草甘膦對胰蛋白酶、胃蛋白酶及禽類DNA的影響*

楊利艷 虞 波 楊 楠 張翔宇 高妙妙 陜嘉楠 張慧潔

（1山西師范大學現(xiàn)代文理學院 山西臨汾 041004 2山西師范大學生命科學學院 山西臨汾 041004）

草甘膦，即 N-（膦羧甲基）甘氨酸（C3H8NO5P）,通過抑制EPSP合成酶破壞莽草酸途徑，由此造成EPSP缺乏導(dǎo)致芳香族氨基酸減少，同時草甘膦也能通過抑制光合作用中ATP合成酶而抑制光合磷酸化的過程，從而達到除草效果［1］。研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦在植物和動物飼料中都有殘留，大豆中草甘膦的殘留量達到17 mg/kg。噴灑過草甘膦的農(nóng)田，在后茬作物例如草莓、生菜、胡蘿卜、大麥等作物中仍發(fā)現(xiàn)有草甘膦殘留［4］。草甘膦作為廣譜除草劑目前已成為世界上應(yīng)用最廣、使用量最大的農(nóng)藥品種，對農(nóng)業(yè)高產(chǎn)豐收起到重要作用。草甘膦的主要應(yīng)用及全球需求量如表1所示［2-3］。近年來，除草劑殘留的安全性受到公眾越來越多的關(guān)注。有人認為殘留的草甘膦可能會通過食物鏈進入人體從而引起異常的生理效應(yīng)［5］。有研究表明，高濃度的草甘膦會輕微抑制人體的免疫功能［6］；草甘膦對皮膚有輕度刺激作用，急性中毒時可出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭昏、腹痛、呼吸困難、共濟失調(diào)，甚至造成低血壓或肺水腫［7］。草甘膦進入消化道后對重要的消化酶有無影響，經(jīng)消化后進入血液會產(chǎn)生何種效應(yīng)等問題亟待了解，本研究試圖探究不同濃度草甘膦對生物大分子如胰蛋白酶、胃蛋白酶、DNA構(gòu)象的影響，并通過模擬體內(nèi)消化環(huán)境，了解草甘膦殘留對血液的影響。

表1 草甘膦的用量及應(yīng)用（2006—2010年）

1 材料與方法

1.1 材料 除草劑草甘膦（孟山都農(nóng)達41%草甘膦滅生性除草劑）按照說明，分別配制標準使用濃度（T1）、1.5 倍（T2）、2 倍（T3）、3 倍（T4）濃度的草甘膦溶液進行玉米葉片噴施，以噴施等量蒸餾水為對照（CK）。

玉米（Zea mays）種子鄭58由山西省農(nóng)科院小麥研究所玉米課題組提供。溫室種植，常規(guī)管理，待長至三葉期，取材。

胃蛋白酶、胰蛋白酶購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 雞血DNA的提取 取新鮮雞血細胞液（5～10 mL），利用 DNA在 0.14 mol/L的氯化鈉溶液中溶解度最低，蛋白質(zhì)溶解度高的特點，提取DNA并純化。

1.2.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶、DNA構(gòu)象的變化測定 計算并稱量胃蛋白酶粉末，加蒸餾水溶解，水浴至37℃，分裝，分別加入1/1 000體積的T1、T2、T3、T4草甘膦溶液，以加入等量蒸餾水為對照。采用TU-1901雙光束紫外分光光度計（北京普析公司）分別測定各組胃蛋白酶吸光值。胰蛋白酶吸收峰及吸光度的變化測定同胃蛋白酶。

將不同濃度的草甘膦滴入DNA溶液中，采用TU-1901雙光束紫外分光光度計測定DNA的吸光度。

1.2.3 人體胃液、腸液的模擬 分別加入1 g Na-Cl，1.6 g胃蛋白酶，3.5 mL 36.5%濃鹽酸，然后定容至 500 mL，調(diào)節(jié) pH到 1.3，配制成模擬胃液。將1.36 g磷酸氫二鉀溶于約100 mL蒸餾水中，另取2 g胰蛋白酶加水溶解，定容至200 mL，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.6，制成模擬腸液。將模擬唾液環(huán)境中的噴施過不同濃度草甘膦的玉米葉分別轉(zhuǎn)移到胃液5 h后再轉(zhuǎn)移到模擬腸液中。

