傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬鏈球菌混合感染的診斷與防治

徐引弟，王治方，李海利，張青嫻，朱文豪，焦文強(qiáng)，郎利敏，王克領(lǐng)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬鏈球菌混合感染的診斷與防治

徐引弟，王治方，李海利，張青嫻，朱文豪，焦文強(qiáng)，郎利敏，王克領(lǐng)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

2016年3月初，河南省某規(guī)模化豬場(chǎng)肥育豬發(fā)病，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷，分離到1株傳染性胸膜肺炎放線桿菌和1株豬鏈球菌，對(duì)這兩種菌分別進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。結(jié)果同時(shí)對(duì)這兩種菌敏感的藥物有：頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢呋辛、氧氟沙星和氯霉素。

傳染性胸膜肺炎放線桿菌；豬鏈球菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

2016年3月初，河南省某規(guī)?；i場(chǎng)生長(zhǎng)肥育豬突然發(fā)病，表現(xiàn)為高燒、呼吸困難、口鼻流泡沫，有的出血，死亡極快。剖檢肺臟出血、間質(zhì)增寬水腫、心內(nèi)膜出血嚴(yán)重，其余臟器未見明顯病變。根據(jù)發(fā)病及剖檢情況初步懷疑為傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）和豬鏈球菌（Streptococcus Suis,SS）混合感染。因此對(duì)這兩種病原進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷，并對(duì)該混合感染病原進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 分離鑒定

1.1.1 分離純化 無菌將病料（肺、氣管、心血）接種于含NAD（Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）和血清的TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白大豆瓊脂）固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～24 h。分別挑取可疑菌落抹片革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察。

1.1.2 培養(yǎng)特性 將可疑菌落分別接種不含NAD和血清的TSA、不含NAD但含血清的TSA平板，觀察菌落生長(zhǎng)情況和形態(tài)大小。

1.1.3 PCR鑒定 參照文獻(xiàn)[1-2]，根據(jù)APP apxIV序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5-GCTCACCAACGTTTGCTC AT-3'，下游引物：5'-GGGGACGTAACTCGGTGATT-3'，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為377 bp大小的片段。參照文獻(xiàn)[3-5]，根據(jù)豬鏈球菌gdh基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3'，下游引物：5-CCATGGACAGATAAAGATGG-3'，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為689 bp大小的片段，引物由上海生工生物工程公司合成。反應(yīng)體系（50 μL）：10×緩沖液5 μL， 2 mM dNTPs 1 μL，10 μM/L上下游引物各1 μL，TaqE 1 μL，模板（刮取少量新鮮菌落溶于生理鹽水中）1 μL，滅菌ddH2O 40 μL。反應(yīng)條件：94℃變性4 min，進(jìn)入循環(huán)：94℃1 min，59℃1 min，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2 藥敏試驗(yàn)

將分離鑒定好的細(xì)菌接種于綿羊全血平皿，涂勻，選取相應(yīng)抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌環(huán)直徑并判定結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性

培養(yǎng)24 h后，平皿上有2種菌落，一種稍大黃色不透明，革蘭氏染色為革蘭氏陰性短小球桿菌，多散在，少量短鏈或長(zhǎng)鏈（圖1）。大菌落在加有血清和NAD的TSA培養(yǎng)基上24 h長(zhǎng)成半透明菌落，針尖大小，直徑1～2 mm，側(cè)對(duì)光線有虹光。在不含NAD和血清的TSA培養(yǎng)基、不含NAD但含血清的TSA培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)，表明分離的菌株具有NAD依賴性。在血平板上48 h長(zhǎng)成針尖大小的半透明菌落，有溶血現(xiàn)象。另一種菌落較小，在加有血清的TSA培養(yǎng)基上24 h長(zhǎng)成半透明菌落，針尖大小直徑1～2 mm。在不含NAD和血清的TSA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。在血平板上24 h長(zhǎng)成針尖大小的半透明菌落，有α溶血現(xiàn)象。革蘭氏染色為陽性球菌或球桿菌，散在或成雙，部分形成短鏈（圖2）。

圖1 傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌體形態(tài)

圖2 豬鏈球菌菌體形態(tài)

2.2 PCR鑒定

對(duì)第1種菌落進(jìn)行APP的擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶。對(duì)第2種菌落進(jìn)行SS的擴(kuò)增，也擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶（圖3）。

圖3 APP和SS PCR擴(kuò)增結(jié)果

綜合以上鑒定結(jié)果，本次發(fā)病為傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬鏈球菌的混合感染。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)

從藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果看，對(duì)傳染性胸膜肺炎放線桿菌敏感的藥物有：頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他定、頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢呋辛、阿奇霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、壯觀霉素。對(duì)傳染性胸膜肺炎放線桿菌耐受的藥物有：阿莫西林、氨芐西林、利福平、四環(huán)素、卡那霉素、紅霉素、克林霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、新霉素、復(fù)方新諾明、阿米卡星、林可霉素。

