北川驢蹄草(Calthadysosmoides)花部特征研究

別鵬飛，謝歡歡，胡進耀,2*，朱云東

(1.綿陽師范學(xué)院，四川 綿陽 621000；2.綿陽蜀創(chuàng)農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 綿陽 621000； 3.北川林業(yè)局，四川 北川 622750)

北川驢蹄草(Calthadysosmoides)花部特征研究

別鵬飛1，謝歡歡1，胡進耀1,2*，朱云東3

(1.綿陽師范學(xué)院，四川 綿陽 621000；2.綿陽蜀創(chuàng)農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 綿陽 621000； 3.北川林業(yè)局，四川 北川 622750)

北川驢蹄草(CalthadysosmoidesTao Zhang et al)是2016年新命名的物種(四川特有)，為保護利用這一新種，急需研究其生殖生物學(xué)特征。本研究于不同種群中選取50株進行標記,觀察其花部特征，測試花粉活力以及柱頭可授性。采用TTC法測定花粉活力；采用液體培養(yǎng)基對北川驢蹄草花粉進行離體培養(yǎng)；采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性(直到無活力為止)。實驗結(jié)果表明：在自然條件下，北川驢蹄草4月～5月開花，單花花期一般為2 d。雄蕊短于雌蕊，花藥緊貼花柱外側(cè)，花藥與柱頭相距約3 mm，在整個花朵開放的過程中雌蕊和雄蕊的相對位置不變；花粉活力早上明顯低于下午，且于花后1 h～4 h內(nèi)增長較快，4h之后花粉活力增長較慢；柱頭具有可授性，于花后3 h時柱頭可授性相對較強。

北川驢蹄草；花部特征；花粉活性；花粉萌發(fā)；柱頭可授性

北川驢蹄草(CalthadysosmoidesTao Zhang et al)屬于毛茛科(Ranunculaceae)驢蹄草屬的一個新種，于2014年在四川片口省級自然保護區(qū)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，同時在北川羌族自治縣青片鄉(xiāng)區(qū)域內(nèi)也有少量分布，一般生于海拔為1 900 m～2 500 m的潮濕山谷或溪邊，以及相對比較陰濕的林下草坡處。北川驢蹄草作為新發(fā)現(xiàn)物種，相關(guān)研究較少，主要涉及到物種分類方面[1]、群落特征方面[2]。但有關(guān)北川驢蹄草的生殖生物學(xué)研究尚未見報道。

1 研究地點與方法

1.1 研究區(qū)域概況

本文所研究區(qū)域位于四川省片口省級自然保護區(qū)內(nèi)，地理坐標為：北緯32°02′～32°12′，東經(jīng)104°10′～104°26′。選取研究的北川驢蹄草主要分布于不同海拔的5個地點[2](表1)，具體位于北川縣片口、小壩、開坪3個鄉(xiāng)境內(nèi)。地處四川盆地西緣，青藏高原東南緣岷山中段，龍門山西側(cè)，與平武泗耳自然保護區(qū)的鎖江、大印交界，東與本縣都貫羌族鄉(xiāng)、南與小壩羌族藏族鄉(xiāng)，西與青片羌族藏族鄉(xiāng)接界，海拔1 100 m～3 320 m。保護區(qū)內(nèi)氣候溫和，四季分明，雨量充沛，年均氣溫15.6℃，為亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候。特殊的地理位置與濕熱的氣候條件，使自然保護區(qū)內(nèi)的植被垂直地帶性分布明顯，森林資源豐富，動植物種類繁多[3～5]。

表1不同海拔北川驢蹄草的分布狀況

Tab.1Distribution of Beichuan Caltha at different altitudes

1.2 材料與方法

1.2.1 花部構(gòu)成特征調(diào)查

從2016年4月到2016年5月花期結(jié)束，照Dafni(1992)所述標準對盛花期北川驢蹄草的開花動態(tài)進行觀測，每次取20 m×20 m的樣方，單花花期，每株1朵花，觀測時均注意記錄花朵開放、花粉散出、柱頭伸長、花蜜與氣味開始和持續(xù)的時間等，并記錄花朵形狀、大小、顏色和它們的時空動態(tài)，尤其注意柱頭與花藥的位置，觀察并記錄其花部特征[6]。隨機選取50株驢蹄草植株進行標記，用游標卡尺測量并記錄開花時間及花器官各部分大小。

1.2.2 TTC法花粉活性測定

于每天8：30～18：30每隔3h分別采集不同發(fā)育時期的新鮮花備用?；ǚ刍盍Σ捎肨TC法測定[7](將新鮮花粉置于載玻片上，同時用火加熱致死的花粉作對照)。具體操作如下：將開花后不同時期的花粉撒在載玻片上，滴加1～2滴0.5%TTC溶液(2,3,5—氯化三苯基四氮唑；用0.2 M、pH7.2的磷酸緩沖液配制成0.5%TTC溶液并加入適量10%的蔗糖溶液)，迅速蓋上蓋玻片，置入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放在25°C黑暗條件下培養(yǎng)2h左右。在顯微鏡下觀察，若花粉變紅則表明有活力，若紅色很淺或無變化或變黑色則表明無活性。統(tǒng)計全部花粉中紅色花粉所占比例(每片載玻片上的花粉數(shù)>500粒，重復(fù)5朵花)。