1.2.4 血相指標的測定 離心腸液消化后的產(chǎn)物，棄上清液，加入已加抗凝劑的等量雞血中振蕩培養(yǎng)2 min，取血樣送于山西省臨汾市堯都區(qū)明林動物醫(yī)院進行血相指標檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對胰蛋白酶、胃蛋白酶、禽類DNA的影響

2.1.1 不同濃度草甘膦對胃蛋白酶構(gòu)象的影響蒸餾水加入胃蛋白酶溶液后，將其反應(yīng)液于波長為280 nm處進行掃描，結(jié)果顯示胃蛋白酶在276 nm處有最大吸收峰，吸光度為1.105 Abs。

圖1 不同濃度草甘膦下胃蛋白酶的光譜掃描圖

不同濃度的草甘膦溶液加入胃蛋白酶溶液后，其最大吸收峰和吸光度均發(fā)生了變化，總趨勢為：隨著草甘膦濃度的增加，胃蛋白酶溶液的吸光度增大；T1組草甘膦較蒸餾水使胃蛋白酶溶液最大吸收峰左移，草甘膦濃度增加，其最大吸收峰不再改變。

表2 不同濃度草甘膦下胃蛋白酶的最大波峰及其吸光度

表2中的數(shù)據(jù)與圖1掃描結(jié)果相吻合。可見，草甘膦處理后，其反應(yīng)液吸光度較對照組增大，表明一定濃度的草甘膦對胃蛋白酶有一定影響，且在等量的人工胃液中加入0.01 g草甘膦時影響最大。結(jié)果說明，草甘膦與胃蛋白酶的相互作用會改變芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使其所處環(huán)境的疏水性增強。同時表明，取食有草甘膦殘留達0.01 g的作物后可能對動物胃蛋白酶的構(gòu)象影響最大。

2.1.2 不同濃度草甘膦對胰蛋白酶構(gòu)象的影響結(jié)果可見，4個濃度的草甘膦均使胰蛋白酶最大吸收峰左移至268 nm，各處理均較對照吸光度升高，且隨著草甘膦濃度升高，胰蛋白酶吸光度增加。

表3數(shù)據(jù)與圖2結(jié)果一致，即隨著草甘膦濃度的增加，胰蛋白酶的最大吸收峰均向左移，且均在268 nm處有最大吸收峰，同時吸光度也逐漸增加且均高于對照組。結(jié)果表明：草甘膦與胰蛋白酶的相互作用改變了芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使其所處環(huán)境的疏水性增強。說明動物取食有草甘膦殘留的作物后對動物的胰蛋白酶的構(gòu)象有一定影響，且隨著草甘膦濃度的增加影響愈大。

表3 不同濃度草甘膦下胰蛋白酶的最大波峰及其吸光度

圖2 不同濃度草甘膦下胰蛋白酶的光譜掃描圖

2.1.3 不同濃度草甘膦對DNA構(gòu)象的影響 由圖3可知，對照組和處理組均在同一波長下有最大吸收峰。表4數(shù)據(jù)表明，各處理組中DNA均在260 nm處有最大吸收值，隨著草甘膦濃度的增加，DNA的吸光度值在不斷增加，且均高于對照。由此可知，一定濃度的草甘膦對DNA的構(gòu)象有影響，且草甘膦的濃度越大影響越大。

圖3 不同濃度草甘膦下DNA在190～600 nm波段處的綜合光譜掃描圖

表4 不同濃度草甘膦下DNA在最大波峰處的吸光度值

2.2 草甘膦殘留對雞血相指標的影響 由檢測結(jié)果（表5）可以看出草甘膦殘留對于雞血相的各項指標均有不規(guī)律的影響，其中白細胞數(shù)量隨草甘膦濃度增加呈先增后降的趨勢，這是動物自身的免疫反應(yīng)，同時也表明當草甘膦濃度達2倍標準使用濃度時，動物自身已無法調(diào)節(jié)。