對(duì)豬鏈球菌敏感的藥物有：頭孢哌酮、阿莫西林、氨芐西林、頭孢他定、氧氟沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松、氯霉素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、利福平、復(fù)方新諾明、青霉素G。對(duì)豬鏈球菌耐受的藥物有：阿奇霉素、頭孢克肟、四環(huán)素、卡那霉素、紅霉素、恩諾沙星、克林霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、新霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、林可霉素、壯觀霉素。

綜合2種菌的藥敏結(jié)果，對(duì)2種菌同時(shí)敏感的藥物有：頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他定、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢呋辛、氧氟沙星、氯霉素。

2.4 綜合防治

根據(jù)鑒定結(jié)果，確定本次發(fā)病原因?yàn)閭魅拘孕啬し窝追啪€桿菌和豬鏈球菌混合感染，采取了相應(yīng)的綜合防治措施，首先隔離發(fā)病豬，徹底消毒，全群添加氟苯尼考和氧氟沙星，發(fā)病豬注射頭孢噻肟。1周后，病情得到了控制，豬群恢復(fù)正常，未再有發(fā)病死亡情況。

3 討論

由于及時(shí)快速地確診了病原，本次疫情很快得到了很好的控制。對(duì)于急性發(fā)病死亡的情況以及剖檢情況我們初步懷疑為傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒其中之一或混合感染。對(duì)于后3種病毒病，我們進(jìn)行了PCR鑒定，均為陰性，排除了病毒病的可能。而從病料中大量分離到傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬鏈球菌，且兩種菌的含量高，沒有分離到其它病菌，因此本次鑒定的結(jié)果是科學(xué)可靠的，符合疫情。根據(jù)鑒定結(jié)果制定的防治措施科學(xué)得當(dāng)，及時(shí)控制了疫情，減少了損失。

[1]陳凡．胸膜肺炎放線桿菌血清學(xué)分型和基因分型的研究[D]．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004．

[2]Schaller A,Djordjevic S P,Eamens G J,et al.Identification and detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR based on the gene apxⅣA[J].Vet Microbiol,2001,79(1):47-62.

[3]何孔旺，倪艷秀，王繼春，等．豬鏈球菌分子流行病學(xué)[J]．中國(guó)人畜共患病雜志，2002，18（5）：45-47．

[4]閆若潛，趙明軍，張志凌，等．河南省致病性豬鏈球菌血清型及耐藥性狀況調(diào)查[J]．河南畜牧獸醫(yī)（綜合版），2007，28（5）：25-27．

[5]Okwumabua O,O'Connor M,Shull E.A polymerase chainreaction (PCR)assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J].FEMS Microbiol Lett, 2003,218(1):79-84.

（編輯：柳青）

頸眩湯

組成：赤芍12克，當(dāng)歸10克，熟地黃20克，川芎12克，天麻12克，白術(shù)15克，茯苓15克，竹茹10克，丹參20克，甘草3克。

功效：活血養(yǎng)血，祛痰化瘀，通絡(luò)止眩。

主治：頸椎病眩暈。

用法：煎服，1日1劑，早、中、晚各服1次。

方解：頸椎病眩暈癥多見于中老年人，屬于中醫(yī)學(xué)眩病范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病是因老年體弱、正氣不足、氣血虧虛、肝腎不足、久病氣血凝滯、夾痰夾瘀、脈絡(luò)不通而發(fā)病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為無痰不作眩，本病病機(jī)為本虛（氣血虧虛、肝腎不足）標(biāo)實(shí)（瘀血痰阻）。頸眩湯乃治療痰瘀致眩之方。方中赤芍和血通絡(luò)；當(dāng)歸、熟地黃和血養(yǎng)血治頭暈?zāi)垦＃淮ㄜ荷闲蓄^目，以活血祛瘀；天麻平肝息風(fēng)而止頭眩；白術(shù)、茯苓健脾燥濕，與天麻配伍共增化痰止眩之功；竹茹祛痰，以竹之脈絡(luò)通人之脈絡(luò)也；丹參活血通絡(luò)祛瘀；甘草調(diào)和諸藥。諸藥共用以達(dá)化痰祛瘀止眩、養(yǎng)血通絡(luò)的功效。

加減運(yùn)用：伴眠差者加牡蠣、五味子；伴嘔吐者加半夏、藿香；伴耳鳴者加柴胡、黃芪、通草；伴面色淡白或萎黃，神疲乏力者加黃芪、太子參、阿膠；伴腰膝酸軟，夜尿頻多者加芡實(shí)、菟絲子、牛膝；伴頭目脹痛，急躁易怒者加鉤藤、石決明；伴口苦目赤，心煩者加龍膽草、黃芩、梔子。

（摘自《中國(guó)中醫(yī)藥報(bào)》2016.11.24霍 田/文）

S858.285.1

A

1002-1957(2017)02-0103-02

2017-01-13

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（162102110042）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2016）

徐引弟（1974-），女，湖北浠水人，副研究員，博士，主要從事動(dòng)物病原微生物研究.E-mail：445177674@qq.com