黃芪藥材不同提取部位增強(qiáng)免疫力的藥效學(xué)研究

洪 妍， 劉小花， 陳亞麗， 王 波,2，徐紅坤， 吳志華， 閔云霞， 封士蘭

(1.蘭州大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000)

黃芪藥材不同提取部位增強(qiáng)免疫力的藥效學(xué)研究

洪 妍1， 劉小花1， 陳亞麗1， 王 波1,2，徐紅坤1， 吳志華1， 閔云霞1， 封士蘭1

(1.蘭州大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000)

比較研究了黃芪藥材不同提取部位對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的藥理活性.灌胃給予正常小鼠和免疫抑制小鼠黃芪的不同提取部位，檢測(cè)了小鼠的吞噬指數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)程度、外周白細(xì)胞總數(shù)、臟器指數(shù)及干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素- 4(IL- 4)的水平.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃芪水煎煮部位和小分子部位能顯著提高正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫功能(P<0.01；P<0.05)；10批黃芪藥材小分子部位均能明顯提高免疫抑制小鼠的吞噬指數(shù)和DTH程度(P<0.01；P<0.05)；某些產(chǎn)地樣品能顯著提高免疫抑制小鼠的臟器指數(shù)及IFN-γ，IL- 4的水平(P<0.01；P<0.05)，表明黃芪藥材的產(chǎn)地與免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān).

免疫調(diào)節(jié)；黃芪藥材；吞噬指數(shù)；遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

黃芪在免疫調(diào)節(jié)方面有著非常悠久的用藥歷史.《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提出“正氣存內(nèi)，邪不可干”，其中的“正氣”即為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所說的免疫力[1].《本草綱目》中稱黃芪為“補(bǔ)者之長”，“可治一切氣衰血虛之癥”.現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)[2]，黃芪可顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高癌癥患者的生存質(zhì)量.

本實(shí)驗(yàn)室前期研究獲得了黃芪95%乙醇提取物的5個(gè)不同的提取部位，并進(jìn)行了小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)[3]，結(jié)果顯示其中水提取部位具有增強(qiáng)小鼠免疫力的作用.結(jié)合中醫(yī)臨床黃芪用藥療效部位，其水煎煮提取生產(chǎn)工藝簡單、成本低廉，提示黃芪水煎液提高機(jī)體免疫功能的藥效成分可能來源于小分子物質(zhì).據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮提取工藝得到了黃芪水煎液，并通過乙醇沉淀得到其上清小分子部位和醇沉部位.本文探討了所獲得的黃芪不同提取部位對(duì)正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，篩選出黃芪提高免疫力的較優(yōu)部位；進(jìn)而，對(duì)黃芪藥材的較優(yōu)藥效部位進(jìn)行了多指標(biāo)(吞噬指數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度、外周白細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞因子及臟器指數(shù))測(cè)定分析，綜合評(píng)價(jià)篩選出黃芪藥材提高免疫力的最優(yōu)部位；最后，研究了不同產(chǎn)地黃芪藥材最優(yōu)部位的免疫調(diào)節(jié)作用，以期說明黃芪產(chǎn)地與藥性的關(guān)系.

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào) SCXK(甘)2013- 0002.給藥前一周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水.

1.2 藥材與試劑

10批黃芪藥材，2015年購買或采自全國產(chǎn)地種植或野生黃芪，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定均為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao，編號(hào)及來源見表1.

注射用環(huán)磷酰胺(安道生，德國百特公司，批號(hào)為5K084A)；印度墨汁(西安羅森伯科技有限公司)；2,4- 二硝基氟苯(DNFB，麥克林股份有限公司)；硫化鈉(天津市巴斯夫有限公司)；芝麻油(上海太太樂食品有限公司)；小鼠IFN-γ,IL- 4 ELISA試劑盒(欣博盛生物科技公司，批號(hào)均為160729).

表1 黃芪藥材的來源

1.3 主要儀器

CR22GII,HITACHI離心機(jī)(日本株式會(huì)社日立制作社)；Z36HK超高速冷凍離心機(jī)(德國賀默儀器科技有限公司)；Freezone 6PWS型真空冷凍干燥儀(美國Labconco公司)；UV- 1700 紫外分光檢測(cè)儀(日本島津公司)；BC- 5390 CRP全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司)；550酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國Bio- Rad 公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

稱取已粉碎的黃芪藥材(產(chǎn)自內(nèi)蒙古銀號(hào)) 500 g，按文獻(xiàn)[3]方法提取，濃縮得到水提取部位.

