少，而且噬菌體突變較多。隨后前者被克羅地亞籍的科學家拉德（Miroslav Radman）稱為 W-復活（Weigle的首字母，亦叫UV-復活），后者叫W-誘變。實驗4的現(xiàn)象更為奇特，照射大腸桿菌不僅使細菌存活而且還導致突變增加［18］。為什么會出現(xiàn)這種現(xiàn)象？研究人員推測在DNA復制中一定存在著一種DNA損傷耐受機制，這種耐受機制是什么？威特金在20世紀60年代通過進一步研究認為，使DNA復制修復并非是UV輻射誘變機制直接作用的結(jié)果，而是UV輻射觸發(fā)了DNA分子上的化學反應，由此導致了阻遏物的抑制，從而使DNA復制得以修復［19］。20世紀60年代末，科學家證實是RecA蛋白和LexA蛋白在該過程中起著關鍵作用［20］?；谶@些對大腸桿菌研究的成就，1970 年，拉德先以書信的形式提出了SOS修復（SOS repair）設想，1974年拉德公開發(fā)表了該假說［21］。隨后美恩蒂（K.MeEntee）等在1977年檢定出rceA基因的產(chǎn)物——RceA蛋白［22］。1982年，利特爾（Little J.W.）和芒特（Mount D.W.）在此基礎上完善了該假說，并升華到SOS修復系統(tǒng)的高度。該假說認為，首先是DNA損壞使單鏈的DNA激活recA基因（重組A基因）產(chǎn)生RecA蛋白，后者消除LexA（正常情況下產(chǎn)生的阻遏蛋白）對recA基因的阻遏，使DNA得以修復。同年，威特金對這一模式作了進一步完善[23]。1986年，比利時女科學家米歇爾（G.Maenhaut-Michel）發(fā)現(xiàn)后來（1999年）被稱為 DNA聚合酶Ⅳ與SOS修復有關［18］。20世紀80年代末到 90年代初，?？茽査梗℉arrison Echols）又進一步完善和解釋了該假說的機制。到20世紀80—90年代，該機制才得到了證實，并被證實是一種跨過突變區(qū)的低保真度的DNA旁路修復。SOS修復由于錯誤較多，又稱為錯誤傾向修復（errerprone repair）。后來還證實這種修復過程在真核生物中也存在［23］。由于真核細胞的復雜性，更為精確的機制仍有待于進一步揭示［3］。 1998—1999年，美國和以色列的2個研究人員發(fā)現(xiàn)這種修復是在DNA聚合酶Ⅴ的參與下進行的；到21世紀初，科學家已證實SOS系統(tǒng)至少涉及到40多個基因。2009年時又進一步證實，DNA聚合酶Ⅴ是與RecA蛋白形成復合物共同進行SOS修復過程的［20］（如圖2所示）。

圖2 紫外線誘導DNA損傷及修復過程簡圖

表2 紫外線誘導DNA損傷及修復研究重要事件

林達爾和桑賈爾因在DNA修復研究做出的貢獻，與另外一位在DNA錯配修復做出貢獻的科學家分享了2015年諾貝爾化學獎。同年，美國拉斯克基礎醫(yī)學獎被授予2位DNA修復研究方面的科學家，威特金是其中之一。需要指出的是，雖然有許多該方面研究的科學家沒有獲得諾獎，但他們功不可沒。正如桑賈爾所言，光裂解酶的發(fā)現(xiàn)者魯伯特因其開創(chuàng)性的研究應尊為“DNA修復之父”［5］。 韋格爾、塞特盧、霍華德-佛蘭德斯和哈納沃特同樣被公認功績卓著，韋格爾和塞特盧先后在1968年和2015年故去。

DNA修復的基礎性研究雖然主要在大腸桿菌和酵母菌方面，但它對人類疾病的研究有著不可估量的意義。1965年，詹姆斯·卓思卡（James Trosko）等首先用3H胸腺嘧啶的示蹤實驗發(fā)現(xiàn)某些哺乳動物細胞在紫外線照射后可以和細菌一樣形成胸腺嘧啶二聚體，而后胸腺嘧啶二聚體會被切除掉。1968年，美國學者克利弗（James J.Cleaver）等在用放射性基因技術和超速離心技術對人皮膚成纖維細胞進行體外研究時發(fā)現(xiàn)，著色性干皮膚病（XP）呈現(xiàn)細胞切除修復缺陷，首次將切除修復與人類疾病相聯(lián)系。1974年，薩瑟蘭（J.C.Sutherland）在人類白細胞中也發(fā)現(xiàn)光裂解酶的存在，以后又發(fā)現(xiàn)存在于成纖維細胞和淋巴細胞中［24］。由于DNA修復對人類疾病尤其是癌癥的研究具有重要意義，目前已經(jīng)成為研究癌癥治療的重要內(nèi)容。