1.2.3 花粉萌發(fā)觀察

采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法，培養(yǎng)基的組分為：蔗糖+硼酸+硝酸鈣，其中外源鈣濃度為0.1%，蔗糖濃度為10%、20%、30%，硼酸濃度為10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1，以兩者不同濃度組合配置12種培養(yǎng)液，分別置于干凈培養(yǎng)皿中。野外采集花開而花藥未開裂的花朵，將少量花粉均勻撒于培養(yǎng)基上，在室溫條件下分別培養(yǎng)0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h后鏡檢。每種培養(yǎng)基制片3張，每張裝片隨機選取5各視野觀察，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率并計算平均值。參照賴煥林等的研究方法并做適當調(diào)整，認為當花粉粒表面有不規(guī)則凸起時，花粉即為萌發(fā)。計算公式=：A=(x/y)*100%。式中A=花粉萌發(fā)率(%)；x=視野中已萌發(fā)花粉數(shù)；y=視野中花粉粒總數(shù)。

1.2.4 柱頭可授性的測定

用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性[8]，直到無活力為止。去除花的各部分僅剩下雌蕊(柱頭)；加入聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液(1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水 = 4∶11∶22，體積比)于凹槽中，并立即觀察；若柱頭具有可授性，其周圍發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)藍色并伴有大量氣泡出現(xiàn)，此時認真觀察并記錄其活力情況；否則無氣泡產(chǎn)生且不變藍。

2 結(jié)果與分析

調(diào)查研究結(jié)果表明，在自然條件下，北川驢蹄草4月～5月開花，群體花期約60 d，全體盛花花期約25 d，集中在4月15日～5月10日，單株花期10 d～15 d，單花花期2 d。雄蕊短于雌蕊，花藥緊貼花柱外側(cè)，花藥與柱頭相距約3 mm，在整個花朵開放的過程中雌蕊和雄蕊的相對位置不變。

2.1 北川驢蹄草花部構(gòu)成特征

北川驢蹄草為單歧聚傘花序，兩性花，由3朵小花組成1個花序，隱藏于葉下開放(圖1)。片口驢蹄草每朵小花花梗長25 cm～50 cm，小花多有5片萼片，深紅色，分為兩層，上層兩片，下層3片(圖2)，少有6～8片萼片。萼片長15 cm～25 cm，寬10 cm～20 cm。雄蕊25～50枚，呈黃色，雄蕊長5 cm～10 cm，花藥黃色，花藥位于花柱外側(cè)，柱頭下方。雌蕊10～15枚，呈綠色，雌蕊長5 cm～10 cm，柱頭位于花柱頂端，直徑約5 mm，長約8 mm(表2)。

圖1 北川驢蹄草的單歧聚傘花序Fig.1 The monochasium of Beichuan Caltha

圖2 北川驢蹄草花部特征Fig.2 The characteristics of Beichuan Caltha

2.2 TTC法花粉活力檢測結(jié)果

選取當天開花后2 h、4 h、6 h和8 h的北川驢蹄草花粉進行TTC法花粉活性測定，結(jié)果表明：北川驢蹄草花粉活性在8 h期間呈上升趨勢(圖3)，前4 h上升趨勢較快，后4 h增勢趨緩。從圖3可以看出花粉的活力在散粉后第8小時已經(jīng)趨于最大值，部分花粉活力仍具有增勢。

表2 北川驢蹄草的花朵性狀

Tab.2 Floral quantitative character of BeichuanCaltha

觀測項目Items尺寸大小Size花朵直徑Flowerdiameter(mm)25．45±6．11花梗長Pedicellength(mm)37．23±10．23萼片長Sepallength(mm)19．90±3．85萼片寬Sepalbreadth(mm)18．57±3．58柱頭直徑Stigmadiameter(mm)0．49±0．20柱頭高Stigmaheight(mm)86±0．92花柱高Styleheight(mm)6．83±1．45雄蕊長Stamenslength(mm)6．93±1．28雌蕊長Gynoeciumlength(mm)7．69±1．41

圖3 當天花粉活力隨時間的變化Fig.3 Changes of pollen viability in the following times

2.3 北川驢蹄草花粉萌發(fā)實驗結(jié)果分析

采用液體培養(yǎng)基進行花粉萌發(fā)實驗(表3)。結(jié)果表明，花粉管生長狀況良好；所測得花粉萌發(fā)情況及萌發(fā)率和TTC法花粉活力測定結(jié)果較為一致，萌發(fā)率略高于TTC法花粉活力測定值，兩者實驗結(jié)果起到互相檢測和修正的作用。