表5 玉米葉片草甘膦殘留對雞血相指標的影響

3 結(jié)論與討論

在動物體內(nèi)，消化功能依靠胃腸運動的機械性消化和消化酶作用的化學性消化完成。消化液中含有大量消化酶，可促進食物中糖、脂肪、蛋白質(zhì)的水解，由大分子物質(zhì)變?yōu)樾》肿游镔|(zhì)，以便被機體吸收利用。消化酶的生物活性受到影響時會對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收造成不利，使機體產(chǎn)生一些病癥［8］。胃液中的胃蛋白酶和胰液中的胰蛋白酶是2種重要的消化酶。本實驗結(jié)果顯示，不同劑量的草甘膦作用于胃蛋白酶和胰蛋白酶后會對其產(chǎn)生一定影響：隨著草甘膦劑量的增加，胃蛋白酶和胰蛋白酶的最大吸收峰均向左移，且與對照組相比其吸光度值都明顯增大，本實驗結(jié)果說明使用標準濃度1.5倍以上劑量的草甘膦，與胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用，會改變芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使其所處環(huán)境的疏水性增強，胃蛋白酶和胰蛋白酶構(gòu)象受到影響，可能會對動物的消化產(chǎn)生影響。血相指標的變化表明，草甘膦殘留經(jīng)消化吸收進入血液中將會對禽類血液大部分指標（WBC、MCHC、PLT等）產(chǎn)生無規(guī)律且較大的影響。生物有機體內(nèi)的主要遺傳物質(zhì)是DNA，本實驗研究結(jié)果可知，不同劑量的草甘膦作用于DNA后其吸光度值均較對照組相比增大，且草甘膦的量越大，作用DNA后，DNA的吸光度值越大。核酸變性時，吸光度升高［9］，因此說明草甘膦與DNA相互作用后改變了DNA的構(gòu)象破壞了其三級結(jié)構(gòu)，使得游離的核苷酸濃度增加。

草甘膦目前注冊登記作物已達50種以上［5］。研究表明，草甘膦可以在植物中進行代謝［6］，同時對動物有影響。妊娠期雌鼠長期接觸草甘膦除草劑，會引起后代大腦的多種功能性變異［10］；草甘膦對懷孕雌鼠有毒害作用，并延遲其胎兒的骨骼發(fā)育［11］。在一定條件下草甘膦等除草藥劑均會導(dǎo)致植物細胞產(chǎn)生大量的活性氧［12］，進而對細胞造成損傷［13］。 趙偉等［14］研究表明，草甘膦能降低小鼠的總抗氧化能力，引起機體脂質(zhì)過氧化，損害蛋白質(zhì)，使機體處于應(yīng)激狀態(tài)，增強致病因素的毒性作用，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。有實驗證明草甘膦對哺乳動物細胞具有致突變性，對小鼠精子產(chǎn)生損害，對雄性生殖細胞具有潛在的誘變危害［15］。肖永紅等［16］研究表明，亞致死劑量的草甘膦溶液對中華大蟾蜍蝌蚪的生長發(fā)育具有明顯的抑制作用，蝌蚪體長、體寬、尾長、尾寬和體質(zhì)量的增長率均與草甘膦濃度呈負相關(guān)［17］。本實驗發(fā)現(xiàn)隨著草甘膦濃度的增加，其對雞血DNA三級結(jié)構(gòu)的影響愈大，即草甘膦濃度越高，動物精細胞吸收草甘膦后對生殖的潛在影響越大。草甘膦經(jīng)消化吸收進入血液后會造成何種影響，也是本研究關(guān)注的問題。血相指標對血液吸收的物質(zhì)非常敏感，本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)模擬胃液、腸液消化后的殘留物對血相指標均有一定影響。因此，綜合本實驗研究結(jié)果，建議采用不同策略，例如：1）采用綜合防治技術(shù)，例如農(nóng)藝措施、機械除草、化學除草相結(jié)合；2）交替使用不同除草劑；3）開發(fā)新型除草劑；4）培育不同抗除草劑作物品種，以延緩或降低作物對草甘膦的抗性，從而降低草甘膦的使用，對保證動物的安全有重要意義。

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