稱取1 kg黃芪藥材，依次用10倍量水煎煮2 h，8倍量水煎煮1.5 h及6倍量水煎煮1 h，合并水煎液，過濾，取其中1/2濃縮至干，即得水煎煮部分；剩余1/2濃縮后加乙醇使其最終體積分?jǐn)?shù)為70%，靜置沉淀過夜后離心，上清液濃縮至干得到小分子部分，沉淀真空冷凍干燥得醇沉部分.根據(jù)各部分的出膏率換算出小鼠的給藥劑量.

2.2 黃芪不同提取部位對(duì)正常小鼠免疫功能的作用

將100只小鼠隨機(jī)分成免疫Ⅰ組和Ⅱ組兩大組，Ⅰ組進(jìn)行碳廓清實(shí)驗(yàn)，Ⅱ組進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)實(shí)驗(yàn)及胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定.每大組下設(shè)5個(gè)小組，分別為空白對(duì)照組和4個(gè)不同部位的給藥組，每組10只小鼠.空白對(duì)照組給予生理鹽水，各給藥組按原生藥5.0 g·kg-1的劑量換算后給予黃芪提取物.連續(xù)給藥4周后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo).

2.3 黃芪不同提取部位對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的作用

將240只小鼠隨機(jī)分成免疫 Ⅰ 組、Ⅱ組和Ⅲ組三大組，Ⅰ組、Ⅱ組測(cè)定指標(biāo)同上，Ⅲ組測(cè)定外周血白細(xì)胞數(shù).每大組下設(shè)8個(gè)小組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組及水煎煮、小分子和醇沉部分的高、低劑量組，每組10只小鼠.空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予生理鹽水，給藥組按原生藥5.0 g/kg(低劑量)和10.0 g/kg(高劑量)換算后給藥.灌胃4周，在第3周后，除空白對(duì)照組外其余各組小鼠連續(xù)2 d腹腔注射55 mg·kg-1新鮮配制的環(huán)磷酰胺.造模后第5天測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo).

2.4 10批黃芪藥材小分子組對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的作用

將360只小鼠隨機(jī)分成Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組三大組，Ⅰ組、Ⅱ組測(cè)定指標(biāo)同上，Ⅲ組測(cè)定細(xì)胞因子IFN-γ和IL- 4的水平.每大組下設(shè)12個(gè)小組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和10批黃芪小分子高劑量組.空白對(duì)照組和模型對(duì)照組均給予生理鹽水，給藥組按原生藥10.0 g·kg-1的劑量換算后給藥.其余操作同上.

2.5 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定方法

2.5.1 碳廓清實(shí)驗(yàn)

小鼠尾靜脈注射用生理鹽水1∶3稀釋的印度墨汁10 mL·kg-1，于注射后2 min和10 min從眼眶后靜脈叢取血40 μL，加入4 mL 0.1%Na2CO3溶液中，充分混勻后在600 nm波長下測(cè)定吸光度值，以0.1%Na2CO3溶液為空白.小鼠處死后，稱量其肝臟和脾臟的質(zhì)量，按文獻(xiàn)[4]的

方法計(jì)算其吞噬指數(shù)α.

2.5.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用耳腫脹法測(cè)定小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度.小鼠腹部用8%Na2S溶液脫毛后，吸取10 mg·mL-1DNFB丙酮麻油(1∶1)溶液50 μL，均勻涂于其腹部.5 d后，將10 μL DNFB溶液涂抹于小鼠右耳兩側(cè)，24 h后處死小鼠，在其左右耳取下直徑為0.8 cm的耳片，按文獻(xiàn)[4]的方法計(jì)算，以左右耳質(zhì)量差值反映小鼠的DTH程度.

2.5.3 臟器指數(shù)測(cè)定

取小鼠的胸腺和脾臟，稱量胸腺、脾臟的質(zhì)量及體質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù).

2.5.4 外周白細(xì)胞總數(shù)測(cè)定

小鼠眼眶后靜脈叢取血，加入稀釋液中，于全血細(xì)胞分析儀中檢測(cè).

2.5.5 細(xì)胞因子測(cè)定

收集小鼠血漿，將血漿標(biāo)本按1∶2加入標(biāo)本通用稀釋液稀釋后，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，于450 nm波長處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IFN-γ和IL- 4的含量.