表3 北川驢蹄草8h內(nèi)(白晝)的花粉萌發(fā)

Tab.3 Germination test of BeichuanCaltha pollen within 8 hours (daytime)

取樣時間(h)Samplingtime視野平均花粉總數(shù)(個)Averagepollennumber花粉萌發(fā)數(shù)(個)Pollengerminationnumber花粉萌發(fā)率(%)Pollengerminationrate1672780．1226321540．2436741820．2745681670．2955872280．3966032130．3576271900．3085361800．34

2.4 柱頭可授性實驗結(jié)果

白天隨機選取北川驢蹄草花朵即將開放的柱頭，以及已開放后柱頭。采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性，實驗結(jié)果表明(圖4)，北川驢蹄草的柱頭在開而未開放3h內(nèi)已具有可授性，柱頭可授性增長緩慢，3h后花朵開放后柱頭活性增勢最大，7 h～8 h柱頭的可授性明顯趨于降低，但仍具有活性。

圖4 8 h內(nèi)(白晝)北川驢蹄草柱頭活力變化Fig.5 Changes of stigma vigor of Beichuan Caltha in 8 hours(daytime)

3 結(jié)論與討論

北川驢蹄草單花花期為2 d，4月～5月開花，群體花期約60 d，全體盛花花期約25 d，集中在4月15日～5月10日，單株花期10 d～15 d，單花花期2 d。雄蕊短于雌蕊，花藥緊貼花柱外側(cè)，花藥與柱頭相距約3 mm，在整個花朵開放的過程中雌蕊和雄蕊的相對位置不變。北川驢蹄草開花后花粉在8 h內(nèi)活力一致呈上升趨勢，并有繼續(xù)上升的趨勢，花粉活力在早上明顯低于下午?；ǚ勖劝l(fā)情況及萌發(fā)率和TTC法花粉活力測定結(jié)果較為一致。

研究結(jié)果表明北川驢蹄草在花開而未開放3h內(nèi)已具有可授性，其可授性增長緩慢，3 h后花朵開放以后柱頭活性增勢最大，7 h～8 h柱頭的可授性明顯趨于降低，但仍具有活性。植物有多種方式促進異交,其中雌雄異株和自交不親和是專性遠交機制,而其他機制由于具有一定程度的雌性和雄性重疊,因而存在或多或少的自交比例。盡管雌雄同株不能完全避免自交,但趨向遠交,或促進遠交[9～11]。本實驗中根據(jù)柱頭周圍出現(xiàn)氣泡的快慢、大小和數(shù)量來比較劃分柱頭可授性的強弱等級，存在一定的人為因素誤差[12]。本文僅對北川驢蹄草的柱頭活性大小進行簡單研究，未開展套袋實驗，下一步將對其繁育系統(tǒng)開展細致研究。

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Pollen Viability,Stigma Receptivity and Floral Characteristics

Study ofCalthadysosmoidesBIE Peng-fei1XIE Huan-huan1HU Jin-yao1,2*ZHU Yun-dong3

(1.Mianyang Normal University,Mianyang 621000; 2.Mianyang Shu Chuang Agricultural Science and Technology Co.Ltd,Mianyang 621000; 3.Beichuan Forestry Bureau,Beichuan 622750，China)

Calthadysosmoidesis a newly named species in 2016 (specific to Sichuan ).For the protection and use of this new species,the urgent need is to study their reproductive biology.In this paper,50 strains were selected from different populations to observe their floral characteristics,pollen viability and stigma receptivity.The pollen viability was measured by TTC method,and the pollen culture ofCalthawas cultured in liquid medium,and the stigma receptivity was determined by benzidine hydrogen peroxide (until it was inactive).The results of the investigation showed that under natural conditions,theCalthabloomed from April to May,and the flowering period of one flower is generally 2 days.Stamens were shorter than pistil; Anthers were close to the outer side of the stilus with a distance of about 3 mm; In the whole process of flower opening,the relative position of the pistil and stamen were invariant; In the morning,pollen viability was significantly lower than in the afternoon,and increased rapidly in 1～4 hours after anthesis,after 4 hours,the pollen activity increased slowly.The stigma could be granted,and it would be relatively strong at 3 hours after anthesis.

CalthadysosmoidesTao Zhang et al,Floral characteristics,Pollen viability,Pollen germination,Stigma receptivity

2017-01-03

國家自然科學(xué)基金項目(31170319)；片口保護區(qū)2014年省級財政林業(yè)自然保護區(qū)建設(shè)項目(2015))29號。

別鵬飛(1990-)，男，碩士研究生，綿陽師范學(xué)院環(huán)境工程專業(yè)。

胡進耀(1978-)，男，教授，研究方向：生態(tài)系統(tǒng)安全保護與維護。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.02.003

S722.8

A

1003-5508(2017)02-0013-04