總之，DNA作為儲存與傳遞遺傳信息的重要生物大分子，其分子的完整性對生物體生命活動至關重要。過量的紫外輻射可引起細胞內(nèi)DNA堿基發(fā)生突變、DNA斷裂、DNA-DNA交聯(lián)、DNA-蛋白交聯(lián)及染色體畸變等損傷。DNA損傷若不能及時修復，細胞將發(fā)生癌變或死亡。對紫外線誘導DNA損傷及修復研究的起因與發(fā)展進行梳理，不僅對于進一步探討DNA損傷修復機制，預防某些修復缺陷性疾病的發(fā)生及進行生化檢測有一定的現(xiàn)實意義，而且對遺傳學、腫瘤學、衰老學和毒理學等研究具有重要理論價值。

［1］Philip E Hockberger.History Of Ultraviolet Photobiology.http://photobiology.info/Hockberger.html

［2］PeterStrike.Bacteria and DNA repair： 50 years together.Microbiology Today,2003,30(3):8.

［3］Errol C Friedberg.A brief history of the DNA repair field.Cell Research,2008(18):3.

［4］Gwendolyn B Sancar.Enzymatic photoreactivation:50 years and counting.Mutation Research,2000(451):25.

［5］David Kroll.This Year’s Nobel Prize In Chemistry Sparks Questions About How Winners Are Selected.http://cen.acs.org/articles/93/i45/Years-Nobel-Prize-Chemistry-Sparks.html

［6］Nick Zagorsk.Profile of Aziz Sancar.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1283445/

［7］Park H W,Kim S T,Sancar A,et al.Crystal structure of DNA photolyase from Escherichia coli.Science,1995,268(5219):1866.

［8］Alexei Stuchebrukhov.Watching DNA repair in real time.PNAS.2011,108(49):19445.

［9］朱春利.植物隱花色素結(jié)構(gòu)與功能研究進展.基因組學與應用生物學,2009,28（1）：174.

［10］呂垣澄,吳曉暉.動物隱花色素研究進展.遺傳,2014,36(9):864.

［11］陳建敏.O6-烷基甲基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶研究進展.國外醫(yī)學分子生物學冊,1991,13(4):154.

［12］W Dean Rupp.Early Days of DNA Repair:Discovery of Nucleotide Excision Repair and Homology-Dependent Recombinational Repair.Yale Journal of Biology and Medicine.2013,86(4):499.

［13］Bennett van Houten.Nucleotide Excision Repair in Escherichia coli.Microbiological reviews,1990,54(1):18.

［14］Nicole Kresge,Robert D Simoni,Robert L Hill.Discovery and Characterization of DNA Excision Repair Pathways:the Work of Philip Courtland Hanawalt.The Journal of Biological Chemistry.2010,285(34):9.

［15］Lindahl,Tomas.My journey to DNA repair.Genomics,Proteomics&Bioinformatics,2013(11):2.

［16］孔璐,丁衛(wèi).細胞基因組“維穩(wěn)”的DNA修復機制:2015年諾貝爾化學獎介紹.首都醫(yī)科大學學報,2015,36（5）：823.

［17］James A Shapiro.Evelyn Witkin,Jean Weigle,The SOS Response and How E.Coli Generates Mutations in Response to UV Irradiation.http://www.huffingtonpost.com/james-a-shapiro/evelyn-witkinjean-weigle_b_1992789.html

［18］周平坤.DNA修復:基因組穩(wěn)定性保護機制的原創(chuàng)與發(fā)現(xiàn)之旅.中國生物化學與分子生物學報,2016,32（1）：1.

［19］G B Zavilgelsky.60 Years of SOS Repair.Molecular Biology.2013,47(5):605.

［20］Celina Janion.Inducible SOS Response System of DNA Repair and Mutagenesis in Escherichia coli.International Jaurnal of Biological Science,2008,4(6):338.

［21］K Mc Entee.Protein X is the product of the recA gene of Escherichia coli.PNAS,1977,74(12):5275.

［22］林良斌.SOS修復和突變生產(chǎn).湘潭師范學院學報.1991,3（6）：92.

［23］J C Sutherland,B M Sutherland.Human photoreactivating enzyme action spectrum and safelight conditions.Biophysical Journal,1975(15):435.

［24］Philip E.Hockberger.A History of UltravioletPhotobiology for Humans,Animals and Microorganisms.Photochemistry and Photobiology,2002,76(6):570.

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