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 黃芪不同提取部位對(duì)正常小鼠免疫功能的作用

從表2可知：與空白對(duì)照組相比，黃芪小分子組的吞噬指數(shù)和脾臟指數(shù)均呈顯著性差異(P<0.05)；水煎煮組與空白對(duì)照組相比，除胸腺指數(shù)無顯著性差異外，其余各項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05；P<0.01)；水提取部位與空白對(duì)照組相比，僅脾臟指數(shù)呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)；醇沉組僅胸腺指數(shù)呈顯著性差異(P<0.05).由此可見，黃芪小分子組和水煎煮組較水提取部位組在改善免疫指標(biāo)方面有明顯的優(yōu)勢(shì).

表2 黃芪不同提取部位對(duì)正常小鼠免疫功能的影響

注：與空白對(duì)照組相比，##表示P<0.01；#表示P<0.05.

3.2 黃芪不同提取部位對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的作用

為了進(jìn)一步篩選出提高小鼠免疫力的最優(yōu)藥效部位，本實(shí)驗(yàn)探討了黃芪不同提取部位2個(gè)劑量組對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的作用，結(jié)果見表3.與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的5項(xiàng)指標(biāo)均有極顯著性差異(P<0.01)，說明小鼠免疫抑制模型制備成功.與模型對(duì)照組相比，小分子低劑量組的吞噬指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)；高劑量組的吞噬指數(shù)、DTH程度及胸腺指數(shù)均有極顯著性差異(P<0.01).與模型對(duì)照組相比，黃芪水煎煮低劑量組僅DTH程度具有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組的吞噬指數(shù)、DTH程度及脾臟指數(shù)均具有顯著性差異(P<0.01；P<0.05).與模型對(duì)照組相比，醇沉低劑量組的吞噬指數(shù)和外周白細(xì)胞總數(shù)均有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)；高劑量組的吞噬指數(shù)和脾臟指數(shù)有極顯著性差異(P<0.01).說明其作用存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系.

因?yàn)橥淌芍笖?shù)、DTH程度及外周白細(xì)胞總數(shù)是評(píng)價(jià)免疫功能的主要指標(biāo)，綜合正常小鼠及免疫抑制小鼠的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，可以看出，黃芪水煎煮部位和小分子部位提高小鼠免疫功能的劑量效應(yīng)關(guān)系較為顯著.據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)選用高劑量小分子組進(jìn)行不同產(chǎn)地黃芪藥材的免疫藥效學(xué)實(shí)驗(yàn).

表3 黃芪不同提取部位對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

注：與空白對(duì)照組相比，##表示P<0.01.與模型對(duì)照組相比，**表示P<0.01；*表示P<0.05.

表4 10批黃芪藥材小分子組對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

注：與空白對(duì)照組相比，##表示P<0.01；#表示P<0.05.與模型對(duì)照組相比，**表示P<0.01；*表示P<0.05.

3.3 10批黃芪藥材小分子組對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的作用

不同產(chǎn)地黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4.由表4可知:模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)，說明小鼠免疫抑制模型制備成功；與模型對(duì)照組相比，10批黃芪藥材的吞噬指數(shù)和DTH程度均明顯增加(P<0.01；P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，僅樣品1和樣品6的胸腺指數(shù)有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)，脾臟指數(shù)除樣品9和樣品10外均有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)；細(xì)胞因子方面，與模型對(duì)照組相比，樣品1,2,4,5,8和10的IFN-γ含量有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)，樣品1,2,5和10的IL- 4含量有顯著性差異(P<0.01；P<0.05).10批不同產(chǎn)地的黃芪藥材均能在不同程度上提高免疫抑制小鼠的免疫功能，山西渾源、甘肅蓮峰、甘肅雙泉及陜西渭南4個(gè)產(chǎn)地的黃芪藥材提高免疫功能的作用更為突出，說明黃芪藥材產(chǎn)地與免疫活性有著密切的關(guān)系.

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法建立免疫抑制小鼠模型.環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)作為一種細(xì)胞毒性化療藥物，主要通過干擾癌細(xì)胞核酸代謝促使癌細(xì)胞凋亡的發(fā)揮作用，是制備免疫抑制模型的一種常用藥物[5- 6].有文獻(xiàn)報(bào)道，連續(xù)注射40 mg·kg-1CTX制備免疫抑制模型特異性較差[7].結(jié)合《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[4]的造模方式，本實(shí)驗(yàn)室比較了腹腔注射幾種不同劑量CTX的造模情況，連續(xù)2 d腹腔注射55 mg·kg-1CTX，5 d后測(cè)定各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異，確定為最終的造模方式.本實(shí)驗(yàn)采用正常小鼠和免疫抑制小鼠2種方案，分別對(duì)黃芪不同提取部位進(jìn)行了多指標(biāo)測(cè)定分析，綜合評(píng)價(jià)了黃芪不同提取部位對(duì)小鼠的免疫藥效作用.

黃芪水煎液中除含有黃芪多糖等免疫活性較強(qiáng)的大分子化合物外[8]，還含有黃酮及皂苷類成分，這些小分子物質(zhì)也具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性.其中，總黃酮可以提高免疫抑制小鼠的CD4+T淋巴細(xì)胞水平，升高CD4+/CD8+比值及血清中IFN-γ的水平[9].總皂苷能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫作用，可能與其引起Ca2+濃度升高從而激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫作用有關(guān)[10].由表2和表3可以看出，黃芪水煎煮組和小分子組均能顯著提高小鼠免疫功能，在所測(cè)定的幾項(xiàng)主要指標(biāo)中，二者顯著性基本一致，說明小分子組基本可以代表黃芪水煎煮組的免疫活性.由于水煎液中醇沉部分提高免疫力效果并不明顯，說明醇沉部分在黃芪水煎液中提高免疫力的作用可忽略不計(jì).因此，本實(shí)驗(yàn)選擇黃芪小分子組進(jìn)行10批不同產(chǎn)地黃芪藥材的免疫藥效學(xué)研究.

本研究結(jié)果顯示，10批黃芪藥材小分子組可明顯提高小鼠的免疫功能.以吞噬指數(shù)、DTH程度和細(xì)胞因子含量作為主要指標(biāo)，結(jié)合胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，可以看出，山西渾源、甘肅蓮峰、甘肅雙泉及陜西渭南4個(gè)黃芪的給藥組小鼠與免疫抑制小鼠相比，其免疫學(xué)藥效指標(biāo)均有明顯提高，說明黃芪藥材的產(chǎn)地與免疫藥效作用有著密切的關(guān)系.后續(xù)研究中，可將所得藥效學(xué)數(shù)據(jù)與黃芪小分子組指紋圖譜進(jìn)行關(guān)聯(lián)，多方面綜合評(píng)價(jià)黃芪藥材質(zhì)量與免疫藥效學(xué)之間的關(guān)系，揭示道地藥材優(yōu)質(zhì)性的科學(xué)內(nèi)涵，為進(jìn)一步開發(fā)利用黃芪提供堅(jiān)實(shí)的出發(fā)點(diǎn).

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

Pharmacodynamical study about immunoenhancement effect of RadixAstragalion mice

HONG Yan1, LIU Xiaohua1, CHEN Yali1, WANG Bo1,2,XU Hongkun1, WU Zhihua1, MIN Yunxia1, FENG Shilan1

(1.CollegeofPharmacy,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China; 2.GansuEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauCentralLaboratoryofTechnicalCenter,Lanzhou730000,China)

Different RadixAstragaliextracts on immunomodulatory effect of pharmacological activities were compared. After oral administration of different RadixAstragaliextracts on normal and immunosuppressed mice, phagocytic index, delayed type hypersensitivity (DTH) degree, leukocyte count, organs index and the level of cytokines IFN-γ, IL- 4 (ELISAs) were investigated four weeks later. By the comprehensive comparison of different extracts, it was found that high dose of water decoction and supernatant extracts both significantly improved immunological function on normal and immunosuppressed mice (P<0.01;P<0.05); 10 batch of RadixAstragalisupernatant extracts significantly improved phagocytic index, DTH degree (P<0.01;P<0.05), and some samples significantly improved organs index and the level of cytokines IFN-γ, IL- 4 (P<0.01;P<0.05) on immunosuppressed mice.The source of RadixAstragalisupernatant extracts was found closely related to the immunomodulatory effect.

immunomodulatory effect; RadixAstragali; phagocytic index; delayed type hypersensitivity

10.16218/j.issn.1001- 5051.2017.02.013

2016- 12- 09；

2017- 02- 23

甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開放基金資助項(xiàng)目(ZYZL16- 007)；甘肅省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(1506RJZA316)；蘭州市城關(guān)區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016- 1- 5)

洪 妍(1991-)，女，甘肅蘭州人，碩士研究生.研究方向：中藥化學(xué)成分及藥理學(xué).

封士蘭.E- mail： fengshl@lzu.edu.cn

R285.5

A

1001- 5051(2017)02- 0201- 05